專利名稱：一種成體干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種新的細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和用途，更具體地說(shuō)涉及一種成體干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和用途。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一種未分化細(xì)胞，有兩個(gè)基本特性，一是具有自我復(fù)制能力，二是能分化成一種以上的功能細(xì)胞。根據(jù)分化潛能的大小，干細(xì)胞一般分成三類。第一類是全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)，即受精卵在受精后的第1小時(shí)內(nèi)，能分裂為功能一致的全能細(xì)胞，將其中的任一細(xì)胞置于女性子宮內(nèi)均可發(fā)育為胎兒；第二類是胚胎干細(xì)胞(Embryonic stemcell)，它具有廣泛的分化潛能，能生成除胎盤(pán)外的機(jī)體所有的組織細(xì)胞；第三類是成體干細(xì)胞(adult stem cells)，是一種具有終生自我復(fù)制(identical copies)或自我更新(self-renewal)能力的未分化細(xì)胞，它分布于不同的組織，并可演變成為各種類型的組織細(xì)胞。
成體干細(xì)胞是人體自身的多潛能干細(xì)胞(Pluripotent stem cells，簡(jiǎn)稱PSC)，是具有相同或相似的細(xì)胞表型、多系分化能力的亞全能干細(xì)胞群體，存留在多種組織中并能夠分離出來(lái)，而且在適合的微環(huán)境(nich)下能分化產(chǎn)生具有特定形態(tài)和功能的細(xì)胞(特化細(xì)胞)，實(shí)現(xiàn)跨系統(tǒng)分化，即能夠分化成多種組織細(xì)胞，例如，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，簡(jiǎn)稱MSC)、外周血單核細(xì)胞(Monocytes)來(lái)源的PSC等。所謂微環(huán)境是指存在于干細(xì)胞所處的細(xì)胞基質(zhì)中，對(duì)干細(xì)胞命運(yùn)(是增殖還是分化)起調(diào)控作用的各種信號(hào)分子(生長(zhǎng)因子及其受體、激素及介導(dǎo)分子)的總稱(Watt FM，Hogana-Brigid LM.A bipotential precursorpopulation for pancreas and liver within the embryonic endoderm.Science，2000，128871～811)。例如，MSC具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺基質(zhì)細(xì)胞等組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力(Goodell MA，Jackson KA，Majika SM，et al.Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.Ann NY Acad Sci，2001，938208和Almeida-Porada G，Zanjani ED，Adult stem cell plasticity and methods of detection.RevClin Exp Hematol，2001，526)，肌組織衛(wèi)星細(xì)胞能在特定的環(huán)境下造血，神經(jīng)干細(xì)胞能分化為肝、血液和骨骼肌等多種組織。但是，成體干細(xì)胞在分化為特化細(xì)胞之前常產(chǎn)生一種或幾種祖細(xì)胞，然后由祖細(xì)胞再分化產(chǎn)生特化細(xì)胞。
與胚胎干細(xì)胞相比較(表1)，成體干細(xì)胞具有三個(gè)明顯特點(diǎn)。一是成體干細(xì)胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新、創(chuàng)傷修復(fù)及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究表明，每10,000～15,000個(gè)骨髓細(xì)胞中只有一個(gè)造血干細(xì)胞(Weissman IL Stem cellsunits of development，Units ofregeneration and units in evolution.Cell，2000，1000157～168)，例如人和動(dòng)物皮膚中的干細(xì)胞含量?jī)H為7％～8％(Tani H，Morris RJ，Kaur P.Enrichment for murine keratinoytestem cells on cell surface phenotype，Proc Natl Acad Sci USA.2000，97(20)10960)，Reynolds等的實(shí)驗(yàn)(Reynolds BA，Weiss RS.Generation of neurons and astrocytes form isolated cells ofthe adult mammalian central nervous system.Science，19922551707～1710)證明成體哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的干細(xì)胞數(shù)量極少，僅占室下帶區(qū)中相對(duì)靜止數(shù)的0.1％～1％。二是成體干細(xì)胞常以特定的微環(huán)境為居住環(huán)境，其生物學(xué)特性受微環(huán)境的影響與制約，成體干細(xì)胞是自我復(fù)制還是分化為功能細(xì)胞，取決于所在的微環(huán)境和自身的功能狀態(tài)。三是成體干細(xì)胞不像胚胎干細(xì)胞那樣有確定的來(lái)源，胚胎干細(xì)胞來(lái)源于胚泡內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)；而人們?nèi)圆荒苊鞔_了解不同組織干細(xì)胞的發(fā)源地，有學(xué)者推測(cè)，成體干細(xì)胞是胚胎發(fā)育過(guò)程中保存下來(lái)的未分化的細(xì)胞(Weissman IL Stem cellsunits of development，Units of regeneration and units inevolution.Cell，2000，1000157～168)，這提示成體干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞可能會(huì)有更多的相似性和同源性。
表1、成體干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的對(duì)比

成體干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相比較，具有其優(yōu)點(diǎn)胚胎干細(xì)胞雖具有全能性和可以建系傳代等優(yōu)點(diǎn)，從理論上看，胚胎干細(xì)胞移植是治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤疾病的有效方法之一，其應(yīng)用前景廣闊，但實(shí)際應(yīng)用是受限的。一方面是因?yàn)槊總€(gè)個(gè)體的主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex，簡(jiǎn)稱MHC)不同，同種異體胚胎干細(xì)胞及其分化組織細(xì)胞用于臨床會(huì)引起免疫排斥，因此，基于胚胎干細(xì)胞的治療方案，要求對(duì)患者長(zhǎng)期使用免疫抑制劑治療或?qū)⒒颊叩脑煅到y(tǒng)和外來(lái)細(xì)胞形成嵌合體。此外，在應(yīng)用胚胎干細(xì)胞時(shí)，還必須確認(rèn)胚胎干細(xì)胞供者沒(méi)有諸如(肌)營(yíng)養(yǎng)失調(diào)癥之類的遺傳性疾病。另一方面是因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞雖然具有高度分化能力，并能分化成各種細(xì)胞類型，但這種分化是“非定位性”的，而目前尚不能控制胚胎干細(xì)胞在特定的部位分化成相應(yīng)的細(xì)胞，臨床直接使用時(shí)易導(dǎo)致畸胎瘤，因此，在應(yīng)用胚胎干細(xì)胞治療前，必須先進(jìn)行初步的細(xì)胞誘導(dǎo)分化，以防止畸胎瘤的發(fā)生。
而成體干細(xì)胞具有類似胚胎干細(xì)胞的高度分化能力，在國(guó)內(nèi)已建立了干細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)，有學(xué)者已從肌肉、肝臟、骨髓中成功地發(fā)現(xiàn)和分離了成體干細(xì)胞群，定向誘導(dǎo)分化成多種細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，并用于臨床某些基本的治療，如骨缺損、帕杰森氏綜合征等。最近又研究發(fā)現(xiàn)，從胰腺等組織可分離出間充質(zhì)表型的成體干細(xì)胞群，具有多系分化潛能。因此，相對(duì)而言，成體干細(xì)胞不存在胚胎干細(xì)胞的上述問(wèn)題，例如骨髓移植實(shí)驗(yàn)并不引發(fā)畸胎瘤。
雖然成體干細(xì)胞如骨髓MSC和外周血單核細(xì)胞來(lái)源的PSC在自身的移植過(guò)程中不存在排斥反應(yīng)的問(wèn)題，但是骨髓的抽取勢(shì)必造成組織損傷和病人的痛苦，而且其含量非常低，105～106個(gè)細(xì)胞中含有1個(gè)骨髓MSC；提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(主要包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少量的其它細(xì)胞等)來(lái)源的PSC時(shí)，用血量較大，一般在500ml左右，對(duì)于多數(shù)患者顯然是不可行的；更重要的是，不管是骨髓MSC，還是外周血單核細(xì)胞來(lái)源的PSC，分離純化時(shí)間均較長(zhǎng)(21～24天)，對(duì)于急需PSC治療的患者，如果使用自身的骨髓或外周血，更是無(wú)法實(shí)現(xiàn)。所以，盡管成體干細(xì)胞移植也是目前治療血液系統(tǒng)疾病、先天性遺傳疾病以及多發(fā)性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤疾病的有效方法之一，但其在研究與臨床治療方面的應(yīng)用還是無(wú)法滿足要求。因此，培養(yǎng)、分離和體外大量擴(kuò)增高純度的目前已有的成體干細(xì)胞或者發(fā)現(xiàn)能夠滿足上述要求的新的成體干細(xì)胞，對(duì)于其應(yīng)用就顯得非常重要。
一般而言，干細(xì)胞的鑒定主要是依賴其形態(tài)和定位加以準(zhǔn)確辨認(rèn)。例如，在果蠅的性腺和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，干細(xì)胞有明確的定位，哺乳類的肌肉干細(xì)胞即附著于肌纖維邊緣的肌衛(wèi)星細(xì)胞。但在大多數(shù)情況下，干細(xì)胞的位置并不明確，因此，還需要利用細(xì)胞的培養(yǎng)特性(如是否貼壁生長(zhǎng))、生長(zhǎng)特性(如旋渦生長(zhǎng)或融合生長(zhǎng)等)、形態(tài)學(xué)特性(如圓狀、條梭狀等)和生物學(xué)特性(如特殊化學(xué)染色、表面標(biāo)志物以及該細(xì)胞某些酶的表達(dá)等)等方法來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步鑒別該細(xì)胞是否是干細(xì)胞，而分子標(biāo)記法(即采用流式細(xì)胞儀測(cè)定干細(xì)胞上的表面標(biāo)志物)是國(guó)際上公認(rèn)的方法和手段；同時(shí)，通過(guò)定向誘導(dǎo)分化方法，驗(yàn)證該細(xì)胞是否具有多系分化能力等，來(lái)進(jìn)一步證實(shí)該細(xì)胞是否是成體干細(xì)胞。
有關(guān)干細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)試劑(也稱培養(yǎng)基或培養(yǎng)液)，目前主要有來(lái)自于美國(guó)Stemcell公司的MesencultTM培養(yǎng)試劑(是間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的專用試劑，間質(zhì)干細(xì)胞即Mesenchymal stem cells，簡(jiǎn)稱MSC)、美國(guó)GIBICO公司的高糖DMEM(即H-DMEM)培養(yǎng)試劑、低糖DMEM(即L-DMEM)培養(yǎng)試劑、α-MEM培養(yǎng)試劑、F12培養(yǎng)試劑和RPMI 1640培養(yǎng)試劑等。文獻(xiàn)報(bào)道，骨髓MSC多用L-DMEM培養(yǎng)試劑培養(yǎng)，臍血MSC使用MesencultTM培養(yǎng)試劑或α-MEM培養(yǎng)試劑培養(yǎng)，成人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的PSC使用的培養(yǎng)試劑是RPMI 1640培養(yǎng)試劑。
干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法可分為三種①有明確定位的干細(xì)胞，往往具有獨(dú)特的生長(zhǎng)方式，可以直接取其用于研究，或取其聚集區(qū)在培養(yǎng)試劑中進(jìn)行體外培養(yǎng)后再進(jìn)行分離、純化和擴(kuò)增培養(yǎng)。例如，骨髓中存在造血干細(xì)胞和骨髓MSC兩種干細(xì)胞，在骨髓的體外培養(yǎng)中，造血干細(xì)胞和骨髓呈懸浮集落生長(zhǎng)，而骨髓MSC則貼壁生長(zhǎng)，這兩種干細(xì)胞就很容易進(jìn)行區(qū)分，而且也很容易通過(guò)更換培養(yǎng)試劑把兩者分開(kāi)，去掉懸浮生長(zhǎng)的造血干細(xì)胞和骨髓；貼壁的骨髓MSC則留下，加入培養(yǎng)試劑進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。②有分子標(biāo)記的干細(xì)胞，如外周血干細(xì)胞具有表面特異抗原，一般利用帶有標(biāo)記的抗體與之結(jié)合，然后用流式細(xì)胞儀(FACS)、磁珠分選儀(MACS)等分選設(shè)備進(jìn)行分選，然后在培養(yǎng)試劑中進(jìn)行體外培養(yǎng)，再用于治療血液病或作進(jìn)一步研究。③未發(fā)現(xiàn)有特異分子標(biāo)記的干細(xì)胞，可利用條件培養(yǎng)試劑篩選。例如，神經(jīng)干細(xì)胞需要在低血清、成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)及轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子β(TGFβ)等多種因子存在的培養(yǎng)試劑中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)才能生長(zhǎng)，而大部分細(xì)胞對(duì)血清是依賴的，長(zhǎng)期的培養(yǎng)結(jié)果使大部分的其他細(xì)胞死亡，而神經(jīng)干細(xì)胞則得到了純化和擴(kuò)增。
