專利名稱：對(duì)大腸桿菌o163的o－抗原特異的核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌O163(Escherichia coli O163)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特別是涉及大腸桿菌O163中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用這些對(duì)O-抗原特異的寡核苷酸快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)人體及環(huán)境中的大腸桿菌O163并鑒定這些致病菌中的O-抗原。
背景技術(shù)：
位于大腸桿菌表面的脂多糖是大腸桿菌致病的誘因，而O-抗原是脂多糖最外層結(jié)構(gòu)，是免疫系統(tǒng)識(shí)別的目標(biāo)和噬菌體吸附的位點(diǎn)。O-抗原的缺失會(huì)造成許多病原體的血清敏感，或者嚴(yán)重削弱病原體的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 1771750-1753.Pluschke G et al“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18K1 Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42907-913]。大腸桿菌是一個(gè)種，種內(nèi)的菌株一般通過O-抗原和H-抗原(有時(shí)通過K-抗原)來鑒定。其中O-抗原具有高度多樣性，大腸桿菌有166種不同的O-抗原，O-抗原的變化可能是大腸桿菌的起源和維持其多樣性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]。
O-抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌脂多糖中的O特異性多糖成分，它由許多重復(fù)的寡糖單位組成。O-抗原的合成過程研究得較清楚先由糖基轉(zhuǎn)移酶將核苷二磷酸單糖轉(zhuǎn)移到一個(gè)固定在細(xì)胞內(nèi)膜的脂分子上，然后在內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)合成寡糖單位，O-抗原的寡糖單位再通過o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶被轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜外側(cè)，而后通過聚合酶聚合成多糖，再被連接到一個(gè)糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。編碼負(fù)責(zé)O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色體上相鄰排列，形成一個(gè)基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在大腸桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三類基因糖合成路徑基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因，寡糖單位處理基因，其中糖合成路徑基因編碼的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸單糖；糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼的酶將核苷二磷酸單糖及其它分子轉(zhuǎn)到單糖上從而使單糖聚合成寡糖單位；寡糖單位處理基因包括o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，它們將寡糖單位轉(zhuǎn)移到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，再聚合成多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理基因只存在于攜帶這些基因的基因簇里。O-抗原中單糖的不同，單糖間聯(lián)結(jié)鍵的不同和寡糖單位之間聯(lián)結(jié)鍵的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性，而單糖的組成、單糖間的聯(lián)結(jié)鍵及寡糖單位之間的聯(lián)結(jié)鍵是由O-抗原基因簇中的基因控制著，所以O(shè)-抗原基因簇決定了O-抗原的合成，也決定了O-抗原的多樣性。
因?yàn)镺-抗原是極強(qiáng)的抗原，是大腸桿菌重要的致病因素之一，同時(shí)它又具有極強(qiáng)的多樣性，這啟示我們能研究一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)大腸桿菌及其O-抗原的特異性好、靈敏度高的方法。以表面多糖為目標(biāo)的血清學(xué)免疫反應(yīng)自上世紀(jì)30年代以來一直被用于對(duì)細(xì)菌的分型和鑒定，是鑒定致病菌的唯一的手段。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數(shù)量不足，大量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面此法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、漏檢率高、準(zhǔn)確性差，所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法將為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙門氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特異核苷酸序列通過PCR方法鑒定了沙門氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是將相應(yīng)于沙門氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原內(nèi)的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到對(duì)不同血清型的沙門氏菌特異的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用對(duì)E.coli O111的O-抗原特異的源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定了一株產(chǎn)毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后來的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鑒定E.coli O111的血清型的方法有假陽性結(jié)果出現(xiàn)。Bastin D.A.and Reeves，P.R.認(rèn)為，這是由于wbdI基因是一個(gè)推測(cè)的糖合成路徑基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 16417-23]，而在其它細(xì)菌的O-抗原的結(jié)構(gòu)中也可能有這個(gè)糖，所以糖合成路徑基因?qū)τ贠-抗原并不是高度特異的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸。它是大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因、聚合酶基因及糖基轉(zhuǎn)移酶基因的特異的核苷酸。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)核苷酸序列。
本發(fā)明的次一目的是提供了構(gòu)成大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的基因轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因即wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf10、orf11基因；糖合成路徑基因，包括manC，manB，fnlA，qnlA，qnlB。它們?cè)贠-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本發(fā)明的又一目的是提供了寡核苷酸，它們分別源于大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，包括orf5、orf6、orf10基因。它們是上述基因內(nèi)的寡核苷酸，長(zhǎng)度在10-20nt；它們對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原是特異的；尤其是表1中列出的源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它們對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原是高度特異的，而且這些寡核苷酸還可重新組合，組合后的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原也是高度特異的。
本發(fā)明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列，從而通過這些方法來檢測(cè)和鑒定大腸桿菌O163的O-抗原及檢測(cè)和鑒定大腸桿菌O163。
本發(fā)明的再一目的是提供了分離大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以獲得其他細(xì)菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以獲得編碼其他多糖抗原的細(xì)菌的基因簇的全序列。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)15433個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其包括命名為manC、manB、wzx、wzy、orf5、orf6、fnlA、qnlA、qnlB、orf10、orf11的11個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特異性的基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。其中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因是SEQID NO1中的4349至5602堿基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的5599至6834堿基的核苷酸；所述的orf5基因是SEQ ID NO1中的6852至7586堿基的核苷酸；orf6基因是SEQ ID NO1中的7880至8983堿基的核苷酸；Orf10基因是SEQ ID NO1中的12196至13389堿基的核苷酸。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基轉(zhuǎn)移酶基因的寡核苷酸；以及它們的混合或它們的重組。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原高度特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的4500至4518堿基的核苷酸和5425至5442堿基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5100至5117堿基的核苷酸和5503至5520堿基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中的6102至6119堿基的核苷酸和6738至6755堿基的核苷酸，SEQ ID NO1中的6223至6240堿基的核苷酸和6784至6801堿基的核苷酸。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸在檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原的應(yīng)用。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O163的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測(cè)細(xì)菌。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O163，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O163中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O163的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇；將得到PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性；合并long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列；(6)特異基因篩選針對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)不同地方以確保其特異性；用這些引物以166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O163及其O-抗原都是高度特異的；(7)引物靈敏度的檢測(cè)培養(yǎng)大腸桿菌O163，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測(cè)物中，混入細(xì)菌的待檢測(cè)物作為檢測(cè)用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌O163的靈敏度。
前述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O163，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；
