專利名稱：微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白同化激素類藥物的生產(chǎn)方法，特別是一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮的制備工藝。
背景技術(shù)：
美雄酮(Methandienone)即去氫17α-甲基睪丸素(Dehydro-17α-methyltestosterone)，化學(xué)名17β-羥基-17α-甲基雄甾-1，4-二烯-3-酮(17β-hydroxy-17α-methylandrosta-1，4-dien-3-one)，俗稱大力補(bǔ)(Dianabol)，是一種蛋白質(zhì)同化激素，能明顯地促進(jìn)蛋白質(zhì)合成(同化作用)，減少氨基酸分解(異化作用)，使肌肉增長，體重增加，降低氮質(zhì)血癥，同時(shí)能夠促進(jìn)骨髓造血功能，主要用于蛋白質(zhì)同化或吸收不足，以及蛋白質(zhì)分解亢進(jìn)或損失過多等情況，如嚴(yán)重?zé)齻?、手術(shù)后慢性消耗性疾病、老年骨質(zhì)疏松和腫瘤惡液汁等病人。有報(bào)道稱對(duì)治療再生障礙性貧血有較好的療效。美雄酮與甲基睪丸素相比較，其具有同化作用強(qiáng)，但雄性激素樣作用弱的優(yōu)點(diǎn)。
美雄酮是由甲基睪丸素經(jīng)C1，2脫氫生成，其反應(yīng)過程如下所示 自20世紀(jì)50年代人們已經(jīng)開始對(duì)其進(jìn)行研究，已有不少專利文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道。主要分為化學(xué)脫氫和生物脫氫兩種方法，化學(xué)脫氫研究比較成熟，以SeO2脫氫法為代表早已在國內(nèi)外用于生產(chǎn)。隨著新型試劑的出現(xiàn)和有機(jī)合成技術(shù)的提高，許多化學(xué)脫氫的新方法也隨之出現(xiàn)。羅馬尼亞大學(xué)ITorrini I等利用Ti(NO3)3對(duì)△1-3-氧-甾族化合物或△4-3-氧-甾族化合物在室溫下進(jìn)行脫氫反應(yīng)制備△1，4-3-氧-甾族化合物；浙江大學(xué)姚愛平等采用DDQ(2，3-二氯-5，6-雙睛苯醌)將甲基睪丸素脫氫制備成去氫甲基睪丸素。國內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)也普遍采用化學(xué)脫氫法在17α-甲基睪丸素A環(huán)C1，2引入雙鍵生成去氫17α-甲基睪丸素，即SeO2脫氫法，為使產(chǎn)品去氫17α-甲基睪丸素符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，在后處理上通常采用復(fù)雜的層系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，從而加大生產(chǎn)成本。用微生物法在17α-甲基睪丸素A環(huán)C1，2引入雙鍵生成去氫17α-甲基睪丸素國內(nèi)外也有相關(guān)報(bào)道，Buki等比較了一株諾卡氏菌(Nocardia)和一株分支桿菌(Mycobacterium)對(duì)各種17α-甲基-17β-羥基-雄甾烷類甾體的轉(zhuǎn)化作用；Protiva等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同的微生物按不同的代謝途徑轉(zhuǎn)化17α-甲基-17β-羥基-雄甾烷-3-酮；Ghiocel Radu R等用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌在兩種液相系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化甲基睪丸素制備去氫甲基睪丸素，利用離子交換柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終收率45-50％。SCHERING AG(DG)公司就采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌發(fā)酵3-氧-△4-甾類化合物生成3-氧-△1，4-甾類化合物申請(qǐng)專利(EP 0054810)，其中甲基睪丸素脫氫生成去氫甲基睪丸素，投料濃度0.0375％，收率82.7％。法幼華等比較了諾卡氏菌和節(jié)桿菌兩屬共62株菌對(duì)17α-甲基表雄醇和17α-甲基睪丸素的脫氫，發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌9-2能從17α-甲基表雄醇一步生成去氫17α-甲基睪丸素，轉(zhuǎn)化率85％；中科院上海有機(jī)化學(xué)所張麗青等人采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌和諾卡氏菌混合菌株轉(zhuǎn)化17α-甲基-17β-羥基-雄甾-3-酮一步反應(yīng)同時(shí)在C1和C4引入兩個(gè)雙鍵生成17α-甲基-17β-羥基-△1，4雄甾二烯-3-酮即去氫甲基睪丸素，產(chǎn)率50％。盡管利用微生物轉(zhuǎn)化法制備去氫甲基睪丸素在國內(nèi)外已有相關(guān)研究，甚至有的報(bào)道收率能達(dá)到80％以上，但是這些研究僅是在實(shí)驗(yàn)室階段的研究，規(guī)模小、操作復(fù)雜，而且投料濃度很低，一般不超過千分之一。
