專(zhuān)利名稱：有效霉烯胺和有效霉胺的微生物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從土壤中篩選到的新的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，還涉及利用該新菌株分解有效霉素(又稱井岡霉素)或有效霉亞基胺(又稱井岡霉亞基胺或井岡羥胺)生產(chǎn)有效霉烯胺和有效霉胺的方法。
背景技術(shù)：
有關(guān)有效霉烯胺和有效霉胺的制造方法的研究已經(jīng)有30多年的歷史，日本人龜田等人曾經(jīng)采用過(guò)脫硝假單孢菌的菌體降解有效霉素A或有效霉亞基胺A，再進(jìn)行分離得到有效霉烯胺和有效霉胺，可是不能在僅以有效霉素類(lèi)物質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；而且對(duì)有效霉素的分解能力很弱，不適用于有效霉烯胺和有效霉胺的大量生產(chǎn)。
日本人龜田等在土壤中分離到一株能將有效霉素分解為有效霉烯胺和有效霉胺的菌株嗜糖黃桿菌(Flavobacterium saccharophilum)IFO13948(公開(kāi)特許JP57-54593)。
日本人龜田等采用噬細(xì)胞菌屬產(chǎn)酶微生物(Cytophaga heparina)IFO12017(ATCC13125)和IFO14087株降解有效霉素或有效霉亞基胺生產(chǎn)有效霉烯胺和有效霉胺[特許公報(bào)(B2)平2-26957]。
日本人龜田等發(fā)現(xiàn)了土壤菌屬(Agrobacterium)或者氣單胞菌屬(Aeromonas)的微生物以及它們的變異株能有效分解有效霉素或有效霉亞基胺生產(chǎn)有效霉烯胺和有效霉胺。比如土壤菌屬(Agrobacterium)微生物，有Agrobacterum Radiobacter IFO 12664(ATCC 4718)株，IFO 13258(ATCC 13332)株，IFO 13259(ATCC 13333)株，IFO 13532(ATCC 19358)株，IFO 13533(ATCC 25235)株，以及Agrobacterium tumefaciens IFO 3058株等；氣單胞菌屬(Aeromonas)微生物，有Aeromonas hydrophila subsp.Anaerogenes IFO 13282，同亞種subsp.hydrophila IFO 13286，subsp.proteolytica IFO 13287，aeromonas punctata subsp.cavice IFO 13288，以及aeromonas salmonicida subsp.salmonicida IFO 12659等[特許公報(bào)(B2)平6-69380]。
本發(fā)明所用到的原料是一種廣泛應(yīng)用的農(nóng)用抗生素——有效霉素，即井岡霉素，它是一種高效、安全的農(nóng)用抗生素，不污染環(huán)境，對(duì)人畜無(wú)害，目前已經(jīng)成為我國(guó)使用面積較廣、畝用成本最低的安全、無(wú)公害農(nóng)藥，是農(nóng)藥工業(yè)的一個(gè)重要品種。有效霉素是氨基糖苷類(lèi)農(nóng)用抗生素，主要組分有A、B、C、D、E、F等，從有效霉素的結(jié)構(gòu)中可以發(fā)現(xiàn)，有效霉素是由有效霉烯胺、有效霉胺和β-D-葡萄糖等結(jié)構(gòu)組成。
有效霉素糖苷鍵經(jīng)過(guò)水解，分解為有效霉亞基胺，有效霉亞基胺有A、B兩種，有效霉亞基胺再經(jīng)過(guò)分解，生成有效霉烯胺(valienamine)和有效霉胺(validamine)。
本發(fā)明涉及的有效霉烯胺，英文名為valienamine。其結(jié)構(gòu)式如

圖1(Chem.Rev.2003，1031955-1977)。
圖1 有效霉烯胺(valienamine)的化學(xué)結(jié)構(gòu)有效霉烯胺，又稱井岡胺或井岡霉烯胺，(1S，2S，3S，4R)-1-氨基-5-(羥甲基)環(huán)己-5-烯-2，3，4-三元醇；分子式為C7H13NO4，重要的基團(tuán)有一個(gè)伯氨基(-NH2)，一個(gè)碳碳雙鍵(C＝C)，一個(gè)羥甲基(-CH2OH)，三個(gè)羥基(-OH)。其鹽酸鹽(C7H13NO4·HCl)的[α]D23為+68.6°(1N-HCl)，五乙酸鹽(C17H23NO9)的熔點(diǎn)為95℃，[α]D23為+30.2°(CHCl3)，遇茚三酮顯色反應(yīng)。由于有效霉烯胺含有一個(gè)伯氨基(-NH2)，在水溶液中發(fā)生一級(jí)解離。
本發(fā)明涉及的有效霉胺，英文名為validamine，其結(jié)構(gòu)式如圖2(Chem.Rev.2003，1031955-1977)。
圖2 有效霉胺(validamine)的化學(xué)結(jié)構(gòu)有效霉胺，又稱井岡霉胺，分子式為C7H15NO4，一個(gè)伯氨基(-NH2)，一個(gè)羥甲基(-CH2OH)，三個(gè)羥基(-OH)，其鹽酸鹽(C7H13NO4·HCl)的[α]D23為+57.4°，熔點(diǎn)為229℃-232℃，(1N-HCl)的[α]D23為+60.6°，遇茚三酮顯色反應(yīng)。有效霉胺也含有一個(gè)伯氨基(-NH2)，在水溶液中發(fā)生一級(jí)解離。
有效霉烯胺、有效霉胺等環(huán)醇類(lèi)物質(zhì)是糖苷酶抑制劑的核心結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是一種較強(qiáng)的糖苷酶抑制劑。
糖苷酶是糖蛋白生物合成中寡糖鏈的修剪酶，對(duì)糖蛋白中的寡糖鏈的形成極為重要。糖鏈的組成與結(jié)構(gòu)是糖蛋白特異生物功能的識(shí)別部位，影響蛋白質(zhì)的折疊、溶解度、修飾、抗原性及生物活性等。糖苷酶活性對(duì)糖蛋白生物合成起著十分關(guān)鍵的作用，研究糖苷酶抑制劑，具有廣泛的應(yīng)用前景。
由于有效霉烯胺和有效霉胺的生物活性，人們對(duì)它的興趣與日劇增。這些年，是活躍的研究領(lǐng)域之一，尤其在日本和德國(guó)，而在我國(guó)，這方面的研究幾乎是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是有目的的從土壤中篩選到將有效霉素或有效霉亞基胺分解為有效霉烯胺和有效霉胺的新的微生物菌株；其次是提供一種利用該新微生物發(fā)酵分解或該新微生物的細(xì)胞或酶分解抗生素有效霉素、有效霉亞基胺生產(chǎn)有效霉烯胺和有效霉胺的方法。