(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O163中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O163的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇；首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇上游的galF基因設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATCAAA GAA ATC-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAGTCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘，然后94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性；合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行；酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)；合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中；隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應(yīng)30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶；最后用1/10體積的3MNaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇文庫；
(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率，再通過將相聯(lián)系的序列進(jìn)行反向測(cè)序及測(cè)通得到剩余20％的序列，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列，序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O163的基因組作6個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率；在得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到12個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因篩選針對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)不同地方以確保其特異性；用這些引物以166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物在大腸桿菌O163中得到陽性結(jié)果，在其他組中沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，也就是，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖在少數(shù)組中得到PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O163及其O-抗原都是高度特異的。
(7)引物靈敏度的檢測(cè)將大腸桿菌O163的凍存菌液接種到有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至飽和，取培養(yǎng)好的菌液稀釋，取稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入LB培養(yǎng)基，過濾，過濾液于30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)ml于6,000g離心數(shù)分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100℃沸水中煮數(shù)分鐘，裂解液于12,000g離心數(shù)分鐘，取上清做為PCR模板；用4對(duì)寡核苷酸對(duì)，SEQ ID NO1中的4500至4518堿基的核苷酸和5425至5442堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5100至5117堿基的核苷酸和5503至5520堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6102至6119堿基的核苷酸和6738至6755堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6223至6240堿基的核苷酸和6784至6801堿基的核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果；參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果；說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O163的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
也就是，本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全長(zhǎng)15433個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通過本發(fā)明的方法得到了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所述，它的11個(gè)基因都位于galF基因和gnd基因之間。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中的基因，即轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因(wzx基因或與wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或與wzy有相似功能的基因)；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。它們?cè)贠-抗原基因簇中的起始位置和終止位置及核苷酸序列都列在表4中。本發(fā)明尤其涉及到O-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因和聚合酶基因，因?yàn)樘呛铣陕窂交蚣春铣珊塑斩姿釂翁堑幕颥F(xiàn)在被預(yù)示對(duì)較多胞外多糖是常見的、共同的，對(duì)細(xì)菌的O-抗原并不是特異的，而本發(fā)明涉及到的o-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因、聚合酶基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)Υ竽c桿菌O163的O-抗原是特異的。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了源于大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中的wzy基因或與wzy有相似功能的基因和wzx基因或與wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基轉(zhuǎn)移酶基因包括orf5、orf6、orf10基因的寡核苷酸，它們是這些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，優(yōu)先被用的是列于表1中源于大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中的wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸對(duì)。在表1中也列出了這些寡核苷酸對(duì)在O-抗原基因簇中的位置及以這些寡核苷酸對(duì)為引物所做的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的大小，這些PCR反應(yīng)可用表中的退火溫度進(jìn)行。這些引物只在以大腸桿菌O163為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中得到預(yù)期大小的產(chǎn)物，而在以表2所列的其它菌為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增中都未得到預(yù)期大小的產(chǎn)物。更詳細(xì)地說，以這些寡核苷酸對(duì)為引物所做的PCR反應(yīng)在大多數(shù)細(xì)菌中均未得到任何產(chǎn)物，所以，可以確定這些引物即表1所列的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O163及它們的O-抗原是高度特異的。
所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的分離方法包括下述步驟1)基因組的提??；2)PCR擴(kuò)增大腸桿菌O163中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文庫的構(gòu)建；4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最終獲得O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；6)特異基因的篩選；7)引物靈敏度檢測(cè)。
本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
如本發(fā)明所述，“寡核苷酸”主要是指來源于O-抗原基因簇中的編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因、編碼聚合酶的基因和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)的一段核苷酸分子，它們?cè)陂L(zhǎng)度上可改變，一般在10到20個(gè)核苷酸范圍內(nèi)改變。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的4349至5602堿基)，wzy基因(核苷酸位置是從SEQ ID NO1的5599至6834堿基)內(nèi)的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O163都是高度特異的。
此外，有時(shí)兩個(gè)遺傳相似的編碼不同O-抗原的基因簇通過基因重組或突變產(chǎn)生新的O-抗原，從而產(chǎn)生新的細(xì)菌類型，新的突變株。在這種環(huán)境中，需要篩選出多對(duì)寡核苷酸同重組基因雜交以提高檢測(cè)的特異性。因此，本發(fā)明提供了一整套多對(duì)寡核苷酸的混合物，它們?cè)从谵D(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。這些基因的混合物對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖抗原來說是特異的，從而使這套寡核苷酸對(duì)這個(gè)細(xì)菌的多糖抗原是特異的。更具體地說，這些寡核苷酸的混合物是源于轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基轉(zhuǎn)移酶基因中的寡核苷酸的組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及寡核苷酸的鑒定，它們可以用于檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌和在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原。
本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)食品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因。(iii)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O163?？捎肞CR方法檢測(cè)，更可以將本發(fā)明方法中的核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測(cè)，或者通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
本發(fā)明者考慮到以下情況當(dāng)單個(gè)的特異的寡核苷酸檢測(cè)無效時(shí)，寡核苷酸的混合物能與靶區(qū)域特異性雜交以檢測(cè)樣品。因此本發(fā)明提供了一套寡核苷酸用于本發(fā)明所述的檢測(cè)方法。這里所說的寡核苷酸是指源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、編碼聚合酶的基因包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因包括orf5、orf6、orf10基因的寡核苷酸。這套寡核苷酸對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌的O-抗原來說是特異的，這一特殊的細(xì)菌O-抗原是由大腸桿菌O163表達(dá)的。
另一方面，本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)排泄物中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法，這些抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因的寡核苷酸特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因(iii)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交。這些細(xì)菌是大腸桿菌O163。可用本發(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測(cè)樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸分子標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)如southern-blot或熒光檢測(cè)，或者通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