目前已報(bào)道的用于血液或骨髓來(lái)源成體干細(xì)胞的基本分離方法包括如下四個(gè)步驟①使用常規(guī)方法，分離出單個(gè)核細(xì)胞；②將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋，得細(xì)胞溶液；③將該細(xì)胞溶液接種到含有培養(yǎng)試劑的器皿中，進(jìn)行培養(yǎng)；④棄去未貼壁的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到一定程度的融合時(shí)，消化傳代。
下面是有關(guān)血液或骨髓來(lái)源的成體干細(xì)胞的分離方法的具體操作骨髓或外周血MSC的分離與純化骨髓或外周血用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液如Ficoll分離液或Percoll分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞；先用含有10～20％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)試劑將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋，得到細(xì)胞溶液，然后將該溶液接種到塑料培養(yǎng)器皿中，接種濃度為1×106個(gè)/cm2；繼續(xù)培養(yǎng)5～7天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，更換新的完全培養(yǎng)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)，消化傳代。
臍血MSC的分離與純化臍血用PBS稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液如Ficoll分離液或Percoll分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞；先用含有10～20％小牛血清的α-MEM培養(yǎng)試劑或MesencultTM培養(yǎng)試劑進(jìn)行稀釋，得到細(xì)胞溶液，然后將該溶液接種到塑料培養(yǎng)器皿中，接種濃度為1×106個(gè)/cm2；繼續(xù)培養(yǎng)5～7天后，棄去未貼壁的細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞；待細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)，消化傳代。
外周血單核細(xì)胞來(lái)源的PSC的分離與純化取500ml外周血，利用選擇粘附程序分離得到單個(gè)核細(xì)胞；用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)試劑將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋，得到細(xì)胞溶液，將該細(xì)胞溶液接種到15cm培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種2×107～3×107個(gè)細(xì)胞；將培養(yǎng)瓶在37℃、8％CO2條件下培養(yǎng)8～12h，先棄去未貼壁的細(xì)胞，然后將貼壁細(xì)胞重懸，接種到8孔培養(yǎng)板中，5～7天換半液繼續(xù)培養(yǎng)。
由于臍血中的細(xì)胞成分一部分來(lái)源于新生兒機(jī)體，一部分來(lái)源于胎盤(pán)組織，其早期細(xì)胞含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成人外周血，因此理論上除已報(bào)道的CD34+造血干細(xì)胞和MSC外，應(yīng)該還存在其它的成體干細(xì)胞，只是用目前所報(bào)道的方法不易培養(yǎng)。如果通過(guò)改變目前所使用的試劑及方法，在臍血中發(fā)現(xiàn)、分離出新的成體干細(xì)胞將變得更為可能。
迄今為止，尚未見(jiàn)新的有關(guān)來(lái)源于血液的新的成體干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和用途等方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種新的成體干細(xì)胞，目的之二是提供該成體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，目的之三是提供該成體干細(xì)胞的用途。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思如下1.細(xì)胞作為有機(jī)體的最小組成單位，在其生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中需要必須的營(yíng)養(yǎng)成分如氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽以及某些細(xì)胞因子等，不同的細(xì)胞對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)成分的需求也不盡相同。目前常用的細(xì)胞培養(yǎng)試劑(如L-DMEM培養(yǎng)試劑、α-MEM培養(yǎng)試劑或RPMI 1640培養(yǎng)試劑等)的營(yíng)養(yǎng)成分能夠滿足絕大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，但對(duì)于某些細(xì)胞來(lái)講，其中某些營(yíng)養(yǎng)成分有可能不足甚至缺乏。如果調(diào)整(增加或補(bǔ)加)細(xì)胞培養(yǎng)試劑的某些基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分，就有可能發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)出新的細(xì)胞。
2.常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)是采用等滲的培養(yǎng)試劑，在原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中往往幾種細(xì)胞同時(shí)增長(zhǎng)，不易獲得較純的目的細(xì)胞。研究表明，滲透壓的改變可導(dǎo)致細(xì)胞容積的改變，激活細(xì)胞膜上的離子通道(Robert W，Wei G，Scott H.Blocking swelling-activated chloride currentinhibits mouse liver cell proliferation.J Physio 2001，532661和Shen MR，Droogmans G，Eggmont J，et al.Differential expression of volume-regulated anion channel during cell cycleprogression of human cervical cancer cells.J Physio.2000，529385)，這些改變與細(xì)胞增殖的調(diào)控密切相關(guān)。對(duì)造血干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，滲透壓對(duì)集落形成細(xì)胞有影響，當(dāng)滲透壓低于正常的17％或高于正常的23％時(shí)對(duì)集落的形成明顯的影響，并提示低滲透壓對(duì)造血細(xì)胞體外培養(yǎng)更有害(張孝兵等，影響臍血造血細(xì)胞體外培養(yǎng)與檢測(cè)的因素，華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)1999，2532)。因此，如果改變培養(yǎng)試劑的滲透壓，就有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)一些細(xì)胞增殖，而抑制另外一些細(xì)胞的生長(zhǎng)或促進(jìn)其凋亡，從而達(dá)到篩選細(xì)胞的目的。
3.血液或骨髓貼壁細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)多選用一次貼壁的方法，即單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)4～7天后，棄去懸浮的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞。這對(duì)于培養(yǎng)貼壁干細(xì)胞是不利的，因?yàn)楦杉?xì)胞的早期階段(前體干細(xì)胞)可能還不具備某些生物學(xué)特性，如貼壁特性、形態(tài)學(xué)特性等，只有隨著細(xì)胞的逐漸成熟，這些特性才能逐步表現(xiàn)出來(lái)。單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)4～7天時(shí)，貼壁的細(xì)胞少部分為較早期的細(xì)胞如干細(xì)胞或未成熟的細(xì)胞，而絕大多數(shù)為成熟的單核細(xì)胞，如果此時(shí)將未貼壁的細(xì)胞棄去，勢(shì)必將大量的干細(xì)胞丟失，造成的結(jié)果是干細(xì)胞的獲得率低或培養(yǎng)不出干細(xì)胞。如果此時(shí)將未貼壁的細(xì)胞移種到新的培養(yǎng)器皿中繼續(xù)培養(yǎng)，就有可能利于表現(xiàn)出貼壁特性的干細(xì)胞的貼壁，并篩掉貼壁的成熟的單核細(xì)胞，最終獲得大量高純度的干細(xì)胞。
4.由于蛋白質(zhì)分子量巨大難以進(jìn)入細(xì)胞，只能作用于細(xì)胞表面分子而發(fā)生作用；而且基因治療有依賴病毒序列作為基因載體的弊病，因此限制了“分子治療”的應(yīng)用。如何克服這些弊病，改進(jìn)技術(shù)，是分子治療領(lǐng)域的主要課題之一。干細(xì)胞生物工程是指在體外對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行操作，包括體外增殖、定向誘導(dǎo)、橫向分化、基因修飾和組織成形等。而干細(xì)胞生物工程是改造“分子治療”的最佳選擇一是成體干細(xì)胞具有自我擴(kuò)增和分化功能，因此導(dǎo)入的“外源基因”可以有效地得以擴(kuò)散；二是成體干細(xì)胞可以在體外進(jìn)行操作，對(duì)基因的改造和修飾可以在體外完成并經(jīng)篩選后再導(dǎo)入體內(nèi)，避免由于基因插入而導(dǎo)致的細(xì)胞失常；三是成體干細(xì)胞是人體細(xì)胞，作為載體其毒性最小，而且作為生命的最小單元，是導(dǎo)入組織的最佳形式。干細(xì)胞生物工程能為多種“不治之癥”帶來(lái)福音，具有極大的應(yīng)用前景和產(chǎn)業(yè)化潛能。所以，如果我們能夠找到一種合適的成體干細(xì)胞，能夠體外定向誘導(dǎo)分化、體外高度純化和體外大量、高速擴(kuò)增，那么該成體干細(xì)胞將為臨床應(yīng)用提供了新的重要的藥物來(lái)源。
為便于敘述，將新配制的培養(yǎng)試劑暫定名Potentculture培養(yǎng)試劑，將改進(jìn)的培養(yǎng)方法簡(jiǎn)稱為先養(yǎng)后貼法，將新發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞即來(lái)源于血液(如臍血或成人外周血等)的新的成體干細(xì)胞CD34-CD45+多潛能干細(xì)胞(Umbilical cord blood or peripheral blood CD34-CD45+Pluripotent stem cells)，簡(jiǎn)稱為PSC3445。
本發(fā)明對(duì)前三項(xiàng)構(gòu)思進(jìn)行了逐一研究和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，改進(jìn)的主要內(nèi)容是(1)調(diào)整現(xiàn)有培養(yǎng)試劑的組分和含量，配制新的培養(yǎng)試劑。一是添加某些缺少的營(yíng)養(yǎng)成分，如某些氨基酸、維生素或核苷酸等；二是在培養(yǎng)細(xì)胞必需的營(yíng)養(yǎng)成分基礎(chǔ)上，再適當(dāng)增加其含量；三是通過(guò)提高某些成分的含量，來(lái)提高培養(yǎng)試劑的滲透壓，例如增加無(wú)機(jī)鹽等的含量，可高出正常值的60％。
(2)改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)方法，采用先養(yǎng)后貼法。主要包括兩個(gè)步驟①將單個(gè)核細(xì)胞在Potentculture培養(yǎng)試劑中培養(yǎng)數(shù)天，棄去貼壁的細(xì)胞，將未貼壁的細(xì)胞(即懸浮細(xì)胞)移種到另一培養(yǎng)器皿中再培養(yǎng)數(shù)天；②棄去未貼壁的懸浮細(xì)胞，更換Potentculture培養(yǎng)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)留下的貼壁細(xì)胞數(shù)天，即得被篩選的目的細(xì)胞。