綜上所述，不難看出，影響生物發(fā)酵法生產(chǎn)美雄酮推廣應(yīng)用的關(guān)鍵問題是投料濃度、生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)成本以及操作的難易程度。為此，研究和開發(fā)一種工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的美雄酮制備、分離提取方法是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種制備不含對(duì)人體有害物質(zhì)、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)環(huán)境達(dá)到環(huán)保要求，同時(shí)投料濃度高、轉(zhuǎn)化率高、收率高、成本低的微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮的制備工藝。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮的制備工藝，該工藝包括以下步驟一、制備用于轉(zhuǎn)化17α-甲基睪丸素的發(fā)酵液1、菌種懸液的制備生產(chǎn)菌種為天津科技大學(xué)應(yīng)用微生物教研室保存的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌，編號(hào)BY31250，將該生產(chǎn)菌株在瓊脂斜面上30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，菌體在斜面上已完全長好，從外觀上看呈淡乳黃色，豐滿而有光澤；在光學(xué)顯微鏡下，菌體形狀多數(shù)呈桿狀，有部分呈折角狀。生產(chǎn)菌株瓊脂斜面4℃保藏待用，保藏時(shí)間以在20d內(nèi)為宜。其中，制作菌體種子懸液采用的液體為無菌水或新鮮種子培養(yǎng)基，滅菌條件為121℃，滅菌時(shí)間20～25min。這是因?yàn)樾泵娴蜏乇２胤ㄊ且环N簡(jiǎn)便、短期、過渡性的保藏方法，而斜面保藏時(shí)間對(duì)菌種質(zhì)量及甾體轉(zhuǎn)化能力均有一定的影響。實(shí)驗(yàn)分別用新鮮斜面及4℃冰箱保存5天、10天、15天、20天、25天、30天的菌種進(jìn)行甲基睪丸素的脫氫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如附圖1所示。
由附圖1可知，斜面在4℃冰箱保存20d之內(nèi)，美雄酮的轉(zhuǎn)化率僅下降了6.45％。而在4℃冰箱保存30d，美雄酮的轉(zhuǎn)化率下降了30.6％，菌種性能衰退較大。因此，菌種保藏時(shí)間以在20d之內(nèi)為宜。
2、一級(jí)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基由碳源、氮源和無機(jī)磷組成，即葡萄糖 8～12g/L玉米漿 10～15g/L酵母膏 3～7g/LKH2PO41.5～2.8g/LpH 6.4～7.0將制備好的種子懸液加入到上述種子培養(yǎng)基中，滅菌條件為120～125℃，15～25min；在搖床轉(zhuǎn)速160r/min下，30～33℃培養(yǎng)18～22h，即可得到適合接種的種子培養(yǎng)物。
3、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖 12～15g/L玉米漿 15～20g/L酵母膏 3～7g/LKH2PO41.5～2.8g/LpH 7.0～7.2將生長良好的種子培養(yǎng)液按2％～5％(v/v)的接種量接入到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中；在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平在10％～30％，通過流加20％(w/v)的NaOH來控制pH值在7.0～7.2，培養(yǎng)22～24h，即可得到適宜于投料的菌體培養(yǎng)液。