本發(fā)明提供的微生物是寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonas)，為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，該菌株已于2004年3月15日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC No.M 204024。
根據(jù)文獻(xiàn)及專(zhuān)利查閱結(jié)果，已報(bào)道的能降解有效霉素的專(zhuān)利菌種包括假單胞菌屬(Pseudomonas，1個(gè)種，Pseudomonas denitrificans，反硝化假單胞菌)、黃桿菌屬(Flavobacterium，3個(gè)種)、嗜纖維菌屬(Cytophaga1個(gè)種，3個(gè)菌株)、土壤菌屬(Agrobacterium，2個(gè)種，其中Agrobacteriumradiobacter有5個(gè)菌株，Agrobacterium tumefaciens，1個(gè)種)、氣單胞菌屬(Aeromonas，5個(gè)種)。具體結(jié)果見(jiàn)附表1。
表1 降解有效霉素專(zhuān)利[特許公報(bào)(B2)]菌種匯總


各屬生理生化特征如下假單胞菌屬(Pseudomonas)反硝化假單胞菌(Pseudomonasdenitrificans)為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，極生鞭毛運(yùn)動(dòng)，氧化型代謝，通常氧化酶陽(yáng)性，有機(jī)化能營(yíng)養(yǎng)。好氧菌，能進(jìn)行反硝化作用。
土壤菌屬(Agrobacterium)短小桿菌，大小為1.5～0.3μm×0.6～1.0μm，單個(gè)成對(duì)排列，稀周毛，革蘭氏反應(yīng)陰性，不產(chǎn)生芽孢，菌落凸起，全緣光滑，無(wú)色素至淺灰黃色。在含糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量多糖黏液，不固定大氣氮，多數(shù)種可利用無(wú)機(jī)氮，放射土壤桿菌能從乳糖產(chǎn)生3-酮基乳糖，分解蛋白質(zhì)的能力弱或無(wú)，可廣泛利用碳水化合物、有機(jī)酸鹽和氨基酸為碳源，不能利用纖維素、淀粉、瓊脂糖、半乳糖及其他糖類(lèi)。
氣單胞菌屬(Aeromonas)細(xì)胞挺直，具圓端桿狀，常以單極毛運(yùn)動(dòng)，發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖和海藻糖，碳水化合物分解成酸，有的產(chǎn)氣，水解淀粉和糊精，水解酪蛋白，液化明膠，產(chǎn)生DNA酶，精氨酸脫氨酶，少數(shù)種不運(yùn)動(dòng)。革蘭氏反應(yīng)陰性，有呼吸和發(fā)酵兩種代謝類(lèi)型，氧化酶和過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，兼性厭氧菌。
嗜纖維菌屬(Cytophaga)不形成子實(shí)體，細(xì)胞桿狀，往往形成很長(zhǎng)的細(xì)胞鏈，好氧，能利用碳水化合物，代謝過(guò)程中需要大量CO2，能徹底分解纖維素、水解幾丁質(zhì)和瓊脂等多糖類(lèi)物質(zhì)，可以在界面上滑行。
黃桿菌屬(Flavobacterium)直桿狀，端圓，大小0.5μm×1.0～3.0μm。細(xì)胞內(nèi)不含PHB鹽，不形成內(nèi)生孢子，革蘭氏陰性，不運(yùn)動(dòng)，無(wú)滑動(dòng)或泳動(dòng)，嚴(yán)格好氧，在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，產(chǎn)生典型的黃色或橙色色素，有些菌株不產(chǎn)生色素，菌落半透明，圓形，隆起或微隆起，光滑且又光澤，全緣，接觸酶、氧化酶、磷酸酶均陽(yáng)性，不消化瓊脂，有機(jī)化能營(yíng)養(yǎng)。在低濃度蛋白胨培養(yǎng)基中不產(chǎn)氣。
綜合以上結(jié)果，本發(fā)明篩選到的新的菌株不屬于上述專(zhuān)利菌種的任何一種。
該新的菌株特征為菌落形態(tài)光滑，有光澤，邊緣整齊，白、灰或淡黃色，培養(yǎng)18h～36h的菌落直徑1mm～2mm左右；斜面菌苔白色，粘稠。
細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞內(nèi)不形成PHB顆粒，不運(yùn)動(dòng)，桿狀，菌體平均大小為0.4～0.5μm×1.3～1.4μm。革蘭氏陰性，無(wú)芽孢。
生理生化特征液化明膠，卵黃反應(yīng)陽(yáng)性，脂酶(土溫80)反應(yīng)陽(yáng)性，氧化酶陰性，接觸酶陽(yáng)性，吲哚反應(yīng)陰性，甲基紅陰性，V-P反應(yīng)陰性，產(chǎn)生H2S，不氧化分解葡萄糖，氧化型產(chǎn)酸，利用丙二酸鹽，利用檸檬酸鹽，不還原硝酸鹽，不能反硝化，不能利用淀粉，脲酶反應(yīng)陽(yáng)性，水解酪蛋白，不能分解乳糖產(chǎn)生3-酮基乳糖。
需生長(zhǎng)因子，產(chǎn)賴氨酸脫羧酶，水解幾丁質(zhì)；以天門(mén)冬酰胺作碳、氮源。
根據(jù)以上細(xì)菌學(xué)特征，這個(gè)新的菌株被鑒定屬于寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonas)的菌株，為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)。