但是，為了篩選出大量擴(kuò)增的、高純度的目的細(xì)胞，則需改進(jìn)該培養(yǎng)方法，即步驟①與上述內(nèi)容相同，改進(jìn)步驟②，增加步驟③，具體操作是②保留未貼壁的懸浮細(xì)胞，將其移種到另一培養(yǎng)器皿中，使用Potentculture培養(yǎng)試劑再繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)天；同時(shí)，更換Potentculture培養(yǎng)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞數(shù)天，且每培養(yǎng)數(shù)天更換一次Potentculture培養(yǎng)試劑，或者在更換培養(yǎng)試劑進(jìn)行培養(yǎng)數(shù)天后換半液繼續(xù)培養(yǎng)，使其繼續(xù)增殖；③對(duì)未貼壁的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)所得到的細(xì)胞溶液再進(jìn)行分開(kāi)培養(yǎng)，如此重復(fù)多次，即獲得大量擴(kuò)增的、高純度的被篩選的目的細(xì)胞。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果均證實(shí)了本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是正確的，并得到了一種新的成體干細(xì)胞。下面，首先介紹研究和發(fā)現(xiàn)該新的成體干細(xì)胞PSC3445所使用的Potentculture培養(yǎng)試劑。
(一)Potentculture培養(yǎng)試劑我們這里所述的Potentculture培養(yǎng)試劑是指Potentculture完全培養(yǎng)試劑，即其包括Potentculture基礎(chǔ)培養(yǎng)試劑、血漿或血清類組分等，其中的Potentculture基礎(chǔ)培養(yǎng)試劑包括氨基酸類、無(wú)機(jī)鹽類、核酸類、葡萄糖和其它成分等。
1000ml的Potentculture基礎(chǔ)培養(yǎng)試劑主要包括1400～1800mg氨基酸類、10000～15000mg無(wú)機(jī)鹽、30～60mg維生素及脂類、40～70mg核酸類、800～1500mg葡萄糖和120～170mg其它成分，各組分分別優(yōu)選1682.9mg、12479.9mg、54.7mg、48mg、3350mg和147.1mg。與1000ml的Potentculture基礎(chǔ)培養(yǎng)試劑配套使用的血漿或血清類組分是指200～600ml的血漿或血漿和血清的混合物，優(yōu)選使用400ml的血漿，或300ml血漿和100ml血清的混合物。
(二)PSC3445是一種新的成體干細(xì)胞PSC3445的鑒定和鑒別是依據(jù)多層次和多角度的具體數(shù)據(jù)，從以下幾個(gè)方面逐步深入的，例如從細(xì)胞培養(yǎng)特性、生長(zhǎng)特性、形態(tài)學(xué)特性和生物學(xué)特性來(lái)證實(shí)該細(xì)胞是一種新的干細(xì)胞；并通過(guò)定向誘導(dǎo)分化方法，驗(yàn)證該細(xì)胞具有多系分化能力等，來(lái)進(jìn)一步證實(shí)該細(xì)胞不但是一種新的干細(xì)胞，而且是一種新的多潛能干細(xì)胞即成體干細(xì)胞。
1.PSC3445是一種尚未報(bào)道的新的干細(xì)胞①PSC3445的培養(yǎng)特性及生長(zhǎng)特性將來(lái)源于血液(如臍血)的單個(gè)核細(xì)胞加入到含有Potentculture培養(yǎng)試劑的塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)5～7d，首先貼壁的為成熟的單核細(xì)胞，其含量達(dá)96％左右(Yong Zhao.David Glesne.Eliezer Huberman.A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stemcells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003；100(5)2426-2431)，其形態(tài)主要為圓形或不規(guī)則形，棄去這類貼壁細(xì)胞；將未貼壁生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞移種到另一培養(yǎng)器皿中如24孔塑料培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)1～2d，棄去未貼壁的細(xì)胞，更換Potentculture培養(yǎng)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)留下的貼壁細(xì)胞數(shù)天，其中成纖維樣細(xì)胞即是被篩選的目的細(xì)胞，也即PSC3445(圖1)。
對(duì)該部分貼壁細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，PSC3445大量擴(kuò)增，而圓形細(xì)胞逐漸死亡；當(dāng)PSC3445增殖到一定程度，呈漩渦狀生長(zhǎng)(圖2)。但不管PSC3445的數(shù)量達(dá)到多少，并不出現(xiàn)融合現(xiàn)象(圖3)，這一點(diǎn)不同于骨髓及臍血MSC的生長(zhǎng)特性(圖4)。因此，PSC3445不同于單核細(xì)胞的形態(tài)特征，也不同于MSC的生長(zhǎng)特性，而可能是一種新的干細(xì)胞。
②投射電鏡下PSC3445的形態(tài)學(xué)特征PSC3445在投射電鏡下的特征是細(xì)胞周邊有許多纖毛(圖5)，細(xì)胞核為圓形或卵圓形，部分細(xì)胞核仁明顯(圖6)；隨著細(xì)胞的成熟，胞漿中的顆粒逐漸增大(圖7)。而同樣具有貼壁能力的血液中的單核細(xì)胞，在電鏡下其形態(tài)特征是細(xì)胞周邊無(wú)纖毛，細(xì)胞核為馬蹄形(圖8)。因此，PSC3445的形態(tài)提示，其不同于單核細(xì)胞，而可能是一種新的干細(xì)胞。
③PSC3445的表面標(biāo)志物從表2可以看出，PSC3445的表面標(biāo)志物與骨髓及血液來(lái)源的MSC或PSC的表面標(biāo)志物不完全相同，如表面標(biāo)志物HLA-DR、CD34、CD14、CD90、CD11b和CD105等均有不同，因此，PSC3445不同于目前所報(bào)道的MSC或PSC，而可能是一種新的干細(xì)胞。
表2、PSC3445與骨髓、外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的PSC及MSC部分表面標(biāo)志比較

表2中的HLA-DR、CD3、CD14、CD11b、CD29、CD34、CD45、CD90、CD105均為細(xì)胞的表面標(biāo)志物，其中對(duì)應(yīng)的“+”和“-”分別表示相應(yīng)的細(xì)胞在此表面標(biāo)志物測(cè)定上的“陽(yáng)性”和“陰性”，即“有”和“無(wú)”；對(duì)應(yīng)的空白處則表示到目前為止，還沒(méi)有對(duì)該細(xì)胞相應(yīng)的表面標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)定，也未見(jiàn)到相應(yīng)測(cè)定數(shù)據(jù)和結(jié)果的文獻(xiàn)報(bào)道。
表2中外周血PSC的結(jié)果來(lái)自Yong Zhao.David Glesne.Eliezer Huberman.A humanperipheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003，100(5)2426-2431。
表2中骨髓MSC的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)自Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineagepotential ofadult human mesenchymal stem cells[J].Science，1999；284(2)143-147，和CongetPA，Minguell JJ.Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymalprogenitor cell[J].J Cell Physiol，1999；181(1)，67-73，以及Deans RJ，Oseley AB.Mesenchymalstem cellsbiology and potential clinical uses[J].Exp Hematol.2000；28(8)875-84。
表2中臍血MSC的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)自Erices A，Conget P，Minguell JJ.Mesenchymalprogenitor cells in human umbilical cord blood.Br J Haematol.2000；109(1)235-42。
表面標(biāo)志物檢測(cè)的具體方法將消化的原代、擴(kuò)增一代臍血PSC、骨髓MSC，用PBS洗滌后配成1×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，每個(gè)Epp.管中加0.5ml，其中兩管為陰性對(duì)照管，分別加入鼠IgG1-FITC和IgG1-PE，其余管分別加入抗人CD34-PE、CD29-PE、CD14-PE、CD11b-PE、CD45-FITC、CD34-PE、CD3-FTIC、CD105-PE、CD166-PE、CD90-FTIC、CD33-PE、CD41-PE、CD-44FTIC、CD7-FTIC、CD61-FTIC和HLA-DR-PE。室溫孵育20min，美國(guó)BD公司Calibure流式細(xì)胞儀獲得5000～10000個(gè)細(xì)胞，cell-quest軟件分析。
細(xì)胞表面標(biāo)志測(cè)定所需要的單抗熒光標(biāo)記小鼠抗人抗體包括CD14-PE、CD11b-PE、CD45-FITC、CD34-PE、CD3-FTIC、CD105-PE、CD166-PE、CD29-PE、CD90-FTIC和HLA-DR-PE，購(gòu)自美國(guó)的BD公司和Pharmagein公司。
④PSC3445的特殊化學(xué)染色特征為進(jìn)一步驗(yàn)證與核實(shí)，本發(fā)明對(duì)PSC3445進(jìn)行特殊化學(xué)染色(表3)，并與有關(guān)可能類似的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比分析，排除相同的可能性。從表3可以看出，PSC3445特殊化學(xué)染色也不同于臍血MSC，例如酸性磷酸酶(AP)染色的結(jié)果不同，即PSC3445不同于臍血來(lái)源的MSC，可能是一種新的干細(xì)胞。
表3、臍血PSC與MSC特殊化學(xué)染色結(jié)果對(duì)照

表3中的“+”和“-”分別表示相應(yīng)的細(xì)胞在此表面標(biāo)志物測(cè)定上的“陽(yáng)性”和“陰性”；對(duì)應(yīng)的空白處則表示到目前為止，還沒(méi)有對(duì)該相應(yīng)細(xì)胞暫的此表面標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)定，也未見(jiàn)到相應(yīng)測(cè)定數(shù)據(jù)和結(jié)果的文獻(xiàn)報(bào)道。其中，油紅O(ORO)染色的結(jié)果如圖9，紅色表示陽(yáng)性結(jié)果；過(guò)氧化酶(POX)染色，如采用四甲基聯(lián)苯胺法，其結(jié)果如圖10，棕色或黑色表示陽(yáng)性結(jié)果；糖元(PAS)染色，如采用高碘酸-雪夫反應(yīng)法，其結(jié)果如圖11，紅色表示陽(yáng)性結(jié)果；堿性磷酸酶(Alk.P)染色，如采用鈣-鈷法，其結(jié)果如圖12，黑色表示陽(yáng)性結(jié)果；酸性磷酸酶(AP)染色，如采用硫化鉛法，其結(jié)果如圖13，棕黃色表示陽(yáng)性結(jié)果；瑞氏染色(Wright)的結(jié)果顯示，胞漿著深藍(lán)色，核染色質(zhì)較細(xì)致，則提示該細(xì)胞是幼稚細(xì)胞(如圖14)；神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)染色，棕黃色表示陽(yáng)性結(jié)果；蘇丹黑B(SBB)染色，黑色表示陽(yáng)性結(jié)果。
表3中臍血MSC的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)自Erices A，Conget P，Minguell JJ.Mesenchymalprogenitor cells in human umbilical cord blood.Br J Haematol.2000；109(1)235-42。
從以上的細(xì)胞培養(yǎng)特性、生長(zhǎng)特性、電鏡特性、表面標(biāo)志物以及細(xì)胞的特殊化學(xué)染色結(jié)果綜合分析，PSC3445是尚未見(jiàn)報(bào)道的一種新的干細(xì)胞。
2.PSC3445是一種新的成體干細(xì)胞干細(xì)胞是一種未分化細(xì)胞，其基本特性為一是具有自我復(fù)制能力，二是能分化為一種以上的功能細(xì)胞。成體干細(xì)胞是具有多系分化能力的亞全能干細(xì)胞群體，具有相同或相似的細(xì)胞表型；存留在多種組織中并能夠分離出來(lái)，在適合的微環(huán)境下能分化產(chǎn)生具有特定形態(tài)和功能的細(xì)胞(特化細(xì)胞)。本發(fā)明PSC3445為多潛能成體干細(xì)胞即成體干細(xì)胞，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)如下①該細(xì)胞在臍血中的含量大約為10,000～100,000個(gè)有核細(xì)胞含1～5個(gè)左右，但其具有高度自我復(fù)制能力，在新型培養(yǎng)試劑中大量增殖，75ml臍血至少可獲得5×107個(gè)細(xì)胞，傳10代以上的細(xì)胞的形態(tài)及表面標(biāo)志物不發(fā)生變化。
②該細(xì)胞至少可誘導(dǎo)分化為3種以上的不同胚層來(lái)源的細(xì)胞，該細(xì)胞經(jīng)T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑如白細(xì)胞介素2(IL-2)誘導(dǎo)后，細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示為CD3+CD4+或CD3+CD8+，提示該細(xì)胞為T(mén)淋巴細(xì)胞的兩個(gè)亞群(圖15、圖16)，經(jīng)瑞氏染色后細(xì)胞形態(tài)與外周血淋巴細(xì)胞形態(tài)相同(圖17)。
表4、LPS誘導(dǎo)后部分細(xì)胞因子的變化情況(單位ng/L)

表5、LPS誘導(dǎo)前后部分細(xì)胞標(biāo)志物的變化情況(平均熒光強(qiáng)度)