4、底物17α-甲基睪丸素的轉(zhuǎn)化將底物17α-甲基睪丸素粉碎，粒度14～16μ，在無菌條件下迅速投入到培養(yǎng)好的發(fā)酵液中，并加入相對(duì)于發(fā)酵液體積4％～7％的工業(yè)乙醇，投料量為12～20g/L發(fā)酵液體積。在轉(zhuǎn)化過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平在20％～40％，通過流加20％(w/v)的NaOH來控制pH值在7.0～7.4，轉(zhuǎn)化36～48h；在轉(zhuǎn)化階段后期，通過薄層層析或高效液相來控制發(fā)酵終點(diǎn)。
二、從發(fā)酵液中提取、分離美雄酮該過程包括發(fā)酵液過濾、濾餅在甲醇中回流、去除菌體、成腙反應(yīng)、過濾得粗品及水解后底物回收(見附圖2)。具體步驟包括如下1、發(fā)酵液除去菌體轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將發(fā)酵液減壓過濾，濾餅烤干。將濾餅加入到反應(yīng)罐中，并加入為濾餅重量10～15倍量的甲醇，回流溶解至澄清，回流時(shí)間1～2h，過濾除去菌體。
2、產(chǎn)物的分離與精制在濾液中加入一定量的Girard試劑和冰醋酸，所用Girard(吉拉得)試劑是上海試劑一廠生產(chǎn)的?；亓?～6小時(shí)，減壓濃縮，加入8～10倍體積的水，室溫?cái)嚢?，過濾即得美雄酮粗品，用乙醇或甲醇精制即得質(zhì)量符合BP80版標(biāo)準(zhǔn)的美雄酮成品。
3、底物的回收在濾液中加入濃硫酸調(diào)節(jié)pH值在1.5～3的范圍，室溫下靜置6～8小時(shí)，未轉(zhuǎn)化的底物即可結(jié)晶析出，過濾、水洗、干燥即得回收底物，回收底物可以被所用菌種再次轉(zhuǎn)化為符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的美雄酮。
本發(fā)明的制備方法包括美雄酮的微生物轉(zhuǎn)化和美雄酮的提取、分離兩方面技術(shù)，其有益效果是利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮所采用的工藝與化學(xué)脫氫法制備相比較，所得產(chǎn)品美雄酮同樣都達(dá)到BP80版標(biāo)準(zhǔn)的情況下，原料成本降低了40％以上，成品收率提高了30％以上。同時(shí)，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)工藝對(duì)周圍環(huán)境污染非常輕微，幾乎沒有污染，生產(chǎn)中為常壓工作，操作工序簡(jiǎn)單，無其它危險(xiǎn)。應(yīng)用本工藝方法生產(chǎn)美雄酮周期短、收率高，可帶來較高的經(jīng)濟(jì)效益。而且有利于開拓更為廣闊的市場(chǎng)，滿足社會(huì)的需求。


圖1為本發(fā)明的菌種保藏時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響圖表；圖2為本發(fā)明的發(fā)酵液的提取、分離過程流程圖。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮的制備工藝加以說明。
實(shí)施例1生產(chǎn)菌種為天津科技大學(xué)應(yīng)用微生物教研室保存的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌，編號(hào)BY31250，將該生產(chǎn)菌株在瓊脂斜面上30℃恒溫培養(yǎng)2天，4℃保藏5d使用。其中，制作菌體種子懸液采用的液體為無菌水或新鮮種子培養(yǎng)基，滅菌條件為121℃ 20～25min。
種子培養(yǎng)基由碳源、氮源和無機(jī)磷組成，即葡萄糖 8g/L玉米漿 10g/L酵母膏 3g/LKH2PO41.5g/LpH 6.4將制備好的種子懸液加入到上述種子培養(yǎng)基中，滅菌條件為121℃25min；在搖床轉(zhuǎn)速60r/min下，30℃培養(yǎng)22h，即得適合接種的種子培養(yǎng)物。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖 15g/L玉米漿 20g/L酵母膏 7g/L
KH2PO42.8g/LpH 7.2將生長良好的種子培養(yǎng)液按5％(v/v)的接種量接入到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中；在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平在10％～30％，通過流加20％(w/v)的NaOH來控制pH值在7.0～7.2，培養(yǎng)24h，即得適宜于投料的菌體培養(yǎng)液。