一般一對(duì)寡核苷酸可能與同樣的基因雜交也可與不同的基因雜交，但它們中必須有一個(gè)寡核苷酸能特異性雜交到特殊抗原型的特異序列上，另一個(gè)寡核苷酸可雜交于非特異性區(qū)域。因此，當(dāng)特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新組合時(shí)，至少能選出一對(duì)寡核苷酸與多糖抗原基因簇中特異基因混合物雜交，或者選出多對(duì)寡核苷酸與特異基因的混合物雜交。甚至即使當(dāng)一個(gè)特殊的基因簇中所有基因都獨(dú)一無二時(shí)，此方法也能應(yīng)用于識(shí)別此基因簇內(nèi)的基因混合物的核苷酸分子。因此本發(fā)明提供了一整套用于檢測(cè)本發(fā)明方法的多對(duì)寡核苷酸，在這里多對(duì)寡核苷酸是源于編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；源于編碼聚合酶的基因包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；源于編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因包括orf5、orf6、orf10基因。這套寡核苷酸對(duì)一個(gè)特殊的細(xì)菌多糖來說是特異的，這套寡核苷酸可能是糖合成中必須基因的核苷酸。
另一方面，本發(fā)明也涉及到一種檢測(cè)源于病人的樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原的方法。樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌多糖抗原可以使樣品能與以下至少一個(gè)基因中的一對(duì)寡核苷酸中的一個(gè)特異性雜交，這些基因是(i)編碼轉(zhuǎn)運(yùn)酶的基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因(ii)編碼聚合酶的基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因(iii)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。在條件許可的情況下至少一個(gè)寡核苷酸能與樣品中的至少一個(gè)表達(dá)特殊的O-抗原的細(xì)菌的一個(gè)以上的那樣的基因特異性雜交，這些細(xì)菌是大腸桿菌O163?？捎帽景l(fā)明中的寡核苷酸作引物通過PCR的方法檢測(cè)樣品，也可將本發(fā)明中的寡核苷酸標(biāo)記后作為探針通過雜交反應(yīng)，或者通過基因芯片或微陣列檢測(cè)樣品中的抗原及細(xì)菌。
更詳細(xì)地說，以上描述的方法可以理解為當(dāng)寡核苷酸對(duì)被使用時(shí)，其中的一個(gè)寡核苷酸分子能雜交到一個(gè)并不是來源于wzx基因或與wzx有相似功能的基因及wzy基因或與wzy有相似功能的基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因包括orf5、orf6、orf10基因的序列上。此外，當(dāng)兩個(gè)寡核苷酸都能雜交上時(shí)，它們可能雜交于同一基因也可能雜交到不同基因上。也即，當(dāng)交叉反應(yīng)出現(xiàn)問題時(shí)，可選擇寡核苷酸的混合物來檢測(cè)混合的基因以提供檢測(cè)的特異性。
本發(fā)明者相信本發(fā)明不必限于以上所提的核苷酸序列編碼的特定的O-抗原，而且廣泛應(yīng)用于檢測(cè)所有表達(dá)O-抗原和鑒定O-抗原的細(xì)菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如細(xì)菌胞外抗原)合成之間的相似性，本發(fā)明的方法和分子也應(yīng)用于這些其他的多糖抗原。
本發(fā)明首次公開了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的全長(zhǎng)序列，而且可從這個(gè)未被克隆的全長(zhǎng)基因簇的序列中產(chǎn)生重組分子，通過插入表達(dá)可產(chǎn)生表達(dá)大腸桿菌O163的O-抗原，并成為有用的疫苗。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件。
實(shí)施例1基因組的提取。
在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O163，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提兩次，取上清液，再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中?；蚪MDNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
實(shí)施例2通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O163中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O163的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇。首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇上游的galF基因設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘；然后94℃變性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性。合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3構(gòu)建O-抗原基因簇文庫。
首先是連接產(chǎn)物的獲得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫。反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行。酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)。合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中。隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應(yīng)30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul。其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶。最后用1/10體積的3M NaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物。
其次是感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Bio-Rad公司提供的方法制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α。取一環(huán)大腸桿菌DH5α單菌落于5ml的LB培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)10小時(shí)后，取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到200ml的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm劇烈振蕩培養(yǎng)到OD600 0.5左右，然后冰浴冷卻20分鐘，于4℃4000rpm離心15分鐘。傾盡上清液，用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水200ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。再用冷的冰預(yù)冷的去離子滅菌水100ml吹散菌體，于4℃4000rpm離心15分鐘。用冷的冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，4℃6000rpm離心10分鐘，棄上清液，最后沉淀用1ml冰預(yù)冷的10％的甘油懸浮細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞。將制得的感受態(tài)細(xì)胞分裝為50ul一管，-70℃保存。
最后是電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒。電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇。然后立即將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落。將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇文庫。
實(shí)施例4對(duì)文庫中的克隆測(cè)序。
從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率。剩余20％的序列再通過反向測(cè)序及將有些序列測(cè)通得到，最后獲得O-抗原基因簇的所有序列。
實(shí)施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英國(guó)劍橋MRC(Medical Research Council)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列(見序列列表)。序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O163的基因組作6個(gè)LongPCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率。在得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到11個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，如表3所示。
通過檢索和比較，發(fā)現(xiàn)orf1與Shigella flexneri 2a str.301的mannose-1-phosphate guanyltransferase在478個(gè)氨基酸中有78％的相同性，88％的相似性。mannose-1-phosphate guanyltransferase由manC基因編碼，高度的相同性表明orf1也是manC基因，命名為manC。Orf2與Escherichia coli O157H7的phosphomannomutase在454個(gè)氨基酸中有85％的相同性，93％的相似性。phosphomannomutase由manB基因編碼，高度的相同性表明orf2也是manB基因，命名為manB。 Orf3與Escherichia coli的O-抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶Wzx在412個(gè)氨基酸的序列中有24％的相同性，46％的相似性。并且通過Eisenberg等人的算法發(fā)現(xiàn)orf5有12個(gè)潛在的穿膜區(qū)，Wzx蛋白的氨基端有一個(gè)大約40個(gè)氨基酸的保守基序，所以可以確定orf3是wzx基因，命名為wzx。Orf5與Yersinia pseudotuberculosis的O-抗原聚合酶在402個(gè)氨基酸的序列中有31％的相同性，55％的相似性。并且通過Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]發(fā)現(xiàn)orf5有9個(gè)潛在的穿膜區(qū)，它與許多Wzy蛋白有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，有一個(gè)大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以確定orf5是wzy基因，命名為wzy。 Orf5與Thermoanaerobacter tengcongensis的糖基轉(zhuǎn)移酶在153個(gè)氨基酸中有24％的相同性，49％的相似性，在genbank中尋找保守的功能域，發(fā)現(xiàn)orf5與糖基轉(zhuǎn)移酶家族的保守的功能域PF00535的Evalue為2×e-5，推測(cè)orf5也是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，將orf5暫命名為orf5。Orf6與Nostoc sp.PCC 7120的糖基轉(zhuǎn)移酶在289個(gè)氨基酸中有26％的相同性，47％的相似性，在genbank中尋找保守的功能域，發(fā)現(xiàn)Orf6與糖基轉(zhuǎn)移酶家族1的保守的功能域PF00534的E value為3.7×e-7，推測(cè)orf6也是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，暫命名為orf6。Orf7與Vibrio cholerae O37的UDP-D-GlcNAc 4，6-dehydratase/5-epimerase/3-epimerase在343個(gè)氨基酸中有72％的相同性，85％的相似性。UDP-D-GlcNAc 4，6-dehydratase/5-epimerase/3-epimerase由fnlA基因編碼，高度的相同性表明orf1也是fnlA基因，命名為fnlA。Orf8與Vibrio cholerae O37的dTDP-4-dehydrorhamnosereductase在285個(gè)氨基酸中有54％的相同性，68％的相似性。dTDP-4-dehydrorhamnose reductase由qnlA基因編碼，高度的相同性表明orf1也是qnlA基因，命名為qnlA。Orf9與Vibrio cholerae O37的UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase在376個(gè)氨基酸中有61％的相同性，79％的相似性。UDP-N-acetylglu-cosamine 2-epimerase由qnlB基因編碼，高度的相同性表明orf1也是qnlB基因，命名為qnlB。Orf10與Escherichia coli的糖基轉(zhuǎn)移酶在379個(gè)氨基酸中有53％的相同性，68％的相似性，在genbank中尋找保守的功能域，發(fā)現(xiàn)orf9與糖基轉(zhuǎn)移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue為3.5×e-5，因此推測(cè)orf10也是一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，暫命名為orf10。Orf11與Escherichia coli的WbuC protein在127個(gè)氨基酸的序列中有39％的相同性，62％的相似性，暫命名為orf11。