經(jīng)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑如脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后，該細(xì)胞的白細(xì)胞介素10(IL-10)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)的分泌量明顯增高(見(jiàn)表4)，且該細(xì)胞的部分細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增高(見(jiàn)表5)，提示該細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。
經(jīng)表皮細(xì)胞誘導(dǎo)劑如表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)后，免疫組化染色顯示CAM5.2、EMA、P63表達(dá)陽(yáng)性，呈棕黃色(圖18、圖19、圖20)，說(shuō)明PSC3445已分化為表皮細(xì)胞。
經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)劑如神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)后，PSC3445的細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞(圖21)，神經(jīng)烯醇化酶(NSE)染色為陽(yáng)性，即棕黃色(圖22)，說(shuō)明PSC3445無(wú)論從形態(tài)還是酶的表達(dá)方面已具備了神經(jīng)細(xì)胞的特征。
③細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果分析顯示，96％的細(xì)胞處在G0～G1期，0.2％細(xì)胞處在G2期，3.3％細(xì)胞處在S期，G2/G1為1.84(圖23)，說(shuō)明PSC3445符合成體干細(xì)胞的特征。
細(xì)胞周期檢測(cè)的具體方法取培養(yǎng)10d左右、1×106個(gè)的PSC3445，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去上清夜，加-20度預(yù)冷的75％的乙醇，固定過(guò)夜；1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，去乙醇；PBS洗滌，再加入500微升的染液(含50微克/ml的溴化丙錠、100微克/ml的RNA酶)，染30分鐘，用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)，得結(jié)果。
綜上所述，PSC3445符合成體干細(xì)胞的特征，具備多潛能性，因此，PSC3445是一種新的成體干細(xì)胞。
(三)PSC3445的培養(yǎng)方法本發(fā)明所采用的細(xì)胞培養(yǎng)方法與目前已報(bào)道的用于血液或骨髓來(lái)源成體干細(xì)胞的基本分離方法的步驟①、②、③基本相同，主要是在步驟④上進(jìn)行了多種改進(jìn)。但是，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，所使用的細(xì)胞培養(yǎng)試劑均為Potentculture培養(yǎng)試劑，與目前已報(bào)道的細(xì)胞培養(yǎng)試劑不同。下面主要就改進(jìn)的方面重點(diǎn)進(jìn)行闡述。
1、方法一，PSC3445的培養(yǎng)方法主要包括如下兩個(gè)步驟①單個(gè)核細(xì)胞的分離采用常規(guī)的細(xì)胞分離方法，但是其中使用的培養(yǎng)試劑是Potentculture培養(yǎng)試劑。即在無(wú)菌條件下采集正常新鮮血或低溫凍存血如外周血或臍血，優(yōu)選新鮮血，加抗凝試劑如肝素等進(jìn)行抗凝，離心，取白膜層；再用含血清如胎牛血清的Potentculture培養(yǎng)試劑或緩沖液如Hank’s液等疊加在單個(gè)核細(xì)胞的分離液上層進(jìn)行稀釋，再離心，取單個(gè)核細(xì)胞層洗滌備用。
②PSC3445的培養(yǎng)包括純化和擴(kuò)增培養(yǎng)兩個(gè)方面。即將單個(gè)核細(xì)胞配成一定濃度的細(xì)胞溶液，并接種到Potentculture培養(yǎng)試劑中，置于37C、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，棄去貼壁的細(xì)胞；將未貼壁的懸浮細(xì)胞移種到另一培養(yǎng)器皿如24孔板中，更換Potentculture培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)2～3天，所得的貼壁細(xì)胞中的成纖維樣細(xì)胞即是所要篩選的PSC3445。
為了提高PSC3445的純度或產(chǎn)量，還需進(jìn)一步改進(jìn)該培養(yǎng)方法一是采用反復(fù)貼壁法培養(yǎng)上述培養(yǎng)過(guò)程所得的未貼壁細(xì)胞，即將未貼壁的細(xì)胞移種到新的培養(yǎng)器皿如24孔板中，培養(yǎng)2～3天后，再將該培養(yǎng)過(guò)程中的未貼壁細(xì)胞移種到另一培養(yǎng)器皿，留下的PSC3445繼續(xù)培養(yǎng)。如此反復(fù)4～7次，可獲得更大量的、高純度的PSC3445。
二是在使用Potentculture培養(yǎng)試劑時(shí)，所用的血漿優(yōu)選使用成人外周血血漿，這樣能夠快速得到PSC3445。
三是在PSC3445的培養(yǎng)數(shù)量占培養(yǎng)面積的70～80％時(shí)，使用胰蛋白酶如含有0.1g％EDTA的0.125％胰蛋白酶消化，按12進(jìn)行傳代培養(yǎng)，這樣能夠得到更高純度的PSC3445。
該方法的優(yōu)點(diǎn)是①細(xì)胞的得率高利用該試劑及方法得到的PSC為常規(guī)分離方法(如直接或一次貼壁法)的8～12倍以上。
②得到高純度PSC的時(shí)間短該方法為15天左右，報(bào)道的時(shí)間為21～24天，比目前報(bào)道的時(shí)間縮短了4～8天，這對(duì)于治療急性病更有利。
2、方法二，PSC3445還能夠采取目前的常規(guī)方法進(jìn)行制備，具體包括如下步驟分離單個(gè)核細(xì)胞的同時(shí)，將單個(gè)核細(xì)胞配成一定濃度的細(xì)胞溶液接種到含有Potentculture培養(yǎng)試劑中，置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，棄去未貼壁細(xì)胞，更換新的Potentculture培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也能夠得到PSC3445。
(四)PSC3445的用途成體干細(xì)胞存在于多種組織，現(xiàn)已能夠從成體的不同組織中獲得成體干細(xì)胞，并且在特定的組織微環(huán)境或合適的體外培養(yǎng)條件下，成體干細(xì)胞可按預(yù)定的目標(biāo)定向分化為某種組織特異的功能細(xì)胞，如不同組織來(lái)源的成體干細(xì)胞被誘導(dǎo)成為同一功能細(xì)胞，或者是同一種成體干細(xì)胞被誘導(dǎo)成為不同培層來(lái)源的功能細(xì)胞；而且研究已證實(shí)成體干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下可以誘導(dǎo)為肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、胰島細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞等各種細(xì)胞。因此，不論何種組織器官受損都能夠使用體內(nèi)原位或異位獲得的成體干細(xì)胞進(jìn)行治療。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的PSC3445是使用新的細(xì)胞培養(yǎng)試劑Potentculture培養(yǎng)試劑和新的細(xì)胞培養(yǎng)方法先養(yǎng)后貼法得到的，研究和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已證實(shí)，PSC3445是一種新的存在于血液中的成體干細(xì)胞，性質(zhì)穩(wěn)定，成活度高，實(shí)現(xiàn)了體外高度純化和體外大量、高速擴(kuò)增，還實(shí)現(xiàn)了體外定向誘導(dǎo)分化，解決了成體干細(xì)胞實(shí)際應(yīng)用時(shí)的技術(shù)瓶頸，使PSC3445的全面推廣應(yīng)用即將成為現(xiàn)實(shí)。
目前，PSC3445主要包括四個(gè)方面的重要應(yīng)用一是用于制備修復(fù)重建時(shí)移植所用的藥物。組織器官缺損需要移植修補(bǔ)，終末器官衰竭需要移植替代，各種退行性疾病需要功能重建和細(xì)胞再生，成體干細(xì)胞及以它為基礎(chǔ)的人工細(xì)胞、組織和器官移植是解決上述問(wèn)題的最理想策略之一(Kondo T，Raff M.Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipotential CNS stem cells.Science，2000；289(5 485)1 754)。因此，PSC3445作為成體干細(xì)胞同樣能夠用于制備治療這類疾病的藥物，其移植是目前成體干細(xì)胞實(shí)際應(yīng)用的優(yōu)選方案。
二是用于制備構(gòu)建人工組織的藥物。真正意義上的人工組織是有正常結(jié)構(gòu)及功能，活性細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能的關(guān)鍵因素，成體干細(xì)胞則是構(gòu)建人體生物組織的種子細(xì)胞。以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的人皮膚、骨、肌腱、血管、角膜、肌肉和神經(jīng)等正在實(shí)驗(yàn)室形成(Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multiline age cells from human adipose tissueImplications forcell-based therapies.Tissue Engi-neering，2001；7(2)211和Clarke DL，Johansson CB，WilbertzJ，et al.Generalized potential ofadult stem cells.Science，2000；288(5547)1660)。不久的將來(lái)，自體成體干細(xì)胞來(lái)源的人工組織將進(jìn)入臨床。因此，PSC3445作為成體干細(xì)胞同樣能夠作為組織構(gòu)建的種子細(xì)胞，用于制備構(gòu)建人工組織的藥物。
三是用于制備抗衰老的藥物。隨著年齡的增長(zhǎng)，成體干細(xì)胞的數(shù)量減少，自我更新和分化能力下降。成體干細(xì)胞活性下降，組織細(xì)胞更新緩慢是衰老的重要原因，成體干細(xì)胞是組織細(xì)胞更新的關(guān)鍵因素，設(shè)法恢復(fù)或增強(qiáng)老年人成體干細(xì)胞功能將是抗衰老的有效措施。因此，作為成體干細(xì)胞，PSC3445移植也是徹底治愈這類疾病的首選方案。
四是用于制備提高造血功能的藥物。本發(fā)明的研究和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還顯示，PSC3445能分泌大量的IL-6。由于IL-6具有強(qiáng)化益血功能，能夠促進(jìn)肌體應(yīng)急性反應(yīng)，提高人體免疫功能，現(xiàn)已用于造血障礙或化療后引起的造血功能低下的治療以及提高免疫力。因此，PSC3445還能用于制備治療造血障礙或化療后引起的造血功能低下及提高免疫力等方面的藥物。
此外，現(xiàn)有的研究還表明，成體干細(xì)胞如骨髓MSC可作為某些基因的載體如骨形成蛋白(BMP)、LacZ以及IL-3等基因的載體，在基因治療某些疾病如骨損傷以及造血障礙等方面具有良好的效果(K.DANIEL RIEW，MD，JUEREN LOU，MD，NEILL M.ThoracoscopicIntradiscal Spine Fusion Using a Minimally Invasive Gene-Therapy Technique.THE JOURNALOF BONE AND JOINT SURGERY 2003，85(5)866 Mosca JD，Hendricks JK，Buyaner D etal.Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery.Clin Orthop 2000，379 SupplS71～90)。因此，PSC3445作為成體干細(xì)胞同樣能夠作為基因載體用于制備治療某些疾病的藥物。


圖1為倒置顯微鏡下PSC3445的細(xì)胞形態(tài)(放大100倍)；圖2為旋渦生長(zhǎng)的PSC3445(放大40倍)；圖3為散在生長(zhǎng)的PSC3445(放大200倍)；
圖4為融合的骨髓MSC(放大200倍)；圖5為PSC3445電鏡下形態(tài)(周邊有纖毛)；圖6為PSC3445電鏡下細(xì)胞核及核仁；圖7為PSC3445生長(zhǎng)不同時(shí)期胞漿中的顆粒；圖8為外周血單核細(xì)胞電鏡下的形態(tài)；圖9為PSC3445 ORO染色結(jié)果(放大1000倍，箭頭所指處為陽(yáng)性結(jié)果處)；圖10為PSC3445 POX染色結(jié)果(放大1000倍)；圖11為PSC3445 PAS染色結(jié)果(放大400倍)；圖12為PSC3445 Alk.P染色結(jié)果(放大400倍，箭頭所指為處陽(yáng)性結(jié)果處)；圖13為PSC3445AP染色結(jié)果；圖14為PSC3445瑞氏染色結(jié)果)；圖15為PSC3445經(jīng)IL-2誘導(dǎo)后細(xì)胞的流式細(xì)胞圖；圖16為PSC3445經(jīng)IL-2誘導(dǎo)后細(xì)胞的流式細(xì)胞圖；圖17為PSC3445經(jīng)IL-2誘導(dǎo)后瑞氏染色結(jié)果(放大1000倍；圖18為PSC3445經(jīng)EGF誘導(dǎo)后CAM5.2組化染色結(jié)果(放大1000倍)；圖19為PSC3445經(jīng)EGF誘導(dǎo)后EMA組化染色結(jié)果(放大1000倍)；圖20為PSC3445經(jīng)EGF誘導(dǎo)后P63組化染色結(jié)果(放大1000倍)；圖21為PSC3445經(jīng)NGF誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)(放大200倍)；圖22為PSC3445經(jīng)NGF誘導(dǎo)后細(xì)胞NSE染色結(jié)果(放大400倍)；圖23為細(xì)胞周期分析流式細(xì)胞圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明公開(kāi)新的成體干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和該細(xì)胞在制備有關(guān)藥物中的應(yīng)用，以滿足人們的需要。