將底物17α-甲基睪丸素(17α-methyltestosterone)粉碎，粒度14～16μ，在無菌條件下迅速投入到培養(yǎng)好的發(fā)酵液中，并加入相對(duì)于發(fā)酵液體積4％的工業(yè)乙醇，投料量為1.2g/L發(fā)酵液體積，在轉(zhuǎn)化過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平在30％左右，通過流加20％(w/v)的NaOH來控制pH值在7.2，轉(zhuǎn)化36h；在轉(zhuǎn)化階段后期，通過薄層層析或高效液相來控制發(fā)酵終點(diǎn)。
轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將發(fā)酵液減壓過濾，濾餅烤干。將濾餅加入燒瓶中，并加入濾餅重量的10～15倍量的甲醇，回流溶解至澄清，回流時(shí)間1～2h，過濾除去菌體。在濾液中加入一定量的Girard試劑和冰醋酸，回流4～6小時(shí)，減壓濃縮，加入8～10倍體積的水，室溫?cái)嚢?，過濾即得美雄酮粗品，用乙醇精制即得符合BP80版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的美雄酮成品。在濾液中加入濃硫酸調(diào)節(jié)pH值在1.5～3的范圍，室溫下靜置6～8小時(shí)，未轉(zhuǎn)化的底物即可結(jié)晶析出，將結(jié)晶過濾、水洗、干燥即得回收底物，回收底物可以被所用菌種再次轉(zhuǎn)化為符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的美雄酮。最終結(jié)果如下轉(zhuǎn)化率＝72％、粗品率＝94.7％、分離率＝64％、精制率＝97.2％實(shí)施例2用新鮮的種子斜面，即生產(chǎn)菌株在瓊脂斜面上30℃恒溫培養(yǎng)2天后直接使用，用無菌水制成菌懸液。一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)例1中所述。將底物17α-甲基睪丸素(17α-methyltestosterone)粉碎，粒度14～16μ，在無菌條件下迅速投入到培養(yǎng)好的發(fā)酵液中，投料量為1.2g/L發(fā)酵液體積，并加入相對(duì)于發(fā)酵液體積3％的工業(yè)乙醇，轉(zhuǎn)化條件同實(shí)例1中所述。轉(zhuǎn)化9h后，再加入相對(duì)于發(fā)酵液體積4％的工業(yè)乙醇；轉(zhuǎn)化48h后，取樣用TLC和HPLC法控制終點(diǎn)。
轉(zhuǎn)化結(jié)束后，發(fā)酵液的提取、分離同實(shí)例1中所述，轉(zhuǎn)化結(jié)果為轉(zhuǎn)化率＝70％、粗品率＝95.7％、分離率＝60％、精制率＝96.8％實(shí)施例3用新鮮的種子斜面，即生產(chǎn)菌株在瓊脂斜面上30℃恒溫培養(yǎng)2天后直接使用，用無菌水制成菌懸液。一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)例1中所述。
將回收底物粉碎，粒度14～16μ，在無菌條件下迅速投入到培養(yǎng)好的發(fā)酵液中，投料量為2.0g/L發(fā)酵液體積，并加入相對(duì)于發(fā)酵液體積3％的工業(yè)乙醇，轉(zhuǎn)化條件同實(shí)例1中所述。轉(zhuǎn)化8h后，再加入相對(duì)于發(fā)酵液體積4％的工業(yè)乙醇；轉(zhuǎn)化24h后，取樣用TLC和HPLC法控制終點(diǎn)。
轉(zhuǎn)化結(jié)束后，發(fā)酵液的提取、分離同實(shí)例1中所述，轉(zhuǎn)化結(jié)果為轉(zhuǎn)化率＝88％、粗品率＝94.5％、分離率＝78％、精制率＝94.8％實(shí)施例4用新鮮的種子斜面，即生產(chǎn)菌株在瓊脂斜面上30℃恒溫培養(yǎng)2天后直接使用，用無菌水制成菌懸液。一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)例1中所述。
將粉碎后粒度14～16μ的正品底物和回收底物按1∶1(w/w)混合，在無菌條件下迅速投入到培養(yǎng)好的發(fā)酵液中，投料量為1.5g/L發(fā)酵液體積，并加入相對(duì)于發(fā)酵液體積3％的工業(yè)乙醇，轉(zhuǎn)化條件同實(shí)例1中所述。轉(zhuǎn)化8h后，再加入相對(duì)于發(fā)酵液體積4％的工業(yè)乙醇；轉(zhuǎn)化36h后，取樣用TLC和HPLC法控制終點(diǎn)。
轉(zhuǎn)化結(jié)束后，發(fā)酵液的提取、分離同實(shí)例1中所述，轉(zhuǎn)化結(jié)果為轉(zhuǎn)化率＝75％、粗品率＝93％、分離率＝66％、精制率＝94％實(shí)施例5用新鮮的種子斜面，即生產(chǎn)菌株在瓊脂斜面上30℃恒溫培養(yǎng)2天后直接使用，用無菌水制成菌懸液。一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)例1中所述。