用于本發(fā)明菌種CCTCC No.M 204024的培養(yǎng)基是一些含有可以被上述菌株利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，液體、固體均可，但是大量工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，液體培養(yǎng)基較為合適。培養(yǎng)基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等。作為碳源的有有效霉素、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山犁醇、油脂類(lèi)(豆油、豬油等)；作為氮源的有肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、氨鹽(硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸胺等)，肽類(lèi)(二肽、三肽等)；無(wú)機(jī)鹽類(lèi)有Na、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Co、Ni等金屬鹽類(lèi)和磷酸鹽、醋酸鹽等有機(jī)酸鹽類(lèi)；另可加有氨基酸類(lèi)(如谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等)、微生素(VB1、VB2、VB12、VC、VE、煙酸等)、核酸類(lèi)(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類(lèi)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，還可加入適量的消泡劑，如泡敵等。
可采用培養(yǎng)方式有靜置培養(yǎng)、搖動(dòng)培養(yǎng)、或通風(fēng)攪拌培養(yǎng)等，大量生產(chǎn)有效霉胺和有效霉烯胺時(shí)宜采用深層通風(fēng)攪拌培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一個(gè)重要特征是利用該新的微生物發(fā)酵或該新的微生物細(xì)胞或其酶分解底物有效霉素或有效霉素的中間產(chǎn)物有效霉亞基胺生產(chǎn)有效霉烯胺和有效霉胺。
本發(fā)明的新的微生物寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonas)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，CCTCC No.M 204024，與含碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基，底物為抗生素有效霉素，進(jìn)行發(fā)酵，然后對(duì)分解發(fā)酵液進(jìn)行分離有效霉胺和有效霉烯胺，并進(jìn)行提純。
本發(fā)明的培養(yǎng)基組成為(w/v，％)有效霉素0.5％～20％，(NH4)2SO40.5％～10％，KCl0.5％～5.0％，Na2HPO4·12H2O0.1％～10.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％～5.0％，MgSO40.01％～1.0％，以自來(lái)水配制，pH值6.0～8.0。
用本發(fā)明的新的菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)CCTCC No.M 20402)生產(chǎn)效霉烯胺和有效霉胺，其方法有(1)上述配制的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)滅菌，接入經(jīng)培養(yǎng)后的菌種CCTCC No.M 204024，斜面或用種子液接種，進(jìn)行培養(yǎng)，通常選擇溫度在20℃～40℃，以28℃～35℃較好，初始pH為6.0～8.0，以接近中性較好，培養(yǎng)時(shí)間為100h～180h較好，其中以150h左右為最好，此外反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行，但在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行為佳。在發(fā)酵過(guò)程中，pH值用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類(lèi)調(diào)節(jié)控制。該方法中培養(yǎng)基組成中的有效霉素既是微生物利用的碳源，又是被微生物分解的底物；底物有效霉素被分解為有效霉亞基胺，有效霉亞基胺有A、B兩種，有效霉亞基胺再經(jīng)過(guò)分解，生成有效霉烯胺(valienamine)和有效霉胺(validamine)。
(2)上述配制的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)滅菌，接入經(jīng)培養(yǎng)后菌種CCTCC No.M204024，用斜面或種子液接種，培養(yǎng)菌體，培養(yǎng)條件通常選擇溫度在20℃～40℃，以28℃～35℃較好，初始pH為6.0～8.0，以接近中性較好；在培養(yǎng)的過(guò)程中流加微生物分解的底物——有效霉素或有效霉亞基胺溶液，可以在菌體剛開(kāi)始生長(zhǎng)的時(shí)候流加，也可以在菌體生長(zhǎng)了一段時(shí)間后再進(jìn)行流加，流加入培養(yǎng)物中的底物有效霉素或有效霉亞基胺的濃度為1.0％～50.0％，流加的速度可以根據(jù)有效霉素或有效霉亞基胺的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，培養(yǎng)時(shí)間為100h～180h較好，其中以160h左右為最好，此外反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行，但在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行為佳；在發(fā)酵過(guò)程中，pH值的變化用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類(lèi)調(diào)節(jié)控制，制得發(fā)酵產(chǎn)物。
