專利名稱：一種定量檢測微量循環(huán)dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)學檢驗領(lǐng)域，涉及血清學檢測技術(shù)，具體涉及一種基于熒光染料的微量循環(huán)DNA的定量檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病，在我國已占各類死亡原因的第二位。腫瘤的早期診斷和治療，是提高治愈率的關(guān)鍵。近年研究表明，腫瘤在生長過程中，能持續(xù)釋放腫瘤細胞DNA進入外周血液，故患者循環(huán)DNA含量可高于正常，且具有腫瘤特異性的分子遺傳改變。循環(huán)DNA即存在于外周循環(huán)血清/血漿中的游離DNA。循環(huán)DNA的水平可反映腫瘤的存在和嚴重程度，并有望成為新的廣譜腫瘤分子標志物。
正常人循環(huán)DNA的含量極微弱，每毫升僅為納克水平，已超出溴化乙錠(EB)染色和OD260檢測等實驗室常用的DNA定量方法的敏感性范圍。目前實驗室常用的EB染色法的敏感性比熒光染料法低一個數(shù)量級，且EB具有劇毒，操作需要十分小心，不適于大范圍推廣；而OD260檢測則需將待測樣品倒入比色杯，體積至少需達到100μl，故無法檢測微量DNA，而且樣品容易受到污染，無法繼續(xù)進一步的實驗研究。國外多采用放射免疫法、熒光分光光度法、定量PCR法和DipstickTM試劑盒等進行血清DNA的定量研究。但由于放射免疫法涉及同位素且操作復雜，目前已基本淘汰；熒光分光光度儀和定量PCR儀的價格都在10萬元以上，對于一些小型的科研機構(gòu)和臨床檢驗部門來說過于昂貴；而美國Invitrogen公司生產(chǎn)的DipstickTM試劑盒50人份的價格在3000元左右，如果推廣，價格難以接受，這在很大程度上限制了我國同類研究的開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、敏感的定量檢測微量循環(huán)DNA的方法。
本發(fā)明通過染料與純化的DNA結(jié)合后所產(chǎn)生的熒光強度分析，定量出外周血中游離DNA的含量。本發(fā)明在不增加實驗室現(xiàn)有設備的前提下，對血清/血漿進行分離、保存后，抽提其中游離DNA，與熒光染料混勻反應，置紫外投射儀中數(shù)碼成像，分析熒光信號密度定量，計算血清/血漿中的游離DNA的水平，建立了一種基于熒光的DNA染色定量檢測方法。
本發(fā)明方法通過下述方法和步驟進行，1.血清/血漿分離、保存，取外周靜脈血，置試管或抗凝管中，室溫靜置，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心。取上層血清再離心，吸上層血清，直接檢測或低溫保存至使用。
2.抽提游離DNA，采用“微量血液基因組抽提試劑盒”(上海華舜生物工程有限公司)抽提血清DNA。取血清，加2倍體積的裂解液DL以及蛋白酶K，混勻后置65℃水浴消化，加入2倍血清/血漿體積的異丙醇，混勻后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心，使液體通過試劑盒的吸附柱后，柱中加入緩沖液W1，靜置，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心棄液體。重復W1液洗柱，棄去液體，再離心。收集純化的DNA，直接檢測或低溫保存至使用。
3.DNA定量取上述純化的血清/血漿DNA，與稀釋的熒光染料SYBR GreenI(美國Molecular Probes公司)混勻后點樣于透明薄膜上反應，置于紫外投射儀中數(shù)碼成像(FR-200紫外與可見分析裝置，上海復日科技有限公司)，用SMART VIEW分析軟件對熒光信號進行密度定量，通過標準曲線計算出樣品中的DNA含量，并換算出每毫升血清/血漿中的游離DNA的水平。
本發(fā)明方法能精確檢測到低至2ng的微量DNA，而且所用儀器使用普遍且方便，所用試劑價格較便宜。配合高效DNA抽提試劑盒，即能快速、敏感地測出受試人員的循環(huán)DNA水平，為惡性腫瘤早期診斷和療效隨訪提供實驗室檢測依據(jù)。