將粉碎后粒度14～16μ的正品底物和回收底物按7∶3(w/w)混合，在無菌條件下迅速投入到培養(yǎng)好的發(fā)酵液中，投料量為1.5g/L發(fā)酵液體積，并加入相對(duì)于發(fā)酵液體積3％的工業(yè)乙醇，同時(shí)加入聚醚類物質(zhì)(泡敵)0.3g/L，轉(zhuǎn)化條件同實(shí)例1中所述。轉(zhuǎn)化8h后，再加入相對(duì)于發(fā)酵液體積4％的工業(yè)乙醇；轉(zhuǎn)化36h后，取樣用TLC和HPLC法控制終點(diǎn)。
轉(zhuǎn)化結(jié)束后，發(fā)酵液的提取、分離同實(shí)例1中所述，轉(zhuǎn)化結(jié)果為轉(zhuǎn)化率＝70％、粗品率＝95％、分離率＝62％、精制率＝96％傳統(tǒng)的化學(xué)脫氫是采用SeO2脫氫，雖然脫氫工藝也不復(fù)雜，收率也不低，但因最終產(chǎn)品中不可避免的含有少量對(duì)人體有害的Se，而采用本發(fā)明的微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮的制備工藝的最終產(chǎn)品—美雄酮成分中不含Se。
權(quán)利要求
1.一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮的制備方法，其特征是該方法采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌經(jīng)菌種懸液的制備、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)、底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物的分離提取；通過控制培養(yǎng)期和轉(zhuǎn)化期的相關(guān)工藝，并采用Girard試劑特異性的分離產(chǎn)物美雄酮和底物17α-甲基睪丸素，獲得符合BP80版標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)物美雄酮、回收的底物甲基睪丸素可以被該菌株重新轉(zhuǎn)化的具體步驟包括如下(一)、制備用于轉(zhuǎn)化甲基睪丸素的發(fā)酵液(1)、菌種懸液的制備生產(chǎn)菌種為天津科技大學(xué)應(yīng)用微生物教研室保存的簡(jiǎn)單節(jié)桿菌，編號(hào)BY31250，將該生產(chǎn)菌株在瓊脂斜面上生長1-2天后，4℃保藏待用；其中，制作菌體種子懸液采用的液體為無菌水或新鮮種子培養(yǎng)基，滅菌條件為121℃，滅菌時(shí)間20～25min；(2)、一級(jí)種子培養(yǎng)將上述制好的種子懸液加入到含碳源、氮源和無機(jī)磷組成的種子培養(yǎng)基中，滅菌條件為120～125℃，滅菌15～25min；在搖床上160r/min轉(zhuǎn)速下，30～33℃培養(yǎng)18～22h，即得適合接種的種子培養(yǎng)物；(3)、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)將生長良好的種子按2％～5％v/v的接種量接入到含有玉米漿、酵母膏、葡萄糖、磷酸二氫鉀的發(fā)酵培養(yǎng)基中；在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平保持在10％～30％，通過流加20％(w/v)的NaOH來控制pH值在6.7～7.2，培養(yǎng)22～24h，即得適宜于投料的菌體培養(yǎng)液；(4)、底物17α-甲基睪丸素的轉(zhuǎn)化將底物粉碎，粒度14～16μ，在無菌條件下迅速投入到培養(yǎng)好的發(fā)酵液中，并加入相對(duì)于發(fā)酵液體積4％～7％的工業(yè)乙醇，投料量為12～20g/L發(fā)酵液體積；在轉(zhuǎn)化過程中通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的通氣量、轉(zhuǎn)速和罐壓來控制發(fā)酵液中溶氧水平在20％～40％，通過流加20％w/v的NaOH來控制pH值在7.0～7.4，轉(zhuǎn)化36～48h；在轉(zhuǎn)化階段后期，通過薄層層析或高效液相來控制發(fā)酵終點(diǎn)；(二)、從發(fā)酵液中提取、分離美雄酮該過程包括發(fā)酵液過濾、濾餅在甲醇中回流、去除菌體、成腙反應(yīng)、過濾得粗品以及水解后回收底物的具體步驟包括如下(1)、發(fā)酵液除去菌體轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將發(fā)酵液減壓過濾，濾餅烤干，加入為濾餅重量的10～15倍量的甲醇，回流溶解至澄清，回流時(shí)間1～2h，過濾除去菌體；(2)、產(chǎn)物的分離與精制在濾液中加入一定量的Girard試劑和冰醋酸，回流4～6小時(shí)，減壓濃縮，加入8～10倍體積的水，室溫?cái)嚢瑁^濾即得美雄酮粗品，用乙醇或甲醇精制即得質(zhì)量符合BP80版標(biāo)準(zhǔn)的美雄酮成品；(3)、底物17