專利名稱：一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法。
背景技術(shù)：
尿酸氧化酶(尿酸氧化還原酶，EC 1.7.3.3，Urate Oxidase，Uricase)是一種可將尿酸氧化為尿囊素的蛋白酶。機(jī)體嘌呤核苷酸分解產(chǎn)生的產(chǎn)物黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下產(chǎn)生尿酸，尿酸進(jìn)一步在尿酸氧化酶、尿囊素酶、尿囊酸酶、尿素酶作用下分解為CO2和NH3。不同物種尿酸分解的程度不同，在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生的大部分次黃嘌呤和鳥嘌呤是通過磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤諉瘟姿岷网B苷單磷酸，但仍有10％要被分解，排除體外。人體中，尿酸是嘌呤降解的最終產(chǎn)物，并隨尿排除體外。
正常男性成人24小時尿尿酸總量小于600mg，病理導(dǎo)致的尿酸大量產(chǎn)生往往高于這個值而出現(xiàn)許多臨床癥狀。惡性腫瘤的增殖導(dǎo)致核酸分解代謝加強(qiáng)，嘌呤代謝產(chǎn)生大量尿酸，病人出現(xiàn)高尿酸血癥(Hyperuricemia)。腫瘤放化療過程中也因為細(xì)胞大量裂解而出現(xiàn)伴隨高尿酸血癥的腫瘤消退綜合癥(tumor lysissyndrome，TLS)，病人體內(nèi)一系列生理功能發(fā)生改變電介質(zhì)紊亂、嘌呤代謝產(chǎn)生大量的尿酸、極性腎衰、虛弱、痙攣、心律不齊、腎結(jié)石或者死亡。在淋巴瘤、白血病、大塊腫瘤的治療中更容易出現(xiàn)。TLS增加了胞內(nèi)物質(zhì)如鉀、磷、鈣、尿酸等的濃度，大大超過了人體腎臟的排泄能力，導(dǎo)致高尿酸、高鉀、高磷、高鈣等癥，最后導(dǎo)致腎衰的形成。
痛風(fēng)是另一類與尿酸水平有關(guān)的疾病，由于遺傳性或獲得性病因?qū)е锣堰蚀x障礙和血清尿酸持續(xù)升高所引起。升高的血尿酸水平導(dǎo)致在關(guān)節(jié)中發(fā)作形成尿酸鈉水合物微結(jié)晶時，就發(fā)生痛苦的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，而且會反復(fù)發(fā)作。結(jié)晶沉淀物在關(guān)節(jié)、骨骼、軟組織和軟骨的沉積稱為痛風(fēng)石。尿酸鹽沉積于腎小管引起炎癥，腎小球纖維化等病變。痛風(fēng)病人以男性為主，約占95％，且發(fā)病高峰在30-40歲之間。痛風(fēng)發(fā)生的主要原因是內(nèi)源性產(chǎn)尿酸過多，外源性富含嘌呤的食物攝入過多，尿酸排泄減少。
我國癌癥腫瘤發(fā)病病人2000年為180～200萬人，占世界的五分之一，預(yù)計2020年，全球每年新發(fā)癌癥病人為1500萬人。我國近20年惡性腫瘤在死因中的構(gòu)成比例已由12.6％升至17.9％，每年新發(fā)病人數(shù)約170萬，大部分在發(fā)病以后采用化療和放療等手段治療，化療與放療時細(xì)胞分裂過盛和急劇破壞，核酸分解突然增多產(chǎn)生大量尿酸，導(dǎo)致高尿酸血癥，血尿酸濃度高達(dá)2380μmol/L～3570μmol/L(40～60mg/dl)。引起結(jié)石和腎衰，病人痛苦之極。
目前控制TLS的辦法有飲食控制、水合、堿化酸毒癥，用別嘌呤醇和尿酸氧化酶利尿等手段。但是別嘌呤醇抑制黃嘌呤氧化酶的活性，阻滯了黃嘌呤和次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，干擾6-巰基嘌呤的代謝，影響腫瘤的治療。別嘌呤醇因為抑制黃嘌噙氧化酶阻滯尿酸形成，增加了腎臟排泄尿酸前體(次黃嘌呤和黃嘌呤)的負(fù)荷。與次黃嘌呤不同，黃嘌呤在尿中比尿酸難溶。有時別嘌呤醇治療的病人也可出現(xiàn)黃嘌呤腎病和結(jié)石。此外，對于病人體內(nèi)存留的尿酸的排泄，使用別嘌醇治療無效。另外用別嘌呤醇治療的患者，2％產(chǎn)生過敏性反應(yīng)，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的超敏反應(yīng)綜合癥。對于急性高尿酸血癥病人，別嘌呤醇因為起效時間長而使病人不能及時得到治療。而尿酸氧化酶能夠?qū)⒛蛩嵫趸癁槟蚰宜?，很容易被排出體外。極大地緩解了高尿酸導(dǎo)致的綜合癥對病人產(chǎn)生的痛苦，提高了癌癥、腫瘤病人的生活質(zhì)量。
從黃曲霉(Aspergillus fiavus)提取的天然尿酸氧化酶Uricozyme已經(jīng)在歐洲上市使用有20年的歷史，經(jīng)注射給藥用于治療與白血病化療有關(guān)的嚴(yán)重高尿酸血癥。美國也于1997年開始將該產(chǎn)品用于白血病患者。與別嘌呤醇相比，尿酸氧化酶降低血尿酸水平迅速而專一。痛風(fēng)病人給予尿酸氧化酶可阻斷急性發(fā)作并減小痛風(fēng)石的體積。