實(shí)施例6特異基因的篩選針對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因設(shè)計(jì)引物，這些基因在核苷酸序列中的位置見表1。
在表1中列出了大腸桿菌O163的O抗原基因簇的轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因、聚合酶基因及它們的相應(yīng)的功能和大小。在每個(gè)基因內(nèi)，我們各設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)的不同地方以確保其特異性。在表中還列出了每個(gè)引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每對(duì)引物用表中所列的相應(yīng)的退火溫度以表2中的所有菌的基因組為模板進(jìn)行PCR，得到了相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大腸桿菌的基因組中且高度保守的一個(gè)基因，所以我們根據(jù)mdh基因設(shè)計(jì)了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后從166種血清型的大腸桿菌中提取基因組，方法如前所述。用這對(duì)引物從166種血清型的大腸桿菌的基因組中PCR以鑒定大腸桿菌并檢測(cè)其基因組的質(zhì)量。
表2是用于篩選特異基因的166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源，為了檢測(cè)的方便，我們將它們每12-19個(gè)菌分為一組，總共13組。它們的來源都列于表中。
在第8組中含有大腸桿菌O163的基因組DNA作為陽性對(duì)照。第13組中是不含有大腸桿菌O163的基因組DNA，作為陰性對(duì)照。以每組菌做模板，用表1中的每對(duì)引物按如下條件做PCR在95℃預(yù)變性2分鐘后，95℃變性15秒，退火溫度因引物的不同而不同(參照表1)，退火時(shí)間是50秒，72℃延伸2分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。最后在72℃繼續(xù)延伸10分鐘，反應(yīng)體系是25ul。反應(yīng)完畢后，取10ulPCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增出的片段。
對(duì)于wzx、wzy基因，每個(gè)基因都有兩對(duì)引物被檢測(cè)，每對(duì)引物除了在第3組中做PCR后得到了預(yù)期大小的正確的一條帶外，在其他組中都沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶。所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O163及其O-抗原都是高度特異的。
最后，通過PCR從大腸桿菌O163中篩選到對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原高度特異的基因wzx、wzy基因。而這些基因內(nèi)的任何一段10-20nt的寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原是特異的，尤其是上述每個(gè)基因中的引物即寡核苷酸對(duì)經(jīng)PCR檢測(cè)后證實(shí)對(duì)大腸桿菌O163是高度特異的。所有的這些寡核苷酸都可用于快速準(zhǔn)確地檢測(cè)人體和環(huán)境中的大腸桿菌O163，并能鑒定它們的O-抗原。
(7)引物靈敏度的檢測(cè)將大腸桿菌O163的凍存菌液接種到有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至飽和，取培養(yǎng)好的菌液稀釋，取稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入LB培養(yǎng)基，過濾，過濾液于30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)ml于6,000g離心數(shù)分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100℃沸水中煮數(shù)分鐘，裂解液于12,000g離心數(shù)分鐘，取上清做為PCR模板；用4對(duì)寡核苷酸對(duì)，SEQ ID NO1中的4500至4518堿基的核苷酸和5425至5442堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的5100至5117堿基的核苷酸和5503至5520堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6102至6119堿基的核苷酸和6738至6755堿基的核苷酸；SEQ ID NO1中的6223至6240堿基的核苷酸和6784至6801堿基的核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果；參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果；說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O163的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
通過對(duì)O抗原基因簇的克隆和在減毒的疫苗菌株中的表達(dá)，可以組建重組疫苗。O抗原為最主要的革蘭氏陰性菌的表面抗原，可以引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，是制造重組疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret實(shí)驗(yàn)室成功的將志賀氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙門氏菌Tyziai疫苗菌中表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明可以引起兔子的免疫反應(yīng)(Molecular Microbiology1993，7239-252)。中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的小組也在從事與Viret實(shí)驗(yàn)室類似的工作。王磊實(shí)驗(yàn)室在1999年成功的將大腸桿菌O111的O抗原基因簇在沙門氏菌疫苗STM-1中表達(dá)，并證明組建成的菌株可以引起小鼠的血液和體液反應(yīng)(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本發(fā)明O163的O抗原特異基因序列可以應(yīng)用于組建重組疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的對(duì)大腸桿菌O163型的O-抗原特異的核苷酸序列(SEQ IDNO1所示)，構(gòu)造特異核酸探針，將其固定到芯片的載體上制成生物芯片，將要檢測(cè)的樣品適當(dāng)處理后，與生物芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后利用生物芯片信號(hào)分析設(shè)備就可以得到樣品中相應(yīng)的細(xì)菌情況。這種大腸桿菌O抗原鑒定的DNA芯片將可以直接用于臨床和其它檢驗(yàn)場(chǎng)所(如食品加工和生產(chǎn)行業(yè)，畜牧獸醫(yī)行業(yè)海關(guān)檢疫等的微生物檢驗(yàn))。這種芯片只需要擴(kuò)大產(chǎn)量，在完全相同的條件下就可以產(chǎn)業(yè)化。
表3是大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表，在表中列出了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)，共由11個(gè)基因組成，每個(gè)基因用方框表示，并在方框內(nèi)寫入基因的名稱。在O-抗原基因簇的兩端是galF基因和gnd基因，它們不屬于O-抗原基因簇，我們只是用它們的一段序列設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增O-抗原基因簇的全長(zhǎng)序列。
表4是大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中的所有開放閱讀框在全序列中的準(zhǔn)確位置，在每個(gè)開放閱讀框的起始密碼子和終止密碼子的下面劃線。在細(xì)菌中開放閱讀框的起始密碼子有兩個(gè)ATG和GTG。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司<120>對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15433<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgt 120caactgctgg cggaagtaca gtccatttgc ccgccgggcg tgaccatcat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ttttaggttt gggccactcc atcttgtgtg cacgacctgc cattggtgac 240aacccatttg tcgtggtact gccagacgtt gtaatcgacg acgccagcgc tgacccgctg 300cgctataacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggacgcag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggcga tctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420gatcgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaattcatag aaaaaccgga tcagccacag 480acgctggact cagacattat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaactggaac gcactcagcc aggtgcatgg ggacgtatcc aactgactga tgccattgcc 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc 660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttc gtgaagtatg gcctacgcaa cctgaaagaa 720ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccga 780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cggtgagatt cgtggcgaaa gtaatttgtt 840tcgaatattc ctgccgttat tttatataac aatcagaaca acaacgagtt agcaatagga 900
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tatcgaaaaa tatcaggctg tatatgatga cctttgaagg cttttggtat gatgaaagta 10860gtgtttaaaa tttatattcc ttatttgatt gtaatgattg ctgtgtttgt catgctaacg 10920tatacagaca tggtaagtaa attttctagt attgctttag agtacttctg tatatttaca 10980tccctttttg tttttaaaaa aatttataga ggaataattt ggactttagt cgtagggata 11040cttggagctc agatatcatc tttatataca agtggaaatt atgtcatacc tcttactctc 11100tcaaacgttg gtgagtataa tgcgttaggt tttgagcttt tatttaagtt gttatgtata 11160tcactcttat ttttatgtgt ggcacaaatt atctttagtc ctgtttttac ttatgatatt 11220ccacggcgga aaacattttt attagctctt cttttcttgc ctctaataaa tggtccttta 11280gttaagttca cagagactct ttatttttac tataagcaag tgactttttc ccctgcgtat 11340aattatcctg caattgcaaa aaaattttta aaaacagata tttggcatga tgagtcactt 11400cttttgaaaa ataaaaaacc taatgtgata gtaattttta ctgaaggaat gtcttttaat 11460gtaattgata gcgttaataa tttaggcctc ggagtaactc caaagctcga tgaaatcatg 11520aagaaatcat ttttctttat aaattattat aatcatacag cagctacttt tcgagggtta 11580agagggcaat taacttctgc ttatcaattt aaagatggtg taggtgcaaa tggtgatggt 11640ttttttgaaa taacaaatca aaaagttaaa tcaatatata ataaaagatt agtctcttta 11700ccggagatat tgaattcaaa tggttataag acgatatttc tttcttcaac agaaaaaact 11760agcactttga atgcgatgct gaaaacctta tcattcaatg