(一)Potentculture培養(yǎng)試劑1000ml的Potentculture培養(yǎng)試劑的具體含量如下1、氨基酸類 1400～1800mg(1)8種必需氨基酸 450～650mg包括異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸和纈氨酸等。
(2)非必需氨基酸950～1150mg包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸等。
2、無(wú)機(jī)鹽類 10000～15000mg包括CaCl2、Fe(NO3)3·9H2O、KCl、MgSO4·7H2O、NaCl、NaHCO3和NaH2PO4·2H2O等。
3、維生素及脂類 30～60mg包括抗壞血酸、生物素、氧化膽鹽、葉酸、肌醇、菸酰胺、吡哆醛、核黃素、硫氨酸、維生素B12、偏多酸鈣等。
3、核酸類 40～70mg包括腺苷、胞嘧啶核苷、脫氧腺苷、脫氧胞嘧啶核苷、脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷、鳥(niǎo)苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶等。
4、葡萄糖 800～1500mg5、其它成分 120～170mg包括葡萄糖硫辛酸、酚紅和丙酮酸鹽。
6、血漿或血清類 200～600ml包括人血漿、馬血清和牛血清等。
使用Potentculture培養(yǎng)試劑培養(yǎng)細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是①本培養(yǎng)試劑具有篩選作用所得細(xì)胞純度高，能夠得到非常均一的條梭狀細(xì)胞，而我們對(duì)報(bào)道方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，所得到的細(xì)胞至少在兩種以上；②分離成功率高每份臍血均可分離出PSC。而國(guó)外報(bào)道，大約只有25％的臍血中能夠分離出MSC。
(二)PSC3445的培養(yǎng)方法下面，進(jìn)一步細(xì)化和闡述方法一的具體操作主要試劑的來(lái)源新生馬血清、無(wú)鈣鎂Hank’s液均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清來(lái)源于杭州四季青公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠。
①臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離無(wú)菌條件下采集正常人新鮮臍帶血(臍血)50～100ml(婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦)，肝素(50U/ml)抗凝；臍血收集后＜2h進(jìn)行處理新鮮臍血2500r·min-1離心15min，取白膜層；再用含有2％胎牛血清的無(wú)鈣鎂Hank’s液按1∶3進(jìn)行稀釋，疊加在Ficoll-paque上層，3000r·min-1離心15min，取單個(gè)核細(xì)胞層洗滌備用。
②PSC3445的純化及擴(kuò)增培養(yǎng)將單個(gè)核細(xì)胞配成適當(dāng)濃度的細(xì)胞溶液，并接種到Potentculture培養(yǎng)試劑中，接種濃度1×106～1×108個(gè)細(xì)胞/cm2置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，棄去貼壁的細(xì)胞；將未貼壁的懸浮細(xì)胞移種到另一培養(yǎng)器皿如24孔板中，更換Potentculture培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)2～3天，所得的貼壁細(xì)胞中的成纖維樣細(xì)胞即是所要篩選的PSC3445。
待PSC占培養(yǎng)面積的70～80％左右時(shí)，用含有0.1g％EDTA的0.125％胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，可得到大量擴(kuò)增的高純度的PSC3445。
(三)PSC3445的用途表6、1999年以來(lái)發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞多能性實(shí)例

表6中所涉及的參考文獻(xiàn)如下①Bjornson CR，Rietze RL，Reynolds BA，et al.Turning brain into blooda hematopoieticfate adopted by adult neural stem cells in vivo.Science.1999 Jan 22；283(5401)534-7.
②Jackson KA，Mi T，Goodell MA.Hematopoietic potential of stem cells isolated frommurine skeletal muscle.Proc Natl Acad Sci USA.1999 Dec 7；96(25)14482-6.
③Clarke DL，Johansson CB，Wilbertz J，et al.Generalized potential of adult neural stemcells.Science.2000 Jun 2；288(5471)1660-3.
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⑩Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Mobilized bone marrow cells repair the infarctedheart，improving function and survival.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Aug 28；98(18)10344-9.Epub 2001 Aug 14.
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從表6可以得出，一是成體干細(xì)胞存在于多種組織；二是不同組織來(lái)源的成體干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)成同一功能細(xì)胞，如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胰腺來(lái)源的干細(xì)胞等均能夠誘導(dǎo)成肝細(xì)胞；三是同一種成體干細(xì)胞也能夠誘導(dǎo)成為不同培層來(lái)源的功能細(xì)胞，如外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的PSC能夠被分別誘導(dǎo)成為神經(jīng)樣細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、表皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等。
MSC是目前研究最多、最具有代表性和分化傾向最多的成體干細(xì)胞之一，PSC3445同樣具有與MSC相似的多向分化潛能，而且實(shí)現(xiàn)了體外定向誘導(dǎo)分化、體外高度純化和體外大量、高速擴(kuò)增，解決了其臨床使用上的技術(shù)瓶頸，使其實(shí)際推廣應(yīng)用即將成為現(xiàn)實(shí)。下面以MSC的臨床應(yīng)用為依據(jù)和引導(dǎo)，進(jìn)一步闡述PSC3445作為一種新的成體干細(xì)胞在臨床上的具體應(yīng)用。
MSC是具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層來(lái)源的組織細(xì)胞分化的能力，已證實(shí)至少可向9種以上的成熟細(xì)胞分化，這些細(xì)胞包括肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞和肌腱細(xì)胞等，也可以分化為造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞(Lagasse E，Connors H，Al-Dhalimy M，et al.Purified hematopoietic stem cellscan differentiate into hepatocytes in vivo.Nat Med，2000；6(11)1229)。將單個(gè)MSC移植到小鼠骨髓組織中，發(fā)現(xiàn)它可以不但形成骨髓及血液細(xì)胞，而且可以進(jìn)入肝、肺、皮膚、胃及腸等組織中，并分化為相應(yīng)組織類型的成熟細(xì)胞(Liechty KW，Mackenzie TC，Shaaban AF，etal.Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after inutero transplantation in sheep.Nat Med，2000；6(11)1 282)；將MSC注射到心肌損傷的大鼠心肌組織中，可分化為心肌細(xì)胞，修復(fù)心肌損傷(Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science，1999；284(5 411)143和Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，muliti-lineage engraftment by asingle bone marrow-derived stem cell.Cell，2001；105(3)369)；將人MSC移植到羊胚胎中，MSC可隨胚胎發(fā)育進(jìn)入多種組織中，發(fā)育分化為肌肉、皮膚、胸腺和脂肪等成熟細(xì)胞，顯示出相應(yīng)的組織特異性(Lagasse E，Connors H，Al-Dhalimy M，et al.Purified hematopoieticstem cells can differentiate into hepatocytes in vivo.Nat Med，2000；6(11)1 229)。MSC分化多向性提示，它可能成為細(xì)胞治療和組織器官構(gòu)建的理想種子細(xì)胞。MSC體外培養(yǎng)具有黏附于塑料培養(yǎng)皿壁的能力，且易于分離，體外經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的連續(xù)培養(yǎng)和冷凍保存后，不會(huì)改變其分化潛能，因而可能成為一種組織替代治療的細(xì)胞新來(lái)源。過(guò)去認(rèn)為神經(jīng)、肌肉等組織難以再生，現(xiàn)已從中分離獲得成體干細(xì)胞，證實(shí)這些干細(xì)胞可以在其特定組織中更新受損的組織細(xì)胞。如果將神經(jīng)干細(xì)胞和肌肉干細(xì)胞移植到喪失造血功能的小鼠體內(nèi)，可以產(chǎn)生造血細(xì)胞，重建造血功能，提示這些細(xì)胞可以作為血液細(xì)胞的新來(lái)源(Jackson KA，Majka Sm，Wong H，et al.Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stemcells.J Clin Inverst，2001；107(11)1 395)；造血干細(xì)胞是各種血液細(xì)胞的種子細(xì)胞，但移植到腦內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞(Orlic D，Kajstuya J，Chimenti S，et al.Bone marrow cells regenerateinfarcted myocardium.Nature，2001；410(6 829)701)，進(jìn)入肝臟可分化為肝細(xì)胞，使肝臟恢復(fù)正常功能(Bjornson CR，Rietze RL，Reynolds BA，et al.Turning brain into bloodAhematopoietic fate adopted by adult stem cells in vivo.Science，1999；283(5 401)534)；因此，成體干細(xì)胞有可能成為退行性腦病變和肝損傷功能重建的新型起源細(xì)胞。皮膚干細(xì)胞除再生皮膚細(xì)胞外，也可以轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元、平滑肌、脂肪和膠質(zhì)細(xì)胞等，神經(jīng)干細(xì)胞移植到肌肉組織也同樣可以分化為肌肉細(xì)胞。此外，在體外培養(yǎng)條件下，少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體在特定情況時(shí)可發(fā)生重新規(guī)化(reprogramm)而形成多能神經(jīng)干細(xì)胞，后者則可分化成為神經(jīng)原細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)不僅為獲得神經(jīng)干細(xì)胞提供了又一新途徑，而且提示細(xì)胞分化的機(jī)制十分復(fù)雜，干細(xì)胞可能具有驚人的分化潛能(Mezey E，Chandross KJ.Bone marrow；A possiblealternative source of cells in the adult nervous system.Eur J Pharmacol，2000；405(1-3)297)，其中角膜干細(xì)胞已在移植治療中獲得成功。
最近，在肥胖患者的脂肪組織中分離獲得大量成體于細(xì)胞，證實(shí)這種成體干細(xì)胞具有與MSC相似的多向分化潛能，因此脂肪組織有可能成為體內(nèi)最大的成體干細(xì)胞庫(kù)，徹底解決干細(xì)胞來(lái)源困難的問(wèn)題(Theise ND，Nimmakayalu M，Gardner R，et al.Liver from bonemarrow in humans.Hepatology，2000；32(1)11)。類似地，PSC3445實(shí)現(xiàn)了體外高度純化和體外大量、高速擴(kuò)增，因此，PSC3445也是解決當(dāng)前干細(xì)胞來(lái)源困難問(wèn)題的方案之一。