從培養(yǎng)的黃曲霉提取尿酸氧化酶不但培養(yǎng)周期長、產(chǎn)率低，而且容易受病原體污染?；蚬こ碳夹g(shù)為大量制備尿酸氧化酶開辟了新的道路。1992年，Legoux等克隆了黃曲霉尿酸氧化酶基因，并在大腸桿菌中嘗試表達(dá)，產(chǎn)物以可溶解的形式在胞內(nèi)表達(dá)，并且具有酶活性，但表達(dá)量低，只有菌體全蛋白的4％，不具有產(chǎn)業(yè)化開發(fā)價值。天然黃曲霉尿酸氧化酶N端乙酰化有利于酶的穩(wěn)定及抵抗蛋白酶降解，這對培養(yǎng)周期長的表達(dá)系統(tǒng)十分重要，但對活性并不是必須的。同年，Chevalet用尿酸氧化酶缺陷的黃曲霉菌株進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)化菌株不能以尿酸為唯一氮源，而且容易恢復(fù)為野生型。而Leplatois等在這一年取得了很大進(jìn)展，他們在釀酒酵母中表達(dá)黃曲霉尿酸氧化酶基因，表達(dá)量達(dá)到13％。另外2000年，Hongoh等將Nilaparvata Iugens尿酸氧化酶基因在大腸桿進(jìn)行融合表達(dá)，90％的目標(biāo)蛋白以包含體形式存在，表達(dá)量估計有20％。國內(nèi)朱獻(xiàn)軍等于2001年在大腸桿菌中克隆表達(dá)了產(chǎn)朊假絲酵母的尿酸氧化酶基因，產(chǎn)物以可溶形式表達(dá)，占可溶性蛋白的30％。
目前的黃曲霉尿酸氧化酶大腸桿菌表達(dá)體系存在的主要問題是表達(dá)量不高，無法大規(guī)模生產(chǎn)。酵母表達(dá)的產(chǎn)物表達(dá)量達(dá)13％，培養(yǎng)周期長，成本高。因此有必要采用更高效表達(dá)尿酸氧化酶的制備體系，以滿足臨床的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)量高的黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法。
黃曲霉尿酸氧化酶cDNA序列是已知的，編碼一個全長301個氨基酸的蛋白質(zhì)。黃曲霉尿酸氧化酶的編碼序列可以來源于基因文庫，或根據(jù)文獻(xiàn)報道的黃曲霉尿酸氧化酶cDNA序列全基因合成，還可以設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增獲得。
本發(fā)明一種重組黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，包括如下步驟(1)、黃曲霉尿酸氧化酶基因的獲得；(2)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌將合成的黃曲霉尿酸氧化酶cDNA片段插入到表達(dá)載體質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌；(3)、陽性克隆的篩選、培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)篩選出陽性克隆在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)使目標(biāo)蛋白表達(dá)；(4)、融合蛋白的分離、純化首先將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經(jīng)離心得到破菌液上清，然后對破菌液上清用層析技術(shù)純化；(5)、融合蛋白的酶切，其中所述的表達(dá)載體質(zhì)粒是pET-15b、pET-19b、pET-30a-c、pET-32a-c；黃曲霉尿酸氧化酶基因的獲得是通過全基因合成或通過設(shè)計引物，再PCR獲得；所述的酶切位點(diǎn)是Nde I/BamH I或Nco I/BamH I位點(diǎn)；步驟(3)中是用氨芐青霉素做抗性篩選；步驟(3)中培養(yǎng)基培養(yǎng)的溫度控制在28℃～40℃，優(yōu)選在30℃～35℃；步驟(3)中誘導(dǎo)表達(dá)使用濃度為0.1～1.5mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，優(yōu)選0.4～1.0mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑；層析技術(shù)是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析和親和層析中的一種或多種方法；步驟(5)中酶切所用的酶是凝血酶或牛腸激酶。
本發(fā)明一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其表達(dá)方案簡單，表達(dá)量高，純化工藝簡單，收率高。表達(dá)產(chǎn)物可溶，不需要復(fù)性，直接用層析方法進(jìn)行純化，純化收率大大提高，適合大規(guī)模制備。