(3)上述配制的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)滅菌，接入經(jīng)培養(yǎng)后菌種CCTCC No.M204024，用斜面或種子液接種，培養(yǎng)菌體，培養(yǎng)條件通常選擇溫度在20℃～40℃，以28℃～35℃較好，初始pH為6.0～8.0，以接近中性較好；培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行離心分離，得到菌體；將得到的菌體加入底物有效霉素或底物有效霉亞基胺溶液中，利用菌體分解底物有效霉素或有效霉亞基胺，有效霉素或有效霉亞基胺的濃度為1.0％～20.0％，反應(yīng)時(shí)間為1h～100h較好，其中以70h左右為最好，此外反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行，但在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行為佳；在發(fā)酵過(guò)程中，pH值的變化用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類(lèi)調(diào)節(jié)控制，制得發(fā)酵產(chǎn)物。
(4)上述配制的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)滅菌，接入經(jīng)培養(yǎng)后菌種CCTCC No.M204024，用斜面或種子液接種，培養(yǎng)菌體，培養(yǎng)條件通常選擇溫度在20℃～40℃，以28℃～35℃較好，初始pH為6.0～8.0，以接近中性較好；培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行離心分離，得到菌體，然后將菌體破碎，提取出裂解酶；將提取的裂解酶加入到底物有效霉素或底物有效霉亞基胺溶液中，利用酶反應(yīng)分解底物有效霉素或有效霉亞基胺，有效霉素或有效霉亞基胺溶液的濃度為1.0％～20.0％，酶反應(yīng)時(shí)間為1h～100h較好，其中以10h左右為最好，此外反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行，但在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行為佳；在發(fā)酵過(guò)程中，pH值的變化用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類(lèi)調(diào)節(jié)控制，制得發(fā)酵產(chǎn)物。
將含有效霉烯胺和有效霉胺的分解發(fā)酵液進(jìn)行分離、純化，具體做法是從發(fā)酵液提取目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，可采用常規(guī)的發(fā)酵產(chǎn)物提取法。如過(guò)濾、離心、沉淀、結(jié)晶、重結(jié)晶、濃縮、干燥、冷凍干燥，吸附、離子交換、層析等。此外，有效霉烯胺和有效霉胺易溶于水、難溶于一般溶劑的堿性物質(zhì)，因而可以采用水溶性堿性物質(zhì)的分離、精制方法，例如離子交換樹(shù)脂、活性炭、多孔高聚物，葡聚糖凝膠、離子交換劑等進(jìn)行吸附后解吸或?qū)游觥?br> 完整的提取過(guò)程可分為預(yù)處理、中期純化和精制三個(gè)階段(1)預(yù)處理階段，這一階段的目標(biāo)是以盡可能少的操作步驟和盡可能簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)，從復(fù)雜的料液中分離出目標(biāo)產(chǎn)物、除去固體顆粒、濃縮。(2)中期純化階段，一般先采用非特異性和低分辨率的純化技術(shù)，隨后再采用高分辨率的層析法等技術(shù)主要是除去理化性質(zhì)和產(chǎn)物理化性質(zhì)相似的的雜質(zhì)。(3)精制階段，這是最后的加工程序，目的是進(jìn)一步除去雜質(zhì)，純化產(chǎn)物，其方法取決于產(chǎn)品的應(yīng)用目的，最常用的方法是結(jié)晶法，并結(jié)合干燥，獲得所需純度和一定形狀的產(chǎn)品。
用薄層層析和氣相分析的方法對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的有效霉烯胺和有效霉胺進(jìn)行分析，操作過(guò)程和實(shí)驗(yàn)條件按文獻(xiàn)[J.Antibiot，1984，371301～1305]和專(zhuān)利[EP0063456]的方法進(jìn)行，所得到的結(jié)果與它們完全一致。由此可見(jiàn)，利用本發(fā)明的微生物菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)CCTCC No.M 204024可以將有效霉素、有效霉亞基胺裂解為有效霉烯胺和有效霉胺。
本發(fā)明的微生物菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)CCTCC No.M 204024，不僅能在以有效霉素類(lèi)物質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而且對(duì)有效霉素的分解能力較強(qiáng)；利用CCTCC No.M 204024生產(chǎn)有效霉烯胺和有效霉胺，在較佳工藝條件下，有效霉素的分解率達(dá)到70％～90％，有效霉素A轉(zhuǎn)化為有效霉烯胺的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到40％～80％(即1摩爾的有效霉素A能轉(zhuǎn)化為0.40～0.80摩爾的有效霉烯胺)，有效霉亞基胺轉(zhuǎn)化為有效霉烯胺的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到35％～75％，同時(shí)得到有效霉胺；本發(fā)明的微生物菌株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)CCTCC No.M 204024適用于有效霉烯胺和有效霉胺的生產(chǎn)。