成體干細(xì)胞在修復(fù)重建中的應(yīng)用。臨床嚴(yán)重創(chuàng)傷等引起的組織缺損，依靠自體自然修復(fù)能力難以恢復(fù)正常的組織結(jié)構(gòu)與功能，需要進(jìn)行移植治療?，F(xiàn)代外科技術(shù)已經(jīng)有了較大的發(fā)展，移植技術(shù)本身并不存在大的困難，關(guān)鍵是獲得理想的移植材料。成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、治療性克隆以及以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的生物組織工程技術(shù)的發(fā)展，已為臨床修復(fù)重建治療開(kāi)辟了全新的領(lǐng)域。從分化潛能看，胚胎干細(xì)胞是最具有臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞，但目前存在的問(wèn)題是材料來(lái)源困難，體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，分化機(jī)制不清，定向誘導(dǎo)遠(yuǎn)還存在許多技術(shù)問(wèn)題。胚胎干細(xì)胞來(lái)源的移植材料用于臨床還存在免疫排斥問(wèn)題，甚至可能有發(fā)生腫瘤的隱患。與胚胎干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞具有離成熟細(xì)胞距離較近、來(lái)源豐富、可塑性強(qiáng)及具有多向分化潛能等特點(diǎn)，最大特色是可實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，無(wú)免疫排斥問(wèn)題，在臨床應(yīng)用方面顯示出真正的希望。成體干細(xì)胞的臨床應(yīng)用幾乎涉及目前臨床醫(yī)學(xué)面臨的所有醫(yī)學(xué)難題。組織器官缺損需要移植修補(bǔ)，終末器官衰竭需要移植替代，各種退行性疾病如肝硬化和糖尿病等需要功能重建和細(xì)胞再生，成體干細(xì)胞及以它為基礎(chǔ)的人工細(xì)胞、組織和器官移植是解決上述問(wèn)題的最理想策略之一。成體干細(xì)胞工程技術(shù)可用于所有組織器官的修復(fù)重建，如皮膚創(chuàng)面植皮、組織缺損修補(bǔ)、關(guān)節(jié)置換、血管替代、心臟瓣膜置換、組織或器官的替代、糖尿病患者的胰島植入、終末臟器損傷或功能衰竭的置換等。成體干細(xì)胞及其衍生組織器官將產(chǎn)生一種全新的治療技術(shù)，給現(xiàn)代醫(yī)學(xué)帶來(lái)革命性的變化，臨床常見(jiàn)的許多“不治之癥”將有可能通過(guò)成體干細(xì)胞及其衍生物移植而得到有效治療。由于成體干細(xì)胞具有多向分化潛能，并存在于多種組織中，因此便于從患者自體獲得成體干細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增和誘導(dǎo)處理移植到靶組織中發(fā)揮作用。
目前，成體干細(xì)胞研究成果已經(jīng)提示其在臨床治療方面有廣闊的應(yīng)用前景如腦組織、嗅球神經(jīng)的成體干細(xì)胞直接移植到骨髓、皮膚、脂肪等組織；成體干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為神經(jīng)或神經(jīng)前體細(xì)胞移植治療帕金森氏病、老年性癡呆和腦損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾??；骨髓、肝組織成體干細(xì)胞治療骨胳肌、心肌損傷；骨髓來(lái)源成體干細(xì)胞重建肝功能；皮膚、骨髓組織成體干細(xì)胞治療皮膚損傷；角膜緣成體干細(xì)胞移植治療角膜病；骨髓、肌組織成體干細(xì)胞移植治療心肌損傷；胰島成體干細(xì)胞移植治療糖尿病。
成體干細(xì)胞的另一重要用途是用于人工組織構(gòu)建。真正意義上的人工組織是有正常結(jié)構(gòu)及功能，活性細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能的關(guān)鍵因素，成體干細(xì)胞則是構(gòu)建人體生物組織的種子細(xì)胞。以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的人皮膚、骨、肌腱、血管、角膜、肌肉和神經(jīng)等正在實(shí)驗(yàn)室形成。其中，組織工程人工皮研究已取得突破性進(jìn)展，并已應(yīng)用于臨床。目前，利用組織工程技術(shù)再造組織和器官，總的來(lái)講還是結(jié)構(gòu)比較單一的器官或器官的一部分，對(duì)于結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜的組織，如肝、肢體等尚有一定距離，但現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展相當(dāng)迅速，不久的將來(lái)，自體成體干細(xì)胞來(lái)源的人工組織將進(jìn)入臨床。
基于成體干細(xì)胞的功能重建技術(shù)還可用于抗衰老治療。隨著年齡的增長(zhǎng)，成體干細(xì)胞的數(shù)量減少，自我更新和分化能力下降。成體干細(xì)胞活性下降，組織細(xì)胞更新緩慢是衰老的重要原因，設(shè)法恢復(fù)或增強(qiáng)老年人成體干細(xì)胞功能將是抗衰老的有效措施。
另外，新近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生與成體干細(xì)胞密切相關(guān)，證據(jù)是腫瘤細(xì)胞中存在腫瘤干細(xì)胞，某些腫瘤起源于腫瘤干細(xì)胞(Bicmco P，Robey PG.Stem cells tissue engineering.Nature，2001；414(6859)118)。這類細(xì)胞具有長(zhǎng)期生存和克隆擴(kuò)增的能力，這兩種細(xì)胞的自我更新調(diào)節(jié)機(jī)制具有一致性。在臨床腫瘤治療中，腫瘤性成體干細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物不敏感可能是治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因，在干細(xì)胞水平消除腫瘤性細(xì)胞才能徹底根治腫瘤(RaoMS，Mttson MP.Stem cells and agingExpanding the possibilities.Mech Ageing Dev，2001；122(1)713和Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells.Nature，2001；414(6859)105)。
能夠用于制備提高造血功能的藥物。本發(fā)明的研究和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還顯示，PSC3445能分泌大量的IL-6。由于IL-6具有強(qiáng)化益血功能和抗癌作用，能夠促進(jìn)肌體應(yīng)急性反應(yīng)，提高人體免疫功能，現(xiàn)已用于造血障礙或化療后引起的造血功能低下、提高免疫力以及廣泛的抗癌治療。骨髓、外周血、臍血、肌肉和神經(jīng)等組織的成體干細(xì)胞移植重建造血免疫功能。因此，PSC3445還能用于制備治療造血障礙或化療后引起的造血功能低下、提高免疫力及抗癌等方面的藥物。
本發(fā)明培養(yǎng)的新細(xì)胞PSC3445是成體干細(xì)胞，在IL-2、NGF、LPS、EGF等誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下能夠定向分化為T(mén)淋巴細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、表皮細(xì)胞等功能細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)的四種定向誘導(dǎo)，具體誘導(dǎo)過(guò)程如下①淋巴細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將培養(yǎng)數(shù)天的臍血來(lái)源的PCS3445，更換用含胎牛血清、IL-2的α-MEM進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(不加IL-2和不更換培養(yǎng)試劑兩個(gè)對(duì)照組)。定期補(bǔ)液一次，補(bǔ)液時(shí)保持IL-2的濃度不變。誘導(dǎo)數(shù)天后，PSC3445變?yōu)閼腋∩L(zhǎng)的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與形態(tài)學(xué)觀察，懸浮的細(xì)胞即為CD3+CD4+或CD3+CD8+的T淋巴細(xì)胞。
②巨噬細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將培養(yǎng)數(shù)天的生長(zhǎng)旺盛的臍血來(lái)源的PCS3445，用含胎牛血清、LPS的MEM進(jìn)行誘導(dǎo)。定期補(bǔ)液一次，補(bǔ)液時(shí)保持LPS的濃度不變。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)與誘導(dǎo)后細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、IL-10、TNF等的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PSC3445已被誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞。
③神經(jīng)樣細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將培養(yǎng)數(shù)天的臍血來(lái)源的PCS3445，更換用含胎牛血清、NGF的α-MEM進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(不加NGF的對(duì)照組，不更換培養(yǎng)試劑的兩個(gè)對(duì)照組)。數(shù)天后，PSC3445在形態(tài)上變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞，NSE染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明PSC3445已在NGF的作用下被誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細(xì)胞。
④表皮細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將培養(yǎng)數(shù)天的臍血來(lái)源的PCS，用含胎牛血清、EGF的MEM進(jìn)行誘導(dǎo)，定期補(bǔ)液一次，補(bǔ)液時(shí)保持EGF的濃度不變。數(shù)天后，組織化學(xué)染色顯示CAM5.2、EMA、P63均為陽(yáng)性，說(shuō)明PSC3445已被誘導(dǎo)成為表皮細(xì)胞。
根據(jù)目前的研究和臨床實(shí)踐證實(shí)，T淋巴細(xì)胞為免疫細(xì)胞，成體肝細(xì)胞誘導(dǎo)的CD8+陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞、體內(nèi)衰老的細(xì)胞具有殺傷作用，成體肝細(xì)胞誘導(dǎo)的CD4+陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞具有輔助免疫輔助功能，因此，T淋巴細(xì)胞對(duì)于治療免疫功能低下的患者具有良好的效果。成體肝細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)樣細(xì)胞目前主要用于帕杰森綜合征等神經(jīng)性損傷疾病的治療。巨噬細(xì)胞為抗原提呈細(xì)胞，對(duì)于啟動(dòng)免疫應(yīng)答具有重要的作用，因此，成體肝細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞能夠用于某些癌癥病人的治療，如結(jié)腸癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等。
該成體干細(xì)胞能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下與許多生物化學(xué)物質(zhì)作用生成組合物，無(wú)論這些生物化學(xué)物質(zhì)是否具有生物活性或具有治療疾病的功能，這些生物化學(xué)物質(zhì)是包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體、天然產(chǎn)物、化學(xué)合成藥物或人類用藥等中的一種；優(yōu)選包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。
所說(shuō)的載體包括賦形劑，如淀粉、水等；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂等；崩解劑，如微晶纖維素等；填充劑，如乳糖等；粘接劑，如預(yù)膠化淀粉、糊精等。
該成體干細(xì)胞及其組合物均能用于制備治療所述疾病的藥物。所述及的該成體干細(xì)胞能夠單獨(dú)施用于需要治療的患者，還能夠以組合物的形式即將治療有效量的該成體干細(xì)胞和以上所述的生物化學(xué)物質(zhì)形成的組合物，施用于需要治療的患者。所述的藥物是指含有本發(fā)明方法所獲得的成體干細(xì)胞PSC3445和常規(guī)載體及助劑組成的藥物制劑，包含僅有用本發(fā)明方法所獲得的PSC3445的藥物制劑，或者是以本發(fā)明方法所獲得的PSC3445作為活性成分與傳統(tǒng)的輔劑和添加物一起組成的藥物制劑，能夠采用本領(lǐng)域公知的方法制成各種劑型，劑型包括含服制劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、注射劑及其他非腸道給藥組合物，采取注射(包括靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射、皮下注射)等給藥途徑進(jìn)行某疾病的治療。以上所述劑型中優(yōu)選溶液劑、注射劑，進(jìn)一步優(yōu)選注射劑。
對(duì)于液體制劑如混懸劑、乳劑、溶液劑、注射劑等的制備，所選用敷料包括任何常用的敷料如環(huán)糊精化合物、乙二醇、丙二醇、吐溫、乙醇、油等均可在低于產(chǎn)生刺激劑量下選用，還可以加入適當(dāng)?shù)乃峄驂A以及緩沖溶液如檸檬酸及磷酸緩沖液以保證生物化學(xué)物質(zhì)的穩(wěn)定性；為保證液體制劑的等滲性質(zhì)，還可以選用氯化鈉、甘露醇、葡萄糖等加入，另外還可加入防腐劑。