圖1本發(fā)明表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；圖2融合蛋白的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖；
其中1和8蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上而下分別為97.4kd、66.2kd、43kd、31kd、20.1kd、14.4kd；2未誘導(dǎo)全菌；3未誘導(dǎo)菌體破菌上清；4未誘導(dǎo)菌體破菌沉淀；5誘導(dǎo)全菌；6誘導(dǎo)菌體破菌上清；7誘導(dǎo)菌體破菌沉淀。
圖3離子交換層析圖譜；圖4融合蛋白的酶切后的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖；其中1未加酶對照；2酶2000稀釋作用結(jié)果3酶200稀釋作用結(jié)果；4酶20稀釋作用結(jié)果；5酶對照。
圖5疏水層析圖譜；圖6活性分析結(jié)果圖。
具體實施例方式
實施例11、黃曲霉尿酸氧化酶基因的獲得表1黃曲霉尿酸氧化酶cDNA序列

表達(dá)載體采用pET-15b(Invitrogen)，宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。根據(jù)文獻(xiàn)報道的黃曲霉尿酸氧化酶cDNA序列，見表1，合成30段互補(bǔ)的寡核苷酸，并在5’端和3’端分別引如酶切位點(diǎn)Nde I、BamH I，按分子克隆的常規(guī)方法，首先用T4噬菌體多核苷酸激酶37℃處理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩爾混合，94℃變性5min，立即65℃退火10min，然后加入T4連接酶，16℃連接過夜。
2、表達(dá)載體pET-15b-202的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化宿主菌pET-15b質(zhì)粒用Nde I、BamH I雙酶切回收大片段，與合成的黃曲霉尿酸氧化酶cDNA片段連接，20μL反應(yīng)體系基因片段與載體大片段的比例為10∶1，加T4DNA連接酶300單位，15℃連接過夜，取10μL連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜，獲得工程菌經(jīng)進(jìn)一步篩選，工程菌構(gòu)建過程見圖1，3、陽性克隆的篩選、培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)氨芐青霉素做抗性篩選，得到陽性克隆pET-15b-Uox。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定。陽性轉(zhuǎn)化子用通用引物進(jìn)行序列分析，結(jié)果克隆序列與設(shè)計序列完全一致。
接種陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。
(4)、融合蛋白的分離、純化收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，然后收集上清和沉淀，用12％SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果目標(biāo)蛋白主要存在于破菌后的上清液中，電泳結(jié)果見圖2，根據(jù)電泳結(jié)果的條帶分析，誘導(dǎo)全菌的5號跑膠帶中的目標(biāo)蛋白的表達(dá)量應(yīng)該在30％以上。將收集到的破菌上清液用離子交換層析法分離純化，其過程為用pH值為8.5的20mmol/L Tris.CL緩沖液稀釋，使其電導(dǎo)率小于5mS/cm。用同樣的緩沖液平衡CM柱，上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用0.01～0.5mol/LD NaCL梯度洗脫，收集目標(biāo)蛋白峰，層析圖譜見圖3。
(5)、融合蛋白的酶切、純化將離子交換目標(biāo)蛋白峰稀釋后使目標(biāo)蛋白的濃度達(dá)到1mg/mL，樣品對凝血酶切割緩沖液(50mmol/L Tris.CL，150mmol/L NaCL，2.5mmol/L CaCL2，pH 7.5)透析進(jìn)行緩沖液交換，然后加入20mg/mL(0.5U/mL)的凝血酶，稀釋比例分別為20、200、2000倍，25℃保溫過夜酶切，12％SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖4，20、200倍稀釋的凝血酶切割效果很好。經(jīng)酶切后的目標(biāo)蛋白補(bǔ)加(NH4)2SO4使終濃度為1.0-1.5mol/L，樣品上用1.2mol/L(NH4)2SO4，20mmol/L PB，pH7.4的緩沖液平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，通過降低鹽濃度梯度洗拖，收集目標(biāo)蛋白峰，見圖5的疏水層析圖譜。