α-甲基睪丸素的回收在濾液中加入濃硫酸調(diào)節(jié)pH值在1.5～3.0的范圍，室溫下靜置6～8小時(shí)，未轉(zhuǎn)化的底物即可結(jié)晶析出，過濾、水洗、干燥即得回收底物，回收底物可以被所用菌種再次轉(zhuǎn)化為符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的美雄酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美雄酮的制備方法，其特征是在菌種懸液制備時(shí)，瓊脂斜面菌種30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，菌體在斜面上已完全長好，從外觀上看呈淡乳黃色，豐滿而有光澤；在光學(xué)顯微鏡下菌體形狀多數(shù)呈桿狀，有部分呈折角狀；在4℃保藏時(shí)間以在20d之內(nèi)為宜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美雄酮的制備方法，其特征是在發(fā)酵培養(yǎng)基中采用玉米漿和酵母膏構(gòu)成復(fù)合氮源。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美雄酮的制備方法，其特征是在投入底物的過程中將底物17α-甲基睪丸素粉碎的粒度為14～16μ，在無菌條件下迅速投入發(fā)酵液中，加入4％～7％的工業(yè)乙醇，并加入相對(duì)于發(fā)酵液體積萬分之一至萬分之三的聚醚類消泡劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美雄酮的制備方法，其特征是所述工業(yè)乙醇的加入分兩次加入，第一次隨底物一起加入，轉(zhuǎn)化7～9h后再次加入總體積一半左右的工業(yè)乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美雄酮的制備方法，其特征是獲得符合BP80版標(biāo)準(zhǔn)的美雄酮正品的底物投料濃度為12～15g/L，轉(zhuǎn)化率65％～75％，收率55％～64％；回收底物投料濃度為15～20g/L，轉(zhuǎn)化率85％～90％，收率75％～80％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美雄酮的制備方法，其特征是回收底物可以被所用菌種再次轉(zhuǎn)化為符合所述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的美雄酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美雄酮的制備方法，其特征是提取分離過程為采用Girard試劑分離。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美雄酮的制備方法，其特征是所得的美雄酮成分中不含Se。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮的制備工藝，主要包括采用簡(jiǎn)單節(jié)桿菌經(jīng)菌種懸液的制備、一級(jí)種子培養(yǎng)、二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)、底物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物的分離提取；通過控制培養(yǎng)期和轉(zhuǎn)化期的相關(guān)工藝，并采用Girard試劑特異性的分離產(chǎn)物美雄酮和底物，獲得符合BP80版標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)物美雄酮、回收的底物甲基睪丸素可以被該菌株重新轉(zhuǎn)化等步驟。其有益效果是利用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)美雄酮所采用的工藝與化學(xué)脫氫法制備相比較，所得產(chǎn)品美雄酮同樣都達(dá)到BP80版標(biāo)準(zhǔn)的情況下，原料成本降低了40％以上，成品收率提高了30％以上。同時(shí)，該生產(chǎn)工藝對(duì)周圍環(huán)境污染非常輕微，幾乎沒有污染，生產(chǎn)中為常壓工作，操作工序簡(jiǎn)單，無其它危險(xiǎn)。生產(chǎn)美雄酮周期短、收率高，可帶來較高的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12P33/02GK1563409SQ20041001880
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月29日
發(fā)明者杜連祥, 王致萍, 盧繼坤, 王樹立, 別松濤 申請(qǐng)人:天津市福興達(dá)精細(xì)有機(jī)化工有限公司