具體實(shí)施方案下面實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1培養(yǎng)基配方(重量/體積百分比，以下同)有效霉素1.0％，(NH4)2SO41.0％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O1.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，用自來(lái)水配制，用HCl溶液將pH調(diào)到6.0。
取100mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在2個(gè)250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)72小時(shí)作為種子液，備用。
取2L上述培養(yǎng)基，平均分裝入20個(gè)500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為2％(v/v)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20℃，培養(yǎng)時(shí)間為160h，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
收集上述發(fā)酵液1.8L，離心分離除去菌體，上清液上柱吸附(1L大孔弱酸性樹(shù)脂D113，NH4+)，用蒸餾水洗后，再用0.5mol/L的氨水洗脫，減壓濃縮，再將濃縮液上柱層析(500mL強(qiáng)堿層析樹(shù)脂Dowex 1×2，OH-)，用蒸餾水洗脫，分段收集洗出液，收集先流出來(lái)的含有效霉胺和后流出來(lái)的有效霉烯胺的部分，用薄層層析方法和氣相分析的方法進(jìn)行分析，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到0.31克有效霉胺和0.74克有效霉烯胺。
實(shí)施例2培養(yǎng)基配方 有效霉素17.0％，(NH4)2SO48.0％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O1.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0。
取500mL培養(yǎng)基，平均分裝在5個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為150h，反應(yīng)在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
收集上述發(fā)酵液400mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.56克有效霉胺和0.85克有效霉烯胺。
實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基配方有效霉素8.0％，(NH4)2SO46％，KCl0.1％，Na2HPO4·12H2O1.0％，NaH2PO4·2H2O0.16％，MgSO40.02％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.5。
種子培養(yǎng)基配方有效霉素1.0％，(NH4)2SO41％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O1.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.5％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.5。
取500mL種子培養(yǎng)基，平均分裝在5個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，在30℃搖床培養(yǎng)72小時(shí)作為種子液，備用。
取8L發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分裝在80個(gè)500mL的搖瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為5％(v/v)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為180h，反應(yīng)在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
收集上述發(fā)酵液7.5L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到3.19克有效霉胺和7.77克有效霉烯胺。
實(shí)施例4培養(yǎng)基配方 有效霉素2.0％，(NH4)2SO41.0％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O2.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.1％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7.0。
取500mL培養(yǎng)基，平均分裝在5個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)72小時(shí)作為種子液，備用。
取8L培養(yǎng)基，平均分裝在80個(gè)500mL的搖瓶中，滅菌。接入種子液，接種量為5％(v/v)，進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為100h，反應(yīng)在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
收集上述發(fā)酵液7.5升，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到2.11克有效霉胺和5.63克有效霉烯胺。
實(shí)施例5培養(yǎng)基配方 有效霉素1.5％，(NH4)2SO40.75％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O2.0％，NaH2PO4·2H2O1.0％，MgSO40.01％，用自來(lái)水配制，自然pH。