aagttttggg aatgggagat 11820tttgattttt atcagaatga ccgtatgtca gataagcaaa ctttcatagc gcttaaggaa 11880gttgttgaaa gaaacaagaa taataaattt ttcattggag tttacccatc tggaactcat 11940catggtttag atagccctga tttgcgtttt agagatggtt caaattctta ttataacaaa 12000ttttataatt ttgatcatca agttggcaag ttcatagatt atcttacgtc cacaggtctt 12060ataaataata ccttggtggt tattacggct gatcattcaa ctttccctac accacaattt 12120aataaatctt ttagttcaaa ttctgattat tttgttgatg caataccttt aataattttg 12180gggcaggaaa tagagtctaa aaaaaataat gcgcatggga agaatagttt agcattggca 12240ccaacgatac taaatttatt aaatattaac cattatccta atttcttttt aggctgctcg 12300ctcttggatg taaaatgcca aagtactttt agtcatatat cggcaattgg aaattctttt 12360tttaaaaccg gcgataaaaa gtgttcttca gatgattata acgttaaaaa attagataat 12420tctagcgata taattaattt ctataatgtt agtggttaaa gtataaatac agcttatagt 12480tgactgatat atatggttaa tgtttttata gtgaatattt tttcaagccg cacaccctcg 12540cggtgaccac cccctgacag gagtaaacaa tgtcaaagca acagatcggc gtcgtcggta 12600tggcagtgat ggggcgcaac cttgcgctca acatcgaaag ccgtggttat accgtctcta 12660ttttcaaccg ttcccgtgag aagacggaag aagtgattgc cgaaaatcca ggcaagaaat 12720tggttcctta ctttacggtg aaagagtttg ttgaatctct ggaaacgcct cgtcgcatcc 12780tgttaatggt gaaagcaggt gcaggcacgg atgctgctat tgattctctc aagccatacc 12840tcgataaagg tgacatcatc attgatggtg gtaatacctt cttccaggac accattcgtc 12900gtaatcgtga gctttctgcc gaaggcttta acttcattgg taccggtgtc tccggtggtg 12960aagaaggcgc gctgaaaggt ccttccatta tgcctggtgg gcagaaagaa gcctatgaac 13020tggttgcacc gatcctgacc aaaatcgccg cagtggctga agacggtgag ccatgcgtta 13080cctatatcgg tgccgatggc gcaggccatt atgtgaagat ggttcacaac ggtattgaat 13140acggagatat gcagctgatt gctgaagcct attctctgct taaaggtggc ctgaatcttt 13200ccaacgaaga actggcgcag acctttaccg agtgggataa cggtgaactg agcagctacc 13260tgatcgacat caccaaagac atcttcacta aaaaagatga agacggtaac tacctggttg 13320atgtgattct ggatgaagcg gct 15433表1大腸桿菌0163的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR數(shù)據(jù)產(chǎn)生正 PCR的基 基因的正向引物位置 反向引物位置 PCR產(chǎn)物確大小 退火溫功能因 堿基位置 長(zhǎng)度 電泳帶 度的組數(shù) (℃)wzx O-抗原4349-5602 4500-4518 5425-5442 1093bp 0 58轉(zhuǎn)運(yùn)酶5100-5117 5503-5520 420bp 0 58wzy O-抗原5599-6834 6102-6119 6738-6755 653bp 0 58聚合酶6223-6240 6784-6801 578bp 0 56表2 166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌及它們的來源組號(hào) 該組中含有的菌株 來源1、野生型大腸桿菌O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18， IMVSaO19ab，O20，O21，O22，O23，O242、野生型大腸桿菌O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35， IMVSaO36，O37，O38，O40，O41，O42，O433、野生型大腸桿菌O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O534、野生型大腸桿菌O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O685、野生型大腸桿菌O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99， IMVSaO101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，6、野生型大腸桿菌O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O1177、野生型大腸桿菌O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O51，O137，IMVSaO138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O1408、野生型大腸桿菌O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153b9、野生型大腸桿菌O168，O169，O170，O171，O172，O173， c痢疾志賀氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13d10、鮑氏志賀氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，dB16，B17，B1811、福氏志賀氏菌 F1a，F(xiàn)1b，F(xiàn)2a，F(xiàn)2b，F(xiàn)3，F(xiàn)4a，F(xiàn)4b，F(xiàn)5(v4)，F(xiàn)5(v7)，F(xiàn)6，dDS，DR12、野生型大腸桿菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155， IMVSaO124，O167，O162，O121，O127，O149，O11913、野生型大腸桿菌 去除大腸桿菌O163的第8組菌為了檢測(cè)的方便，每12-19個(gè)菌分為一組，總共12組，第13組作為陰性對(duì)照a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab. Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.O172和O173來自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余來自于IMVSd.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)研究所表3是大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)表E.coli O163 O-antigen gene cluster #orf galF manC manB wzx wzyorf5orf6 fnlA qnlA qnlBorf10 orf11 gnd表4是大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACAGCG CGTGAAGCGT 120CAACTGCTGG CGGAAGTACA GTCCATTTGC CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGTCACTCC ATTTTATGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240AATCCATTTG TCGTGGTGCT GCCGGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG 300CGCTACAACC TTGCAGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGCAG TCAGGTGCTG 360GCAAAACGTA TGCCGGGCGA TCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACAAA AGAACCACTG 420GACCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATCGCT 600GAACTGGCGA AAAAACAGGC TGTTGATGCA ATGCTGATGA CAGGCGACAG CTACGACTGC 660GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTGCGTAA CCTAAAAGAA 720GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG 780ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT 840TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG 900GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG GGCGGATTGG TAAGACAATT 960AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TAAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGCTACATC GTAGGCATGC 1020ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGTCTGATGA ATAAATCGAT 1080TTGTTCAATA TAGTAATCTA CTAGAAAAAC TTTTCATCCC TCATAATTAT CGATGTCAAT 1140ATTTGAAATA TAATTAGCAA CCAACAGTTG ATTAAAATAG TTCAATGTTT CTGCATAATA 1200ATTATATTGA TGGTAAAAAA TTAAACATAA CGAACCCTAT TGTTTTATGC GTTTATTTAT 1260AACGTAAGGC CCATTTAATA GCTCTGTAAA TAATGTAATT CACTTAAATT TTCTTTGTTT 1320TACCAAATAC CCTTTGGTTT AACCGAATTT TATATTTAAC CTTATCTTCA AGGTATGAGT 1380Orf1的起始TATAGCTCTG GGCCTTAGAA TGAGTTAATA TGATGAATCA CGAAAAAATT TTCCCAATAA 1440TCATGGCTGG TGGGGCAGGT AGTCGTCTGT GGCCACTGTC CCGCGAGCTT TATCCAAAAC 1500AATTCATTCG CCTTAAAGGC GAACTCACCA TGTTACAGGC AACTCTAAGC CGTTTGAATA 1560CTTTGATGTG TAATGATCCG ATTATTATAT GCAACGAACA GCACCGCTTT ATTGTTGCAG 1620AGCAGGTGCG CCAGCTGAAC AAACGGACCG AAAATATCAT TTTGGAGCCT GTCGGTCGTA 1680ACACCGCTCC GGCAGTTGCC CTCGCGGCGC TGGCGGCAAA ACGCAGTCGC CCGGACTGTG 1740ATCCGTTGAT GCTGGTTCTG GCTGCTGACC ATGTTATTCA GAACGAAGAT GCATTTCGCG 1800AAGCGGTAAA GGTGGCTATC CCTTACGCGG AAAACGGCAA GTTGGTGACT TTCGGCATCG 1860TGCCTGATAC GCCGGAAACG GGATATGGCT ACATTCGTCG TGGTGAGGCT CTTTTTAGCG 1920TAGATGAGTT CAAAGCCTTT GCTGTAAAAA CATTTATAGA AAAGCCTAAT CTTGAAACTG 1980CGATCGATTA CGTCTCAAGT GGTGAGTATT ACTGGAACAG TGGTATGTTC ATGTTCCGTG 2040CAGGTCGCTA CCTGGAAGAA CTTGAAAAAT ACCGTCCGGA TATCTTAAGT GCCTGCGAAA 2100AATCGATGGC AGTGGTTGAT CTTGATCTCG ATTTTATCCG CGTGGATGAA GAAGCCTTTC 2160