得到的疏水層析峰經(jīng)Sephadex G-25脫鹽，平衡液為20mmol/L PB，pH7.4。樣品脫鹽后即為精細(xì)純化的黃曲霉尿酸氧化酶。
實施例2黃曲霉尿酸氧化酶活性分析純化后的黃曲霉尿酸氧化酶用文獻(xiàn)報道的方法(Legoux R.et al.，J.Biol.Chem.，1992，267，(12)，8565-8570)分析酶活性，3ml緩沖液體系(TEA buffer，7.5g三乙醇胺；0.38gEDTA)中含尿酸0.18μmol，pH 8.9，30℃保溫，檢測波長292nm，每分鐘將1μmol尿酸氧化為尿囊酸所需的酶量為一個酶活性單位。加入1mg/mL的酶1μL、2μL、5μL、10μL，反應(yīng)結(jié)束后測吸收值，結(jié)果見圖6。
權(quán)利要求
1.一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)、黃曲霉尿酸氧化酶基因的獲得；(2)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌將合成的黃曲霉尿酸氧化酶cDNA片段插入到表達(dá)載體質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌；(3)、陽性克隆的篩選、培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)篩選出陽性克隆在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)使目標(biāo)蛋白表達(dá)；(4)、融合蛋白的分離、純化首先將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經(jīng)離心得到破菌液上清，然后對破菌液上清用層析技術(shù)純化；(5)、融合蛋白的酶切、純化將部分純化的融合蛋白經(jīng)酶切后用層析技術(shù)純化得到黃曲霉尿酸氧化酶，其中所述的表達(dá)載體質(zhì)粒是pET系列載體質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于pET系列載體質(zhì)粒是pET-15b、pET-19b、pET-30a-c、pET-32a-c。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于黃曲霉尿酸氧化酶基因的獲得是通過全基因合成或通過設(shè)計引物，再PCR獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于所述的酶切位點(diǎn)是Nde I/BamHI或Nco I/BamHI位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于步驟(3)中是用氨芐青霉素做抗性篩選。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于步驟(3)中培養(yǎng)的溫度控制在28℃～40℃，優(yōu)選在30℃～35℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于步驟(3)中誘導(dǎo)表達(dá)使用濃度為0.1～1.5mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，優(yōu)選0.4～1.0mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于層析技術(shù)是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析和親和層析中的一種或多種方法。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其特征在于步驟(5)中酶切所用的酶是凝血酶或牛腸激酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其包括如下步驟(1)、黃曲霉尿酸氧化酶基因的獲得；(2)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌(3)、陽性克隆的篩選、培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)(4)、融合蛋白的分離、純化(5)、融合蛋白的酶切、純化，其中所述的表達(dá)載體質(zhì)粒是pET系列載體質(zhì)粒，本發(fā)明一種重組黃曲霉尿酸氧化酶的制備方法，其表達(dá)方案簡單，表達(dá)量高，純化工藝簡單，收率高，表達(dá)產(chǎn)物可溶，不需要復(fù)性，直接用層析方法進(jìn)行純化，純化收率大大提高，適合大規(guī)模制備。
文檔編號C12N9/02GK1690197SQ200410017948
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月27日
發(fā)明者劉國安, 方永強(qiáng), 張玉良 申請人:杭州北斗生物技術(shù)有限公司