取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個(gè)250mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)72小時(shí)作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基5L，滅菌，接入種子液200mL，進(jìn)行發(fā)酵。
在接種后，開(kāi)始流加濃度為10％的底物有效霉素溶液1L，流加速度0.2mL/min；培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間為160h左右，通氣量2.5L/min，攪拌速度200r/min。
收集上述發(fā)酵液6L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到3.67克有效霉胺和6.53克有效霉烯胺。
實(shí)施例6培養(yǎng)基配方 有效霉素1.0％，(NH4)2SO40.7％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O0.1％，NaH2PO4·2H2O4.0％，MgSO40.01％，用自來(lái)水配制，自然pH。
取500mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在5個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)72小時(shí)作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基5L，滅菌，接入種子液200mL，進(jìn)行發(fā)酵。
在菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行流加濃度為2％的底物有效霉素溶液3L，流加速度0.5mL/min；培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)時(shí)間為180h左右，通氣量2.5L/min，攪拌速度200r/min。
收集上述發(fā)酵液8L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到3.08克有效霉胺和5.82克有效霉烯胺。
實(shí)施例7培養(yǎng)基配方 有效霉素1.0％，(NH4)2SO40.7％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O6.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.7％，用自來(lái)水配制，自然pH。
取500mL培養(yǎng)基，平均分裝在5個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在28℃搖床培養(yǎng)72小時(shí)作為種子液，備用。
在10L發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基6L作為發(fā)酵液，滅菌。接入種子液500mL。
在菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)流加濃度為50％的有效霉亞基胺溶液100mL，流加速度0.05mL/min；培養(yǎng)條件溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為120h，通氣量3.5L/min，攪拌速度200r/min。
收集上述發(fā)酵液6L，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到3.26克有效霉胺和7.01克有效霉烯胺。
實(shí)施例8培養(yǎng)基配方 有效霉素2.0％，(NH4)2SO41.2％，KCl4.0％，Na2HPO4·12H2O4.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，用自來(lái)水配制，用HCl調(diào)節(jié)pH為6.5。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個(gè)500mL三角瓶中，滅菌。接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到500mL濃度為5％的底物有效霉素溶液中，利用菌體分解有效霉素；反應(yīng)條件溫度30℃，初始pH為6.5，培養(yǎng)時(shí)間為100h左右，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
收集上述反應(yīng)液480mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.45克有效霉胺和1.21克有效霉烯胺。
實(shí)施例9培養(yǎng)基配方 有效霉素2.0％，(NH4)2SO41.2％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O1.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.5。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將這些菌體加入到500mL濃度為15％的底物有效霉亞基胺溶液中，利用菌體分解有效霉亞基胺；培養(yǎng)條件溫度32℃，初始pH為7.5，培養(yǎng)時(shí)間為40h左右，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。
收集上述反應(yīng)液580mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到1.03克有效霉胺和2.77克有效霉烯胺。
實(shí)施例10培養(yǎng)基配方 有效霉素2.0％，(NH4)2SO41.2％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O3.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，用自來(lái)水配制，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.5。