應用本發(fā)明，對150例健康人員和533例各類腫瘤患者的血清DNA進行了定量檢測。結(jié)果150名健康人員的平均濃度為22.2ng/ml，與國外放免法、定量PCR法和DipstickTM試劑盒檢測結(jié)果相一致。而483例惡性腫瘤患者血清標本平均DNA含量為81.3ng/ml。除食管癌以外，其余9類惡性腫瘤患者的血清DNA均顯著高于健康對照(P＜0.05)。血清DNA增高以肝癌患者最為顯著，平均達155.7ng/ml，超出正常值95％上限(37ng/ml)者高達84.6％(44/52)；其次為結(jié)直腸癌和胃癌，平均水平分別為119.2ng/ml和80.1ng/ml。在50例包括子宮肌瘤、甲狀腺腺瘤和乳腺腺瘤等良性腫瘤患者中，血清DNA平均水平未見顯著增高(P＞0.05)。
本發(fā)明以定量檢測循環(huán)DNA為目標，具有快速、簡便、敏感、精確的特點，適用于大規(guī)模腫瘤高危人群篩查、腫瘤的早期診斷以及療效預后的動態(tài)觀察，為腫瘤的實驗室診斷提供又一新的聯(lián)合檢測指標。


圖1是各類惡性腫瘤患者血清DNA水平，圖2是標準量DNA的SYBR Green I熒光染色，圖3是DNA含量與熒光強度的相關(guān)性曲線，圖4是肝癌患者血清DNA含量檢測結(jié)果。
具體實施例方式
實施例11，血清/血漿分離、保存，取2ml～3ml外周靜脈血，置試管或抗凝管中，10℃～20℃靜置4小時，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。取上層血清再次以同樣轉(zhuǎn)速離心10分鐘，吸取上層血清，獲完全無血細胞成分的血清或血漿，直接用于檢測或于-70℃保存至使用。
2，抽提血清/血漿中游離DNA，以“微量血液基因組抽提試劑盒”(上海華舜生物工程有限公司)抽提血清DNA。取血清500μl～1000μl，加入2倍體積的裂解液DL以及蛋白酶K，終濃度為100μg/ml～150μg/ml，充分混勻后置65℃水浴中消化15分鐘～1小時，期間來回顛倒混勻數(shù)次，直至液體清亮而且不粘稠。再加入2倍血清/血漿體積的異丙醇，顛倒混勻后分數(shù)次以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心，使所有液體均通過試劑盒自帶的吸附柱，丟棄離心下來的液體。然后在柱中加入500μl緩沖液W1，靜置1分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心棄液體。重復以500μl W1液洗柱一次，棄去液體，然后以同樣速度離心1分鐘。最后給柱子換新的離心管，加入25μl～40μl H2O，65℃水浴靜置5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心洗脫DNA，收集離心下來的液體，即純化好的DNA，可直接用于檢測或-20℃保存至使用。
3.DNA定量取10μl已經(jīng)純化的血清/血漿DNA，與10μl 1∶3000稀釋(以無菌的三蒸水稀釋)的熒光染料SYBR Green I(美國Molecular Probes公司)混勻后點樣于透明薄膜上，反應1分鐘后置于紫外投射儀中，在激發(fā)光波長312nm，吸收光波長cutoff值500nm的條件下數(shù)碼成像(FR-200紫外與可見分析裝置，上海復日科技有限公司)，以SMART VIEW分析軟件對熒光信號進行密度定量，通過標準曲線計算出樣品中的DNA含量，并換算出每毫升血清/血漿中的游離DNA的水平。
實施例2 制訂標準曲線精確吸取熒光染料SYBR Green I(美國Molecular Probes公司)1μl，加入無菌的三蒸水3000μl，混勻作1∶3000稀釋備用。取已知濃度為10ng/μl的質(zhì)粒DNA(標準量DNA來源于美國Invitrogen公司DipstickTM試劑盒)，稀釋5倍至濃度為2ng/μl備用。取出復日科技有限公司紫外與可見分析裝置的紫外透射板，鋪一塊透明薄膜，在膜中央點樣。第一點加10μl三蒸水，第二點加2ng/μl的DNA 1μl和9μl三蒸水，第三點加2ng/μl的DNA 2μl和8μl三蒸水，第四點加2ng/μl的DNA 3μl和7μl三蒸水，以此類推，直到第八點加2ng/μl的DNA 7μl和3μl三蒸水。上述八個點的DNA含量分別為0、2、4、6、8、10、12、14ng。然后每點加入10μl稀釋的SYBR Green I，充分混勻，靜置1分鐘后置于紫外投射儀中以紫外燈照射，最佳效果拍攝所產(chǎn)生的熒光信號，結(jié)果SYBR Green I染色法至少能精確檢測出低至2ng的微量DNA(圖2)。并以復日公司的SMARTVIEW圖像分析軟件密度定量所產(chǎn)生的熒光信號，可見在2ng～10ng的范圍內(nèi)，DNA含量與熒光強度呈明確的線性關(guān)系，Spearman’s等級相關(guān)分析得其相關(guān)系數(shù)為0.9972(圖3)。