注射針劑含有本發(fā)明PSC3445，優(yōu)選以無(wú)菌凍干物儲(chǔ)存。在給藥前與合適的等滲溶液混合，等滲溶液包括傳統(tǒng)的適于注射或注入的等滲水系統(tǒng)，其中含有用于注射液的普通添加物如穩(wěn)定劑和促溶劑，優(yōu)選生理鹽水或通過(guò)緩沖液調(diào)成的等滲溶液。
含服制劑及其他非腸道給藥組合物含有本發(fā)明PSC3445，包括本發(fā)明PSC3445與普通添加物如惰性稀釋劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、潤(rùn)滑劑等混合，并用已知方法進(jìn)行制備的劑型等。
用于患者時(shí)，該成體干細(xì)胞的使用有兩種情況，一是全身使用，一般的要求量為106個(gè)細(xì)胞/kg·d；二是局部使用，可根據(jù)收獲的細(xì)胞數(shù)而定，量高效果相對(duì)要好，一般為106～107個(gè)細(xì)胞/kg·d均可。該劑量或用量，通常還要根據(jù)患者的年齡和體重以及癥狀的狀況決定。
下面通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，以下所述的實(shí)例是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1、Potentculture培養(yǎng)試劑的配方1000ml的Potentculture培養(yǎng)試劑的具體組成和含量如下①氨基酸類 1682.9mg以下所述的氨基酸產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Gibico公司。
A.8種必需氨基酸 592.4mg包括94.4mg的L-異亮氨酸(貨號(hào)22405013，純度＞99％)、94.4mg的L-亮氨酸(貨號(hào)12424016，純度＞99％)、131.6mg的L-賴氨酸(貨號(hào)12407011，純度＞99％)、26.9mg的蛋氨酸(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)9625，純度98％)、59.4mg的L-苯丙氨酸(貨號(hào)12409017，純度＞99％)、15.7mg的L-色氨酸(貨號(hào)12432019，純度＞99％)、85.7mg的L-蘇氨酸(貨號(hào)12410015，純度＞99％)和84.3mg的L-纈氨酸(貨號(hào)12413019，純度＞99％)。
B.非必需氨基酸 1090.5mg包括15mg的L-丙氨酸(貨號(hào)21002019，純度＞99％)、126.2mg的L-精氨酸(貨號(hào)12401014，純度＞99％)、30mg的L-天冬酰胺(貨號(hào)12416012，純度＞99％)、18mg的L-天冬氨酸(貨號(hào)12417010，純度＞99％)、60mg的L-半胱氨酸(貨號(hào)11033016，純度＞99％)、43.2mg的L-胱氨酸(貨號(hào)12402012，純度＞99％)、45mg的L-谷氨酸(貨號(hào)11048014，純度＞99％)、48mg的L-甘氨酸(貨號(hào)12421012，純度＞99％)、525.6mg的L-谷氨酰胺(貨號(hào)21051024，純度＞99％)、50.4mg的L-組氨酸(貨號(hào)12422010，純度＞99％)、24mg的L-脯氨酸(貨號(hào)21096029，純度＞99％)、40.2mg的L-絲氨酸(貨號(hào)22430011，純度＞99％)和64.9mg的L-酪氨酸(貨號(hào)12412011，純度＞99％)。
②無(wú)機(jī)鹽類 12479.9mg包括240mg的CaCl2(中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠，分析純，純度≥98％)、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O(中國(guó)大港億中化工廠，分析純，純度＞98％)、480mg的KC1(中國(guó)天津市四通化工廠，分析純，純度≥99.5％)、240mg的MgSO4·7H2O(中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠，分析純，純度≥98％)、7920mg的NaCl(中國(guó)天津市四通化工廠，分析純，純度≥99.5％)、3420mg的NaHCO3(中國(guó)河南焦作化工三廠，分析純，純度≥99％)和179.8mg的NaH2PO4·2H2O(中國(guó)上海化學(xué)試劑總廠所屬上海試劑二廠，優(yōu)級(jí)純，純度≥99.9％)。
③維生素和脂類 54.7mg以下所述的維生素和脂類產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。
30mg的抗壞血酸(貨號(hào)7631，純度＞99％)、0.06mg的D-生物素(貨號(hào)4501，純度＞99％)、0.8mg的維生素B12(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)13100011，純度＞99％)、3mg的吡哆醛(貨號(hào)9755，純度＞99％)、0.3mg的核黃素(貨號(hào)4500，純度＞99％)、3mg偏多酸鈣(貨號(hào)2625)、3mg氧化膽堿(貨號(hào)7527，純度＞98％)、3mg葉酸(貨號(hào)8758，純度98％)、5.5mg肌醇(貨號(hào)7508，純度99％)、3mg菸酰胺(貨號(hào)0636，純度95％)、3mg硫氨酸(貨號(hào)3902，純度97％)。
④核酸類48mg以下所述的核酸類產(chǎn)品未標(biāo)記來(lái)源的，均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。
包括6mg的腺苷(貨號(hào)9251，純度＞99％)、6mg的胞嘧啶核苷(貨號(hào)4654，純度≥99％)、6mg的脫氧腺苷(貨號(hào)8668，純度99％～100％)、6mg的脫氧胞嘧啶核苷(貨號(hào)0776，純度95％～98％)、6mg的脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷(貨號(hào)0991，純度99％～100％)、6mg的鳥(niǎo)苷(貨號(hào)6264，純度98％)、6mg的胸腺嘧啶(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)16495038，純度＞99％)和6mg的尿嘧啶(貨號(hào)3750，純度＞99％)。
⑤葡萄糖1200mg來(lái)源中國(guó)天津登峰化學(xué)試劑廠，分析純，純度≥98％。
⑥其它成分 147.1mg包括0.12mg的葡萄糖硫辛酸(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)1395，純度99％)、15mg的酚紅(美國(guó)Gibico公司，貨號(hào)11160025，純度＞99％)和132mg的丙酮酸鹽(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)5194)。
⑦血漿或血清類 400ml400ml血漿(三份臍血混合血漿)。
將本發(fā)明所配置的Potentculture基礎(chǔ)培養(yǎng)試劑與其他的細(xì)胞培養(yǎng)試劑進(jìn)行比較，能夠發(fā)現(xiàn)在組分和含量方面均有明顯差異(表8)，組分更加全面，并調(diào)整了組分的含量，使其滲透壓明顯高于其他的細(xì)胞培養(yǎng)試劑的滲透壓(表7)，從而達(dá)到了所期望的篩選細(xì)胞的目的。
表7、Potentculture培養(yǎng)試劑與其他部分細(xì)胞培養(yǎng)試劑在滲透壓方面的比較

表8、Potentculture基礎(chǔ)培養(yǎng)試劑與其他部分細(xì)胞培養(yǎng)試劑在組分和含量方面的比較


實(shí)施例2、PSC3445的培養(yǎng)方法(1)主要試劑的來(lái)源新生馬血清、無(wú)鈣鎂Hank’s液均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胎牛血清來(lái)源于杭州四季青公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海試劑二廠。
①臍血單個(gè)核細(xì)胞的分離無(wú)菌條件下采集正常人新鮮臍血80ml(婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦)，肝素(50U/ml)抗凝；臍血收集后2h內(nèi)進(jìn)行處理新鮮臍血2500r·min-1離心15min，取白膜層(白細(xì)胞層)；再用含有2％胎牛血清的無(wú)鈣鎂Hank’s液按1∶3進(jìn)行稀釋，疊加在Ficoll-paque上層，3000r·min-1離心15min，取單個(gè)核細(xì)胞層，用含有2％胎牛血清的無(wú)鈣鎂Hank’s液洗滌備用。
②PSC3445的純化及擴(kuò)增培養(yǎng)將單個(gè)核細(xì)胞配成適當(dāng)濃度的細(xì)胞溶液，并接種到Potentculture培養(yǎng)試劑(見(jiàn)實(shí)施例1)中，接種濃度1×107個(gè)細(xì)胞/cm2；置于37℃、5％CO2、80％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天，首先貼壁的為成熟的單核細(xì)胞，其形態(tài)主要為圓形或不規(guī)則形，棄去該貼壁的細(xì)胞；將未貼壁的懸浮細(xì)胞移種到24孔塑料培養(yǎng)板中，更換Potentculture培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)2天，所得的貼壁細(xì)胞中的成纖維樣細(xì)胞即是所要篩選的PSC3445。
③待PSC3445占培養(yǎng)面積的75％時(shí)，用含有0.1g％EDTA的0.125％胰酶消化，按1∶2傳代，可得到大量擴(kuò)增的高純度的PSC3445。
(2)臍血PSC增殖與周期分析將培養(yǎng)6～7d的未貼壁臍血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)種至24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)1～2d，移去未貼壁細(xì)胞同時(shí)換新的培養(yǎng)試劑，計(jì)數(shù)10份臍血中的隨機(jī)10個(gè)培養(yǎng)孔，每孔計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野的條梭狀細(xì)胞。依次于換液后0d，第1d、第2d、……、第9d的成纖維狀細(xì)胞數(shù)，取平均值，根據(jù)所得細(xì)胞數(shù)繪制細(xì)胞增殖曲線(方法參照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)主編的細(xì)胞培養(yǎng))。在換液后第4～5d將細(xì)胞消化，經(jīng)Hank’s洗滌后，經(jīng)流式細(xì)胞儀(上海華舜)測(cè)定PSC細(xì)胞周期。
實(shí)施例3、PSC3445的定向誘導(dǎo)本發(fā)明PSC3445培養(yǎng)10～12天后，加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)。PSC3445在四種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下的具體誘導(dǎo)過(guò)程和結(jié)果如下①淋巴細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將培養(yǎng)10～12天的臍血來(lái)源的PSC3445，更換用含10％胎牛血清、300U/ml的IL-2的α-MEM進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組(不加IL-2和不更換培養(yǎng)試劑兩對(duì)照組)。每三天補(bǔ)液一次，補(bǔ)液時(shí)IL-2濃度仍為300U/ml。誘導(dǎo)7～10天后PSC3445變?yōu)閼腋∩L(zhǎng)的細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)與形態(tài)學(xué)觀察懸浮的細(xì)胞為CD3+CD4+或CD3+CD8+的T淋巴細(xì)胞。
②巨噬細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將培養(yǎng)10～12天的生長(zhǎng)旺盛的臍血來(lái)源的PSC3445，用含10％胎牛血清的MEM加入500ng/ml的LPS進(jìn)行誘導(dǎo)，每三天補(bǔ)液一次，補(bǔ)液時(shí)LPS濃度仍為500ng/ml。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)與誘導(dǎo)后細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、IL-10、TNF等的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PSC3445已被誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞。
③神經(jīng)樣細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將培養(yǎng)10～12天的臍血來(lái)源的PSC3445，更換用含10％胎牛血清，200ng/ml NGF的α-MEM進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。經(jīng)7天左右的誘導(dǎo)后，PSC3445在形態(tài)上已變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞，NSE染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明PSC3445已在NGF的作用下誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細(xì)胞。