TCTGCTGTCC GGAAGAGTCC ATTGACTATG CAGTGATGGA ACATACGGCG GATGCCGTGG 2220TGGTGCCAAT GGATGCGGGC TGGAGTGATG TCGGTTCATG GTCTTCTTTA TGGGAAGTTA 2280GCGATAAAAC TCGTGAGGGA AATGTTTGCA CTGGAGATGT GATTTCATTG AACTCTGGCA 2340ATAATCTTAT TTTCTCCGAT ACAAGCTTAA TTGCCACAGT TGGTGTGCAT AATCTAATTA 2400TAGTACAGAC TAAAGACGCG GTACTGATTG CTGACCGTGC CGCTGTGCAA GACGTTAAAA 2460AAGTGGTGGA GAAGATCAAG ACTGATGGTC GCCATGAACA CCATATTCAT CGTGAAGTCT 2520ACCGTCCATG GGGTAAATAT GACTCCATCG ACACCGGTGA GCGTTACCAG GTGAAACGCA 2580TCACAGTGAA TCCGGGTGAA GGAATGTCGG TGCAGATGCA CCATCACCGT GCCAAACACT 2640GGGTCGTGGT GGCTGGTACC GCCAAAGTGA CCATCAATGG TGAAGCGAAG CTGCTCGGTG 2700AAAACGAGTC CATTTATATT CCGCTGGGTG CGACGCATTG CCTGGAAAAC CCGGGGAAAA 2760TTCCGCTCGA CTTAATTGAG GTGCGCTCTG GCTCCTATCT GGAAGAGGAC GACATCATCC 2820orf1的終止GCTTCCAGGA TCGCTACGGG CGGGTGTAGC ACTCCGCATC ATGCCCAGTG GCGCTGAGCT2880TGCTGGATCT ACGAATGAAA AAATAGATTT GACCATTCAA GGGTCAGGAC TAATTTTGCC 2940orf2的起始TAAAAAGGAG CCATCATGGA AAAATTAACC TGTTTTAAAG CTTACGATGT TCGCGGCAAG3000CTAGGTGAGG AGCTGAATGA AGACATTGCG TGGCGCATCG GCCGCGCGTA TGGCGAATAT 3060TTTAAGCCAC GAACTATCGT CTTAGGCGGC GATGTGCGTC TGTCCAGCAA AGCCCTGAAG 3120CTGGCGTTGG CGAAAGGACT GCAGGACGCT GGTGTTGATG TGCTTGATAT CGGCCTTTCC 3180GGTACCGAAG AGATCTATTT TGCAACTTTC CATTTGGGCG TGGACGGTGG TATTGAAGTG 3240ACAGCTAGCC ATAACCCGGT GGACTATAAC GGTATGAAGA TTGTGCGCGA AGGTGCACGT 3300CCTATCAGCG GTGATACCGG CCTGCGCGAT GTGCAGCGCT TGGCTGAGGC CAACGACTTC 3360CCGGCGGTGA ATGAAGCCAA ACGCGGTAGT TATAAGCAAA TCAACTTGCA AAAAGAGTAC 3420ATCGACCACT TGCTAGGCTA TGTCAACGTG GCAAACTTCA AACCACTCAC TCTTGTAATC 3480AATTCCGGAA ATGGAGCGGC AGGACCGGTT GTCGATGCAC TTGAAGCTCG CTTTAAGGCG 3540CTGAACGTGC CTATAAAATT CGTTAAAGTG AACAATACGC CTGACGGCAA CTTCCCGAAC 3600GGTATTCCTA ACCCGTTGTT GCCAGAGTGC CGTTCTGATA CAAGCAATGC GGTGATTGAG 3660CTCGGTGCAG ACATGGGAAT TGCCTTTGAC GGTGATTTCG ACCGCTGCTT CCTGTTCGAC 3720GAAAAAGGAC AGTTTATCGA GGGTTACTAT ATAGTTGGTC TGCTGGCGGA AGCCTTTCTT 3780GAAAAACACC CTGGTGCAAA AATTATCCAT GATCCGCGTC TCTCCTGGAA CACTGTTGAT 3840GTGGTGACTG CCGCAGGTGG CACGCCGGTA ATGTCGAAAA CAGGACACGC CTTTATTAAA 3900GAACGTATGC GCAAGGAAGA CGCCATCTAC GGTGGCGAAA TGAGCGCGCA CCATTACTTC 3960CGTGATTTCG CTTACTGTGA TAGCGGCATG ATCCCATGGT TGCTGGTGAC GGAGATGCTG 4020TGTCTGAAGG GCAAGTCTCT GGGCGAGATG GTTCGCGACC GCATGACTGC CTATCCTGCA 4080AGCGGTGAAA TCAACAGCAC CTTGGCACAC CCCGCTGAGG CGATAGCGCG GGTGGAGCAG 4140CACTTTGCGA AAGAGGCACT GGAGGTGGAT CGCACCGATG GTCTTAGCAT GTCGTTTGAT 4200GAATGGCGCT TCAATCTGCG TTCGTCGAAT ACCGAGCCGG TGGTACGTTT GAACGTCGAA 4260TCCCGGTCTA ATATCGAGCT AATGGAAATA AAAACTAAAG AGATAATGGC TCTATTAGAT 4320Orf3的起始Orf2的終止AATAATAATT CAGGGGGCCG AGCTGAGAAT GTTTAGTCAG CTAATTCAGC AGTTGAGCTC 4380GTTTGTAGCG AGGATATTAG TATCATTAAT TTCTCTTCTT CTCAGCGTGA TAATTGTACG 4440GTTATATACG AAAGATATAG TTGGTGATTT TTTTTTGCTA ACCAGTTATT CGACTGTTTT 4500GGCCCAAGTG TTCTTGTTTG GAATGGCACC TGTTTTAAAC ATTATGTCAT CCAAGGGGGT 4560TCAGTTAAAT AAAATAGTAA TGGAGATAGC CAAGAAAAAT GTAGTATCTA TGCTATGTAT 4620GTTTTTATGT GGCTTAATTA TACTGGCTTT TTTTGCTAAA GTTGATTATT CGAGTTTAAT 4680TGTGCTTTCA CTTCTTTCAG GAGTTCTATT AATTATTAGT GAACTAATGA AGGGACAAGG 4740
TATGTATATT CTCTCCCAAA TCTTCAATGG AGGTTTGAAT AACATTCTCT TTCTTATTCT 4800TATAGTCGTT TTTATACCAA ATAAAGAAGA AACAGATCTC GAGGATATTA TTTATTTTTA 4860TGCGTTAGCA TATATGTGTG TTATTGTAGG TGGTTCTATA TACTTGCGCA TTAAATATAA 4920GGTAAGTAAG AGTAAAGGAT TAATTGATGA TGTTATTACG TATTCAATTA TTTTACCGAT 4980ATTCATATCA ACTGTTATTG TATATATGTT CTCACAAATA GACCTGTGGT TTGTATCTCG 5040TTTATTTGAT AATGATGTAG TCGCTCAGTA TGGATTAGCA ATTAGATTGA CGGCAGTATT 5100GAGTTTTTCG ACTTTATCAG TTAGAGCTAT AGCAGCAGCA AGAATCCCAA AATTAATGAA 5160CGACATTCAG GCGTTGCAAA AAGATGTATC CCTCAGTTGT TTATTTTCAT TTTTAGTGAG 5220TTTAGTGATT TTAAGTGGGA TAGCATTATT TGGCAAATTA TTTATTGGCC TTGTTTATGG 5280CAACAGCTAT GAATTAACTT GGTATGTTCT ACTAATTTTC TCATTTGGAC AGATGATTAA 5340TGCTGCAACT GGTCCCTGCG ATTATTTACT AAGTCATACA GGGCATGGAA GATACCTTAT 5400GATAATCTCA CTTGTTTCAT TCTTATTTTT AATGACTCTA TTGGCAATAA TAACAATAAG 5460ATTCAACAGT GTGTTTTTAT TCTGTGGCGC TGTATCATTT ACAATCTGCT TGCAAAATCT 5520GATTATAATG TACGTAGCAT TTAAAAAAAC GGGTGTACTT TCACTACCCT TAATAAATTT 5580orf4的起始Orf3的終止TAAAAGAGCA TATGTATCAT GACAAGGAAA ATGAATACTG CAGTTTTATC ATTCATGATG5640TTATATATTC TTACTAGTCT TATTTCAGTT TATCAAACAT TGAATCAAGA TTTATTTCCT 5700GGTGAACTTC ATAGATATGT AAGAACTATT GCTGATGATG AGGTTGTGAT TATAACAACT 5760CTGAATATTA TATCCTTCAT AATATGTTAT ATAACATTTT TGTTATTTCA AAAATTTAGG 5820TTCAGGCTGA ACAAAAACTA TCATTATGAA TTGAATGATA AGCGTATCCA TTTCATAATT 5880TTCGTAGTGT TAATATCTCA ACTTATTTTT CTCTACTACA CAGGTATTGG TAAAGTTACT 5940GTTAATGTCG AACAGCGTAG TACTTCATCA TTTAGCGCTT TTTTTGCAAT CTTGAAGCCA 6000GAACCTTTTA TTTTTTTCTA TTTTTTATAT TATAGATTGA AACCCGGATT TACTTTTATT 6060AAAAATAAGA TTTTTATTTT TAATATGTTT TTGTTTATTG TTTTTAAATT ATTTCAAGGG 6120TGGACAAGTT TTTTGTTAAT ACTTTTCTTT CTTGAAGTTC ATGCCAGAGT ACAATTTACT 6180AAAAACAGGT TGAGATATGT ACTCTTTATA CCTTTAATTA TTATTTTTTT TGGTGGCTGG 6240GTTTATCAGT ATGCTTATGT ATTAAAGAAT GAAATTAGGG GGGCGAAAGT TGAAAGTATT 6300ACGTACTTGC AGGGAGTGGA ACATCTTGCA TCACGTTTAT CGATGAATCC TAACTCGCTT 6360GGGGCTTATC AAAATTATTC TAAAGTTATA AACTTATATC AGCAAGAAGG TCTTGCTCTC 6420AAAGAATCAA AAGCATTTCT TCGACCTATT ACACCAGGTG GTTTGGTGGA TAAAAATTTC 6480AGAAATATAA ATAATAATGT AATGACATCA TATACACCGG ATCTAAATCA ATTTACGAGT 6540TCAGATTTTG GCATTGTAAT GTACTATTCA ATATTGTTTA ATGCAAGTCT ACCTGATTTT 6600GTATTAAGTA TAATAATGAC TGTTTTACTG TTAGTAATTG CTAAAATGTT TTTTGATTCA 6660ATTAGTAGTA TTCCTGGACA GTGCGATATT TTATTCTTTT TTGTATTGTT CTATACCTTT 6720TATACTGTTA GTTTAGAAAA TGTTTTTGGG CAAAACTTTA TTCCTTATAT CTTTAGTTTT 6780Orf4的終止GTAATATATT ATTTTTTAGG TGGAATAAAG AAAGTACACT TTGTAGAAAA TTAATTTGAG6840Orf5的起始ATTGTGTGAT TATGATAGTT AAAATGTGGC CTCTTCAAAA AGAATCAACG GCAAATCAAT6900ATACTTCGTT GATTCTACAT GATGTGATTG AATATAAACC TCACAAATGG AATCTGAAAA 6960ATGTGTTGGA TATGAGGTTC GATATTTTCC ATATGCATTG GCCTGAAACT TATTTAAACT 7020TACCTAAACG GTATCAACAG TTAATTGGGA CTCTGTGTGT TGTATTGTTT TTAGTTGTAT 7080GCAAGCTTTT TTCTAAAAAA ATCGTATGGA CCGTTCATAA TTTCAAGCCT CATGAAAATC 7140ACAATAATAT TAAGATATCA GAATTTTTTC GTACATTCCT TGTTCGAATG GTAGATAAAT 7200TTATTTTTTT AACAGAAGTT AGCAAAGATG AATTTCTGAA AATTTACAAT ATTGATAATT 7260CAAGATTAAC TGTGATACAT CACCCACTGT ATCAAGTAAA TGAGTGTTGC CATGATATTT 7320
CAGCAGCTAA TCATTCATCA ATTAATAATA AATATCTTTT TTTCGGATTA ATTAGGCCTT 7380ATAAAAACAT AGAGTTATTA ATGAATGAAT TTATTAAATA TGATTCTGAT TCGGTATTGA 7440TAATTATGGG AGGGTGCTCC AACACATTAG CTACTGAATT AAGGAACATG AAGAAAAAAA 7500TTGATTTTAA AGAACGCATC AAATTTAAAT TTGGGTACTA TAATGAACAA CAACTTCAGC 7560Orf5的終止AGAGCTCAAT CAATGTAAAG GTGTAATAAT ACCATACTCA GACATAATTG AATTTCTGGT7620GTGCTATATC GTGCAATAAC TGCGGGTGTA AATGTGTTAC TGCCTCGTAT AAGATATACA 7680GAAGAATTGG TCAATTCTCT TAAATATCAA GGTGCTGTAT TTTGTGACCC TCCACTTGAT 7740ACGAATGATA TAGCGACGTT TAATGGCATA CCCTCAGTAA ATCATAATAA TTTTGATGTG 7800GATACATATA ACACATATAT AAAAAATGCA CATTATGAAC TTTATCAAAC CATAATTTAA 7860orf6的起始GACTTAAATT AAGCGTAAAA TGAAGAATAT ATTAATAGTT TGTGATTATT TTTATCCCGC7920TTTCAAAGCG GGAGGGCCTA TTAAAAGTCT CGGAAATATA GCCAAAACTT TCAATGACAG 7980AAATTACATA ACCGTATTGA CCTACAATCA GGATATTGAT GGTCAGATCA TAAATAAATC 8040TGGCACTGAA ATTTTTGAAA AAAATATTGT CGTTTATTAT GCTCAAAACC TGCTGAATTT 8100TGTTAAATTG TATTTAAAAC TTTACAAAAC AGCTGATATA ATCTATTTAA ATAGTTTTTT 8160TTCGAGTAGA