實施例3 肝癌患者血清DNA的抽提和定量取5名肝癌患者外周血2ml，室溫20℃靜置4小時，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸取上層血清后再離心，共獲700μl血清。取血清500μl，加入裂解液DL 1000μl及20mg/ml的蛋白酶K 11.5μl(終濃度為150μg/ml)，混勻后置65℃水浴中消化15分鐘～1小時，期間顛倒混勻數(shù)次，至液體清亮且不粘稠。取出樣品，加入1000μl的異丙醇，顛倒混勻后分數(shù)次12000轉(zhuǎn)/分鐘離心，使液體通過試劑盒自帶的吸附柱，丟棄離心下來的液體。在柱中加入500μl緩沖液W1，靜置1分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30秒棄去液體。重復500μl W1液洗柱，棄去液體，同樣速度離心1分鐘。最后給柱子換新的離心管，加入40μl無菌的三蒸水，65℃水浴靜置5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心洗脫DNA，收集離心下來的液體，即純化好的DNA，可直接用于檢測或-20℃保存至使用。取上述純化好的DNA 10μl與1∶3000稀釋好的SYBR Green I 10μl點樣于透明薄膜上充分混勻，反應1min后置于紫外投射儀中以紫外燈照射，最佳效果拍攝所產(chǎn)生的熒光信號。結(jié)果如圖4所示，所有5份待測標本均出現(xiàn)陽性信號。各點以復日公司的SMART VIEW圖像分析軟件密度定量所產(chǎn)生的熒光信號，對照標準曲線計算出樣品中的DNA含量分別為1.7ng、7.1ng、0.3ng、16.7ng、9.7ng，根據(jù)比例關(guān)系換算成對應病人每毫升血清中含13.6ng、56.8ng、2.4ng、133.6ng、77.6ng游離DNA。
權(quán)利要求
1.一種定量檢測微量循環(huán)DNA的方法，其特征是基于熒光的DNA染色定量檢測方法，包括下述步驟，(1)分離、保存血清/血漿，取外周靜脈血，置試管或抗凝管中，室溫靜置，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心，取上層血清再離心，吸上層血清，直接檢測或低溫保存至使用；(2)抽提血清/血漿中游離DNA，取血清，加2倍體積裂解液DL及蛋白酶K，混勻后置65℃水浴消化，加2倍血清/血漿體積的異丙醇，混勻后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心，使液體通過試劑盒的吸附柱后，柱中加入緩沖液W1，靜置，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心棄液體，重復W1液洗柱，棄去液體，再離心，收集純化的DNA；(3)取上述純化DNA與熒光染料混勻點樣于透明薄膜上反應，置紫外投射儀中數(shù)碼成像，用SMART VIEW分析軟件對熒光信號密度定量，制訂標準曲線，計算血清/血漿中的游離DNA的水平。
2.按權(quán)利要求1所述的定量檢測微量循環(huán)DNA的方法，其特征是其中步驟(3)所述的熒光染料是以無菌三蒸水稀釋1∶3000稀釋熒光染料，所述紫外投射儀的激發(fā)光波長為312nm，吸收光波長cutoff值為500nm。
全文摘要
本發(fā)明屬血清學檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光染料的微量循環(huán)DNA的定量檢測技術(shù)。本發(fā)明通過染料與純化的DNA結(jié)合后所產(chǎn)生的熒光強度分析，定量出外周血中游離DNA的含量。本發(fā)明可精確檢測到低至納克水平的微量循環(huán)DNA，具有快速、簡便、敏感、精確的特點。通過對一定人群和腫瘤患者循環(huán)DNA的測定，驗證了本發(fā)明具備了較高的可靠性、靈敏性和準確性。本發(fā)明可用于大規(guī)模腫瘤高危人群篩查、腫瘤的早期診斷以及療效預后的動態(tài)觀察。
文檔編號C12Q1/68GK1560277SQ200410016779
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日
發(fā)明者高海峰, 屠紅 申請人:復旦大學