取1000mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將菌體加入到500mL濃度為3％的底物有效霉亞基胺溶液中，利用菌體分解有效霉亞基胺；培養(yǎng)條件溫度34℃，初始pH為7.5，培養(yǎng)時(shí)間為20h左右，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
收集上述反應(yīng)液580mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.53克有效霉胺和1.06克有效霉烯胺。
實(shí)施例11培養(yǎng)基配方 有效霉素2.0％，(NH4)2SO41.2％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O0.2％，NaH2PO4·2H2O1.5％，MgSO40.01％，用HCl溶液調(diào)節(jié)pH為6.0。
取2000mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在20個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，用超聲波將菌體破碎，再進(jìn)行離心、鹽析、透析、層析，提取出裂解酶，將上述提取出的裂解酶加入200mL濃度為8％的底物有效霉素溶液中，利用酶反應(yīng)分解有效霉素生產(chǎn)有效霉胺和有效霉烯胺。培養(yǎng)條件溫度25℃，初始pH為6.0，培養(yǎng)時(shí)間為10h左右，反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行。
收集上述反應(yīng)液200mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.15克有效霉胺和0.34克有效霉烯胺。
實(shí)施例12培養(yǎng)基配方 有效霉素2.0％，(NH4)2SO41.2％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O1.5％，NaH2PO4·2H2O0.8％，MgSO40.01％，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為8.0。
取2000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，用超聲波將菌體破碎，再進(jìn)行離心、鹽析、透析、層析，提取出裂解酶，將上述提取出的裂解酶，加入100mL濃度為20％的底物有效霉素溶液中，利用酶反應(yīng)分解有效霉素。反應(yīng)條件溫度32℃，初始pH為8.0，培養(yǎng)時(shí)間為80h左右，反應(yīng)可在靜置下進(jìn)行。
收集上述反應(yīng)液100mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.21克有效霉胺和0.39克有效霉烯胺。
實(shí)施例13培養(yǎng)基配方 有效霉素2.0％，(NH4)2SO41.2％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O1.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.8。
取2000mL培養(yǎng)基，平均分裝在20個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，用超聲波將菌體破碎，再進(jìn)行離心、鹽析、透析、層析，提取出裂解酶，將上述提取出的裂解酶，加入100mL濃度為10％的底物有效霉亞基胺溶液中，利用酶反應(yīng)分解有效霉亞基胺生產(chǎn)有效霉胺和有效霉烯胺。反應(yīng)條件溫度30℃，初始pH為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為30h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。
收集上述反應(yīng)液100mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.10克有效霉胺和0.31克有效霉烯胺。
實(shí)施例14培養(yǎng)基配方 有效霉素2.0％，(NH4)2SO41.2％，KCl0.5％，Na2HPO4·12H2O1.0％，NaH2PO4·2H2O0.1％，MgSO40.01％，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0。
取2000mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在20個(gè)500mL三角瓶中，滅菌，接入斜面菌種CCTCC No.M 204024，培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，用超聲波將菌體破碎，再進(jìn)行離心、鹽析、透析、層析，提取出裂解酶，將上述提取出的裂解酶，加入到100mL濃度為18％的底物有效霉亞基胺溶液中，利用酶反應(yīng)分解有效霉亞基胺。反應(yīng)條件溫度30℃，初始pH為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為50h左右，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。
收集上述反應(yīng)液100mL，進(jìn)行分離、純化，步驟同實(shí)施例1，得到0.33克有效霉胺和0.59克有效霉烯胺。
權(quán)利要求