ACTACGTTTC CTGCATTAAT GCTTAAGAAG ACTAGCGCGA AGGTTTTGCT 8220GGCCCCTCGT GGTGAACTAA CATTAGGTGC ATTGACGTTA AAACCATTAA AAAAGAAAAT 8280ATATATAAAA TTATTTAATA TTTTCGCTAA CAAAAATGAA ATTTATTTTC AATTTACATC 8340TGAAGAAGAA AAGAATGAAT CATTGATATC CTTAAAAAAA GGATTTTCAT ATACTGTCAT 8400TCCTAATATG CATGATCCGA TTCCACCTTA TATATATAAG CATAAGAAGG AAGGTGAAAT 8460CCATATTTCA TTTATTTCGC GTATTTCCCC CAAAAAAAAT CTCAAAGCAG TGCTATTGTC 8520TCTTTTAAAT ATAGCCCAAG GCGACATACT CCTTAGTATT GCAGGAAATA TCGAGGATGA 8580AAAATATTGG GCGGAATGTA TGTTGATAAT AAATAAATTA CCACAGAATG TTAAAGTAAA 8640TTATCTCGGT GGAATCAAGC CTACTCAGGT AATTGATTTA CTTAAGAGCT CGCATTTGTT 8700TTTCTTGCCA ACATTAAATG AGAACTATGG GCATGCTATT GTTGAGTCCA TGATAAACTC 8760AAATGTTGTG CTAATATCCG ATCAAACACC ATGGTCCGAT GTGCAATGGA ATGGCGGTTA 8820TGTTGCAGGT TATAATGATA CTGATACATT CAAGAAGTGT ATAACCGAAT GTATGAAGTT 8880CGATGAGTCG CAATTTAATA ATAAATCACG ACAAGTCTAT GACTATGCAC GAAATGCTTT 8940Orf6的終止AACTAAACAT GAATATAAAA CATCAACTTT ATTCGATATTTAGATGTAAA TTTATGCTTT9000TTCATTTTAC TTAAGTTTCT ATGTAAACAG TTATTCCCAA TTAACGGTGT AGTATTATTT 9060AACATCTTTT ATTTAAAATT TTCAATGTGG TAATGAATTG AGTTTTATTG CTCGCTTTTC 9120Orf7的起始TTCATATAAA AACACTTTAC GTGTTTGCTC ACTCTAGAGG AATTAGTATGTTTAAAGATA9180AGGTTTTACT TATTACAGGT GGCACAGGTT CATTTGGTAA TGCTGTATTA AAGCGTTTTT 9240TAGATACGAA TATCAAAGAA ATTCGCATTT TTTCGAGAGA TGAGAAAAAA CAAGATGATA 9300TGCGAAAGAA ATATAGTAAC AATAAACTCA AGTTTTATAT CGGTGACGTA AGGGATTATT 9360CGAGTGTGTT AAATGCATCT CGAGGAGTTG ATTTTATTTA TCATGCGGCT GCATTAAAAC 9420AGGTTCCTTC TTGTGAATTT TATCCAATGG AAGCAGTAAA AACTAATATT ATTGGCACTG 9480ATAATGTTCT GGAAGCAGCT ATTGCCAATA AAGTGTCAAG AGTAGTGTGT TTGAGTACTG 9540ATAAAGCAGT ATACCCAATC AATGCTATGG GAACATCTAA AGCAATGATG GAAAAGGTCA 9600TAGTTGCTAA ATCTCGTAAT GTTCCTGATG AAATGGTTAT ATGTGCAACA CGTTATGGGA 9660ATGTTATGGC TTCAAGAGGT TCTGTTATTC CCCTTTTTGT TAATCAGATA TTAACTGGTA 9720AACCGATTAC AATCACCGAT CCAAATATGA CTCGTTTCAT GATGACATTA GATGATGCAG 9780TTGATTTGGT TGTACATGCT TTTAAACACG GACAAAATGG AGATATTTTT GTACAGAAAT 9840
CTCCTGCTGC TACCATTGAA GTTTTGACTC ATGCGATTCT AGAAATTATG AAATCGGCTG 9900ATCACACTGT TAATATTATC GGTACACGTC ATGGCGAAAA ACTATATGAG GTTTTATGTA 9960GCAGAGAAGA GATGTTGGTA GCCGAAGATC AAGGTAACTA TTATAGAATA CCGTGCGATA 10020AGCGAGATTT GAATTATGAA AAATATTTTG AGAAAGGCAA CAAAAAAGTT GAAACAATAG 10080ATGATTATAA TTCACATAAT ACATATCGTT TAAATACTCA AGAGATGGTT TCATTACTAC 10140orf8的起始Orf7終止GTAAACTTAC CTATATCAAT AAAATTGAAG CTGGTGAAAA GGCTGATCCT GATGAATAAA 10200AGAATATTGA TTGTTGGTGC TAATGGCATG CTGGGCAGCA GTCTGCTACG ATATTTTACC 10260CAATATAGTA GATATGATGT TTTGGGTACT GTACGTAGTA ACAGTGCAAA GGCAAAACTA 10320TCTAAACAAG GTTTTGATAA TATCATATCT CAAGTTGATG TGCTTGAATA TGAAACAATC 10380GAGAATGTTA TTTCAGACTG GAAACCAGAT TTTTTATTTA ATTGTGTAGG TATTATCAAA 10440CAGCTTGACG CTGCGAAGAA TAACATACTT TCATTATCAA TCAATTCTTT GTTGCCACAC 10500CAACTTGCTA AAACATGTAC TCGTAATGAA ACTAAACTAA TACATTTTTC TACTGATTGC 10560GTATTTAGTG GTAAGCAAGG TAATTATTGT GAAGAAAGCT TTCCAGATGC TTACGATCTA 10620TATGGAAAAT CAAAGCAACT TGGTGAAGTG GTTTATGACG GTCATTTAAC TTTACGGACT 10680TCAATTATTG GGCATGAAAT CTCAAGCCAG CACAGTTTGA TCGATTGGTT TTTATCTCAA 10740AAAAAATATA TTTATGGATA CTCAAAAGCT ATTTTTTCTG GAATGCCAAC AGTATATGTA 10800GCCGAGATTA TTCACGACTA TATTCTTCCA AATCCAAACT GTTGTGGGCT AAGACACCTT 10860AGTGTTGATC CTATTGATAA ATTCAGCTTA TTGAAGCTAG TAAAAAAGCA ATACTCTCAC 10920AATATTGAGA TTATAGAATC AAGTGATTTA GAGATTGATC GTAGTCTTGA TTCATTTCTA 10980orf9的起始TTACGCCAAG AAGTGGGGTT TTATCCAGCA AGTTGGCCTA AACTGATTGA GAAAATGAAT11040Orf8的終止GATGAATACA ATAAATTCTT CCGTTAAAAA AATGAAAGTT GTTACTGTTG TGGGTACCAG 11100ACCGGAGATA ATTCGTTTAT CGAGAGTAAT GGCTGTTCTT GATCAGTACA CAGAACATAC 11160CATCATTCAC ACTGGACAGA ACTATGATTA TGAACTTAAT GAGGTTTTCT TCAAGGAGTT 11220AGAGATCAGA AAACCAGATT ACTTCCTTAA TGCAGCAGGT TCTAACCCAG CTGAAACTAT 11280TGGTAATATA ATTATTGAAG CAGACAAAAT TTTTGACATA ATTTCTCCAG AGGCTCTTTT 11340AATACTTGGG GATACAAATA GTGCACTAGT TTCTATTGCA GCTAAAAGAC GTAAAATTCC 11400AATATTTCAT ATGGAAGCAG GAAACAGATG TTTTGATTAT CGAGTTCCTG AGGAAATTAA 11460TCGAAAGATT GTGGATCATA TTGCCGATAT AAACCTTACT TACAGCGAAA TTGCTCGTGA 11520GTACTTGTTG CGTGAAGGGA TTCCTGCAGA TCAGATTATC AAAACAGGTA GCCCAATGCG 11580TGAGGTTTTA AATTATTATA ATGGAGAGAT AAATAAATCT AAAGCACTCG AAAAGTTGAA 11640TTTAACTCCT AATGAGTATT TTCTGGTCAG CGCACATCGA GAAGAGAATG TAGATTCTCC 11700TGAAAAATTA AAAATTTTTA TTAACATTCT TAATAAAATA TCGGATAAAT ATGATTTGCC 11760AATAATAGTA TCTACGCACC CACGAACCCG TAATCGAATG GATAAGCTTA ATGTAGAAAT 11820AAGCAATAAT GTTTATTTTA TGAAACCATT CGGTTTCTTA GATTATGTTT CTTTGCAAAA 11880GAATGCTCGC GTAGTTCTGT CTGACAGCGG TACAATAACG GAAGAATCTT CGATTTTAAA 11940TTTTCCCGCT CTTAATTTAC GTGAAGTTCA TGAACGTCCG GAAGGTTTCG AAGAAGCTGC 12000CGTAATGTTC GTTGGGCTGG ATGCTGTTCG TATTTTTCAA GGTATTGAAA TTTTGGATCA 12060ACAGCAGAGA GGACCGGATA ATCGAGATTT GTATTTGGTC AATGATTATT CGGTTGACAA 12120TGTATCGCTA AAAGTCCTTA GAATCATAAT GAGCTATACT AATTTTGTTA ACCAAAAGGT 12180Orf9的終止orf10的起始TTGGAAAAAG CAATAATGCG AATAGCGTTA ATCTGTGATG ATTATCTGCC TGATAGCACA 12240CGTGTTAGTG CAAAAATGAT GCATGAATTG GCTTGTGGAC TTTTAAGAGA AGGCCATGAG 12300CCGGTTGTAT TTTGCCCTAA TGGTGGTGTT GGTACTGAAT TAAAAGTAAT TTATTTGGAT 12360
GGAATATGTA TTTATAAATA TCCAAATGGA CAAACAAAAG ATATATCAAA AATTAAGCGT 12420GCATTTAACG AAACTATGCT TTCATTCAAT GCATGGCATT ACCTTTCAAG CGAAATTAAA 12480CGTAAAAAAA TTGATGGTGT TATTTATTAT TCACCATCAA TTTTCTTTGG GGCTTTTGTA 12540AAAAAAATTA AAAAATATTG GAAATGTAAA TCATATCTAA TTTTACGTGA TTCATTTCCC 12600CAATGGTTAG TTGACCAAAG GATAATTCGT AGAAATGGTA TGCTTGAGAA ATATTTTCGT 12660TTTTTTGAAA GAAGAATTA TACTGCAGCC AATTATATTG GTGTAATGTC ATCTAAAAAT 12720AAAGAACTTT TTACATTACA GTATCCCCAT TACAAAAACG TAGATGTCTT ATATAATTGG 12780GCAGATCTTA ATAGCACTCA AGATGTTTCA CCAAGTGATA TTTTAGAAAG GCTATCATTG 12840GCTGATAAAG TTATATTTTT CTATGGAGGA AATATAGGTC ATGCTCAAGA CATGGCAAAT 12900TTAATGAGAT TGGCAATAGG TATGCGTACT ATTAATTACG TTCATTTTCT TTTTGTTGGA 12960CAAGGGGATG AGGTCGAACT TGTTAAAAAA ACAATTGCCG AAAATGCACT TGAGAACTGT 13020ACATACTTAC CTGCAATTAG TCAGTCGGAA TATAAATCAA TTTTAAAGGT TGTTCATGTA 13080GGGTTGTTTA GCCTTGCAAA GAATCATTCT GTGCATAATT TTCCGGGCAA ACTTCTAGGA 13140TATATGGCAA ATAAATTACC AATTTTAGGT AGTGTGAATG AAGGTAATGA TCTTATGCAA 13200GTGCTCATTG GCGCAAAGGC TGGATATGTG CACGTTAATG GATATGATGC AGAATTATTG 13260CAATCAGCTA TAAAATTAGC TACGGAAGAG AAATTAAGGA ATGAATTAGG AGAAAATGGT 13320CATTCACTTT TAGAGAAGAC CTTTTCTACG CAATCTGCTG TCGAGAACAT TTTGTTACGG 13380orf10的終止orf11的起始CTTAAGTGAA TTATTAAATG TAGGAATTGA TATGTCGGTT ACTGTATTTT ATAAAGAGCA 13440GTTAAATGAA TTGTCAAATC TTGCAAGTAA TAACCCTCGG CTAAGGGCTC ATTTAAACTT 13500ACATAAGAGT TATCAAGATA AGATTCAGAG GATTTTAATT TCCTTAAAGA GGGGAACATA 13560CATACCGCCA CATTATCATA AATATGATCA TCAGTGGGGA ACATTTCAAG TGATCGAGGG 13620TATAGTCGAT TTATATATAT TTAATAATTC AGGTACTGTC TTAGATATTA TTAATTTGGG 13680AGATGTAAAC GGTGCTTTAT TTGCACAAAT AGAACCCTAT ACCATACATA CACTTGTCTG 13740CCGTTCTCCT TATGCTTCTG TAATCGAAAT TAAAGAAGGG CCTTTTGTTG AGGCAGAGGC 13800TAAAATTGTT