④表皮細(xì)胞的定向誘導(dǎo)將培養(yǎng)10～12天的臍血來(lái)源的PSC3445，用含10％胎牛血清的MEM加入200ng/mlEGF進(jìn)行誘導(dǎo)，每三天補(bǔ)液一次，補(bǔ)液時(shí)EGF濃度仍為200ng/ml。組織化學(xué)染色顯示CAM5.2、EMA、P63均為陽(yáng)性，說(shuō)明PSC3445已被誘導(dǎo)成為表皮細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種成體干細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞具有高度自我復(fù)制能力和多系分化能力，其細(xì)胞培養(yǎng)特性、生長(zhǎng)特性、形態(tài)學(xué)特性和生物學(xué)特性均不同于現(xiàn)有成體干細(xì)胞，包括如下特征①該細(xì)胞傳10代以上，其細(xì)胞形態(tài)及表面標(biāo)志物不發(fā)生變化；②該細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，分化為多種不同胚層來(lái)源的細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、表皮細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞；③該細(xì)胞是成纖維樣細(xì)胞，在培養(yǎng)后能大量擴(kuò)增，呈漩渦狀生長(zhǎng)，且不出現(xiàn)融合現(xiàn)象；④該細(xì)胞在投射電鏡下的特征是細(xì)胞周邊有許多纖毛，細(xì)胞核為圓形或卵圓形，部分細(xì)胞核仁明顯，細(xì)胞成熟后，胞漿中的顆粒逐漸增大；⑤該細(xì)胞的表面標(biāo)志物包括HLA-DR、CD34、CD14、CD90、CD11b和CD105，與骨髓及血液來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞或多潛能干細(xì)胞的表面標(biāo)志物不完全相同；⑥該細(xì)胞的特殊化學(xué)染色與臍血間質(zhì)干細(xì)胞不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟①常規(guī)方法分離出單個(gè)核細(xì)胞，其中使用的培養(yǎng)試劑是Potentculture培養(yǎng)試劑；②將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋，得細(xì)胞溶液；③將該細(xì)胞溶液接種到含有Potentculture培養(yǎng)試劑的器皿中，進(jìn)行培養(yǎng)；④棄去未貼壁的細(xì)胞，更換新的Potentculture培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞，即得該細(xì)胞；所述的Potentculture培養(yǎng)試劑各組分及配比是1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑主要包括1400～1800mg氨基酸類、10000～15000mg無(wú)機(jī)鹽類、30～60mg維生素及脂類、40～70mg核酸類、1000～1400mg葡萄糖類、120～170mg其它成分以及200～600ml血漿或血清類組分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟①常規(guī)方法分離出單個(gè)核細(xì)胞，其中使用的培養(yǎng)試劑是Potentculture培養(yǎng)試劑；②將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋，得細(xì)胞溶液；③將該細(xì)胞溶液接種到含有Potentculture培養(yǎng)試劑的器皿中，進(jìn)行培養(yǎng)；④棄去貼壁的細(xì)胞，將未貼壁的細(xì)胞移種到另一培養(yǎng)器皿中再培養(yǎng)，更換新的Potentculture培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞，即得該細(xì)胞；所述的Potentculture培養(yǎng)試劑各組分及配比是1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑主要包括1400～1800mg氨基酸類、10000～15000mg無(wú)機(jī)鹽類、30～60mg維生素及脂類、40～70mg核酸類、1000～1400mg葡萄糖類、120～170mg其它成分以及200～600ml血漿或血清類組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟①常規(guī)方法分離出單個(gè)核細(xì)胞，其中使用的培養(yǎng)試劑是Potentculture培養(yǎng)試劑；②將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行稀釋，得細(xì)胞溶液；③將該細(xì)胞溶液接種到含有Potentculture培養(yǎng)試劑的器皿中，進(jìn)行培養(yǎng)；④更換Potentculture培養(yǎng)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞；同時(shí)，保留未貼壁的懸浮細(xì)胞，將其移種到另一培養(yǎng)器皿中，使用Potentculture培養(yǎng)試劑繼續(xù)培養(yǎng)；對(duì)未貼壁細(xì)胞培養(yǎng)所得到的細(xì)胞溶液再進(jìn)行分開(kāi)培養(yǎng)，如此重復(fù)多次，即獲得大量擴(kuò)增的、高純度的該細(xì)胞；所述的Potentculture培養(yǎng)試劑各組分及配比是1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑主要包括1400～1800mg氨基酸類、10000～15000mg無(wú)機(jī)鹽類、30～60mg維生素及脂類、40～70mg核酸類、1000～1400mg葡萄糖類、120～170mg其它成分以及200～600ml血漿或血清類組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟①的常規(guī)分離方法是在無(wú)菌條件下采集正常新鮮皿或低溫凍存血，加抗凝試劑抗凝，離心，取白膜層；再用含血清的Potentculture培養(yǎng)試劑或緩沖液疊加在單個(gè)核細(xì)胞的分離液上層進(jìn)行稀釋，再離心，取單個(gè)核細(xì)胞層洗滌備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟③的培養(yǎng)條件是將培養(yǎng)器皿置于37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天。
7.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4任一項(xiàng)所述的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的Potentculture培養(yǎng)試劑各組分及配比是1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括1682.9mg氨基酸類、12479.9mg無(wú)機(jī)鹽類、54.7mg維生素及脂類、48mg核酸類、1200mg葡萄糖、147.1mg其它成分以及300ml血漿和100ml血清的混合物或400ml血漿。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的成體干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的Potentculture培養(yǎng)試劑各組分及配比是1000ml的該細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括94.4mg的L-異亮氨酸、94.4mg的L-亮氨酸、131.6mg的L-賴氨酸、26.9mg的蛋氨酸、59.4mg的L-苯丙氨酸、15.7mg的L-色氨酸、85.7mg的L-蘇氨酸、84.3mg的L-纈氨酸、15mg的L-丙氨酸、126.2mg的L-精氨酸、30mg的L-天冬酰胺、18mg的L-天冬氨酸、60mg的L-半胱氨酸、43.2mg的L-胱氨酸、45mg的L-谷氨酸、48mg的L-甘氨酸、525.6mg的L-谷氨酰胺、50.4mg的L-組氨酸、24mg的L-脯氨酸、40.2mg的L-絲氨酸、64.9mg的L-酪氨酸、240mg的CaCl2、0.06mg的Fe(NO3)3·9H2O、480mg的KCl、240mg的MgSO4·7H2O、7920mg的NaCl、3420mg的NaHCO3、179.8mg的NaH2PO4·2H2O、30mg的抗壞血酸、0.06mg的D-生物素、0.8mg的維生素B12、3mg的吡哆醛、0.3mg的核黃素、3mg偏多酸鈣、3mg氧化膽堿、3mg葉酸、5.5mg肌醇、3mg菸酰胺、3mg硫氨酸、6mg的腺苷、6mg的胞嘧啶核苷、6mg的脫氧腺苷、6mg的脫氧胞嘧啶核苷、6mg的脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷、6mg的鳥(niǎo)苷、6mg的胸腺嘧啶、6mg的尿嘧啶、1200mg葡萄糖、0.12mg的葡萄糖硫辛酸、15mg的酚紅、132mg的丙酮酸鹽、三份臍血混合成的400ml血漿。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞在制備修復(fù)重建藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的成體干細(xì)胞在制備修復(fù)重建藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的修復(fù)重建是包括組織器官缺損的移植修補(bǔ)、終末器官衰竭的移植替代或退行性疾病的移植再生中的一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的成體干細(xì)胞在制備修復(fù)重建藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的組織器官缺損是包括皮膚創(chuàng)面植皮、組織缺損修補(bǔ)、關(guān)節(jié)置換、血管替代、心臟瓣膜置換、組織或器官的替代、糖尿病患者的胰島植入或終末臟器損傷的置換中的一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的成體干細(xì)胞在制備修復(fù)重建藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的退行性疾病是包括肝硬化或糖尿病中的一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的成體干細(xì)胞在制備修復(fù)重建藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的修復(fù)重建藥物還包括在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的成體干細(xì)胞在制備修復(fù)重建藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病是包括帕金森氏病、老年性癡呆或腦損傷中的一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞在制備構(gòu)建人工組織藥物中的應(yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的成體干細(xì)胞在制備構(gòu)建人工組織藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的人工組織是包括以該細(xì)胞為種子細(xì)胞的人皮膚、骨、肌腱、血管、角膜、肌肉或神經(jīng)中的一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞在制備治療造血功能低下藥物中的應(yīng)用。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的成體干細(xì)胞在制備治療造血功能低下藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的造血功能低下是包括造血障礙或化療后引起的造血功能低下中的一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞作為基因載體的應(yīng)用。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的成體干細(xì)胞作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因是包括骨形成蛋白、LacZ或IL-3中的一種。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的成體干細(xì)胞作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因載體在治療骨損傷或造血障礙中的應(yīng)用。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的成體干細(xì)胞在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的癌癥是包括結(jié)腸癌、肺癌、膀胱癌或卵巢癌中的一種。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成體干細(xì)胞在制備治療免疫功能低下藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的成體干細(xì)胞及其培養(yǎng)方法和用途。該細(xì)胞具有高度自我復(fù)制能力和多系分化能力，其細(xì)胞培養(yǎng)特性、生長(zhǎng)特性、形態(tài)學(xué)特性和生物學(xué)特性均不同于現(xiàn)有成體干細(xì)胞，現(xiàn)已被定向誘導(dǎo)分化為T(mén)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、表皮細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞。采用先養(yǎng)后貼法進(jìn)行培養(yǎng)，能夠得到大量擴(kuò)增的、高純度的該細(xì)胞。該細(xì)胞臨床應(yīng)用前景廣泛，能夠用于人體的修復(fù)重建、構(gòu)建人工組織、抗衰、抗癌、治療造血功能低下和免疫功能低下，并能夠作為基因載體用于治療骨損傷或造血障礙等疾病，是解決當(dāng)前干細(xì)胞來(lái)源困難問(wèn)題的首選方案之一。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1667119SQ200410016898
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者趙書(shū)平, 沈茜, 于麗華, 張軍, 徐玉蓮, 李聞捷, 張俊潔 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)