1.一種有效霉烯胺和有效霉胺的微生物制備方法，其特征是所述的微生物是寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonas)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，CCTCC No.M 204024，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌與含碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基，底物為抗生素有效霉素，進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)分解發(fā)酵液進(jìn)行分離有效霉胺和有效霉烯胺，并進(jìn)行提純。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組成為(重量/體積)有效霉素0.5％～20.0％，(NH4)2SO40.5％～10.0％，KCl0.5％～5.0％，Na2HPO4·12H2O 0.1％～10.0％，NaH2PO4·2H2O 0.1％～5.0％，MgSO40.01％～1.0％，用自來(lái)水配制，調(diào)節(jié)pH值6.0～8.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是所述的發(fā)酵液的分離、提純步驟為反應(yīng)液離心，除去菌體，上清液上柱吸附(大孔弱酸性樹(shù)脂D113，NH4+)，用蒸餾水洗后，再用0.5mol/L的氨水洗脫，減壓濃縮，再將濃縮液上柱層析(強(qiáng)堿層析樹(shù)脂，Dowex1×2，OH-)，用蒸餾水洗脫，分段收集洗出液，用薄層層析方法進(jìn)行分析，收集先流出來(lái)的含有效霉胺和后流出來(lái)的有效霉烯胺的部分，分別進(jìn)行真空冷凍干燥，得到有效霉胺和有效霉烯胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征是在接入CCTCC No.M 204024后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)基中有效霉素的濃度0.5％～20.0％，培養(yǎng)條件溫度20℃～40℃，初始pH為6.0～8.0，培養(yǎng)時(shí)間為100h～180h，在靜置下進(jìn)行發(fā)酵。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基中有效霉素的濃度為1.0％～10.0％，發(fā)酵溫度28℃～35℃，初始pH為6.8～7.2，培養(yǎng)時(shí)間為150h，在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是在培養(yǎng)基中接入菌種CCTCC No.M 204024后，在培養(yǎng)過(guò)程中流加入底物有效霉素，在菌體剛開(kāi)始生長(zhǎng)的時(shí)候開(kāi)始流加，培養(yǎng)條件溫度在20℃～40℃，初始pH為6.0～8.0，培養(yǎng)時(shí)間為100h～180h，在靜置下進(jìn)行發(fā)酵。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后再進(jìn)行流加底物有效霉素，培養(yǎng)條件28℃～35℃，初始pH為6.5～7.5，培養(yǎng)時(shí)間150h，在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行發(fā)酵。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是在培養(yǎng)基中接入菌種CCTCC No.M 204024后并培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，將菌體加入到底物有效霉素溶液中，利用菌體分解底物有效霉素，培養(yǎng)條件溫度在20℃～40℃，初始pH為6.0～8.0，培養(yǎng)時(shí)間為1h～100h，在靜置下進(jìn)行發(fā)酵。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是將菌體加入到底物有效霉素溶液中，培養(yǎng)條件溫度28℃～35℃，初始pH為6.5～7.5，培養(yǎng)時(shí)間為70h，在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行發(fā)酵。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是在培養(yǎng)基中接入菌種CCTCC No.M 204024后培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行離心分離，得到菌體，再用超聲波法將菌體破碎，提取出裂解酶，將裂解酶加入到有效霉素溶液中，培養(yǎng)條件溫度20℃～40℃，初始pH為6.0～8.0，培養(yǎng)時(shí)間為1h～100h，在靜置下進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征是將裂解酶加入到底物有效霉素溶液中，培養(yǎng)條件溫度28℃～35℃，初始pH為6.5～7.5，培養(yǎng)時(shí)間為10h，在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或6～11所述的制備方法，其特征是底物可以為有效霉亞基胺。
全文摘要
一種有效霉烯胺和有效霉胺的微生物制備方法，涉及的微生物為寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonas)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，CCTCC No.M 204024，通過(guò)利用這種微生物發(fā)酵分解、或這種微生物的細(xì)胞或酶等分解底物有效霉素或有效霉亞胺，生產(chǎn)有效霉烯胺和有效霉胺兩種環(huán)醇類(lèi)物質(zhì)，培養(yǎng)基組成為(重量/體積)有效霉素0.5％～20.0％,(NH
文檔編號(hào)C12P13/00GK1563397SQ20041001751
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月5日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 陳小龍, 薛亞平, 王遠(yuǎn)山, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)