CCCTCTTGGG TGTATCCGGA AGGCTGTAGA GAGTACTTAC GTTCTGATAT 13860orf11的終止CGTATCAATG CTTGAAACTC TCAAGATTAA TGAAGTATAT AAGCTTTAAC TGATTAAGGA 13920TAATATGGAA TCAATTTAAT TAAATCAATC ACCACCTCCC TAGGATGTGG TTTAGGAATA 13980ACAATTATAA AATTTCTTAA TGTTGAAAGA GGCTGCAGTT TCCCTCTATT TTTTTATTAG 14040GACCTGAGTT AGCATCAAAG TTACATTCAA GCCGCATACA TCGCGGTGAA CACCCCCTGA 14100CAGGAGTAAA CAATGTCAAA GCAACAGATC GGCGTCGTCG GTATGGCAGT GATGGGGCGC 14160AACCTTGCGC TCAACATCGA AAGCCGTGGT TATACCGTCT CTATTTTCAA CCGTTCCCGT 14220GAAAAGACGG AAGAAGTGAT TGCCGAAAAT CCAGGCAAGA AACTGGTTCC TTACTATACG 14280GTGAAAGAGT TTGTTGAATC TCTGGAAACG CCTCGTCGCA TCCTGTTAAT GGTGAAAGCA 14340GGTGCAGGCA CGGATGCTGC TATTGATTCT CTCAAGCCAT ACCTCGATAA AGGTGACATC 14400ATCATTGATG GCGGTAACAC CTTCTTCCAG GATACCATCC GTCGTAACCG TGAGCTTTCT 14460GCCGAAGGCT TTAACTTCAT TGGTACCGGT GTTTCCGGTG GTGAACAAGG TGCGCTGAAA 14520GGTCCTTCCA TTATGCCTGG TGGGCAGAAA GAAGCCTATG AACTGGTTGC ACCGATCCTG 14580ACCAAAATCG CCGCAGTGGC TGAAGATGGC GAACCGTGTG TTACCTATAT TGGTGCCGAT 14640GGCGCGGGTC ACTATGTAAA AATGGTTCAC AACGGTATTG AATACGGTGA TATGCAGCTG 14700ATTGCTGAAG CCTACTCTTT GCTTAAAGGT GGCTTGAACC TTTCCAACGA AGAACTGGCG 14760CAGACCTTTA CTGAGTGGAA TAACGGTGAA CTGAGCAGCT ACCTGATTGA CATCACAAAA 14820GACATCTTCA CTAAAAAAGA TGAAGACGGT AACTACCTGG TTGATGTGAT TCTGGATGAA 14880GCGGCTAACA AAGGTACCGG TAAATGGACC AGCCAGAGCG CGCTGGATCT CGGTGAACCG 14940
CTGTCGCTGA TTACCGAGTC TGTGTTTGCA CGTTATATCT CTTCTCTGAA AGATCAGCGT 15000GTTGCCGCAT CTAAAGTTCT CTCTGGCCCG CAAGCGCAGC CAGCTGGCGA CAAGGCTGAG 15060TTCATCGAAA AAGTTCGTCG TGCGCTGTAT CTGGGCAAAA TCGTTTCTTA CGCTCAGGGC 15120TTCTCTCAGC TACGCGCCGC GTCTGAAGAG TACAACTGGG ATCTGAAATA CGGCGAAATC 15180GCGAAGATTT TCCGTGCTGG CTGCATCATC CGTGCGCAGT TCCTGCAGAA AATCACCGAT 15240GCTTATGCCG AAAATCCGCA GATCGCTAAC CTGCTGCTGG CTCCGTACTT CAAGCAAATT 15300GCCGATGACT ATCAGCAGGC GCTGCGTGAT GTCGTTGCTT ATGCAGTACA GAACGGTATC 15360CCGGTTCCGA CCTTCGCCGC TGCGGTTGCC TATTATGACA GCTACCGTAA CGGCTGTTCT 15420GCCTGCGAAC CTA15433以上僅是本發(fā)明較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何限制，凡依本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例作修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)15433個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其包括命名為manC、manB、wzx、wzy、orf5、orf6、fnlA、qnlA、qnlB、orf10、orf11的11個(gè)基因組成，都位于galF基因和gnd基因之間。
3.按照權(quán)利要求2所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特異性的基因包括轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因，包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或與wzy有相似功能的基因；糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。其中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因是SEQ ID NO1中的4349至5602堿基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的5599至6834堿基的核苷酸；所述的orf5基因是SEQ ID NO1中的6852至7586堿基的核苷酸；orf6基因是SEQ ID NO1中的7880至8983堿基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO1中的12196至13389堿基的核苷酸。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸，其特征在于，其還包括源于所述的wzx基因或wzy基因中的寡核苷酸或糖基轉(zhuǎn)移酶基因，以及它們的混合或它們的重組。
5.按照權(quán)利要求4所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原高度特異的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中4500至4518堿基的核苷酸和5425至5442堿基核苷酸，SEQ ID NO1中5100至5117堿基的核苷酸和5503至5520堿基核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸對(duì)是SEQ ID NO1中6102至6119堿基的核苷酸和6738至6755堿基核苷酸，SEQ ID NO1中6223至6240堿基的核苷酸和6784至6801堿基核苷酸。
6.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸在檢測(cè)表達(dá)O-抗原的細(xì)菌、在診斷中鑒定細(xì)菌的O-抗原和細(xì)菌的其它多糖抗原的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的重組分子，在通過插入表達(dá)而提供表達(dá)大腸桿菌O163的O-抗原，以及制備細(xì)菌疫苗中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于PCR、作為探針用于雜交反應(yīng)與熒光檢測(cè)、或者用于制造基因芯片或微陣列，檢測(cè)細(xì)菌。
9.權(quán)利要求1所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的分離方法，其特征在于，包括下述步驟(1)基因組的提取在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌O163，離心收集細(xì)胞；得到的基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O163中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O163的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇；將得到PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性；合并long PCR產(chǎn)物，并用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的用實(shí)驗(yàn)室常用的DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用生物信息學(xué)軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列；(6)特異基因篩選針對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)不同地方以確保其特異性；用這些引物以166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌基因組為模板進(jìn)行PCR，確定wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O163及其O-抗原都是高度特異的；(7)引物靈敏度的檢測(cè)培養(yǎng)大腸桿菌O163，細(xì)菌計(jì)數(shù)后分別將5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌加入到一定量的某種待檢測(cè)物中，混入細(xì)菌的待檢測(cè)物作為檢測(cè)用樣品，將樣品加入LB培養(yǎng)基，取一些與樣品混合過的LB培養(yǎng)基過濾，將過濾液進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)毫升處理后作為PCR模板用寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌O163的靈敏度。
10.權(quán)利要求9所述的對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原特異的核苷酸的分離和鑒定方法，其特征在于，包括下述步驟(1)基因組的提取在5mL的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌O163，離心收集細(xì)胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重懸細(xì)胞，37℃溫育20分鐘，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶繼續(xù)保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃溫育2小時(shí)，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃溫育30分鐘。加等體積酚抽提混合物，取上清液，再用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提兩次，取上清液再用等體積的乙醚抽提以除去殘余的酚，上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中，基因組DNA通過0.4％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(2)通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌O163中的O-抗原基因簇以大腸桿菌O163的基因組為模板通過Long PCR擴(kuò)增其O-抗原基因簇；首先根據(jù)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于O-抗原基因簇上游的galF基因設(shè)計(jì)上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATCAAA GAA ATC-3’)，再根據(jù)O-抗原基因簇下游的gnd基因設(shè)計(jì)下游引物(5’-TAGTCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法擴(kuò)增O-抗原基因簇，PCR反應(yīng)程序如下在94℃預(yù)變性2分鐘，然后94℃變性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分鐘，這樣進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后，在68℃繼續(xù)延伸7分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性；合并6管long PCR產(chǎn)物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建O-抗原基因簇文庫用被修改的Novagen DNaseI shot gun法構(gòu)建O-抗原基因簇文庫；反應(yīng)體系是300ng PCR純化產(chǎn)物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀釋的1mg/ml的DNaseI，反應(yīng)在室溫中進(jìn)行；酶切10分鐘使DNA片段大小集中在1kb-3kb之間，而后加入2ul 0.1M EDTA終止反應(yīng)；合并4管同樣的反應(yīng)體系，用等體積的酚抽提一次，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等體積的乙醚抽提一次后，用2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重懸于18ul水中；隨后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5單位的T4DNA聚合酶，11℃反應(yīng)30分鐘，將酶切產(chǎn)物補(bǔ)成平端，75℃終止反應(yīng)后，加入5單位的Tth DNA聚合酶及其相應(yīng)的緩沖液并將體系擴(kuò)大為80ul，70℃反應(yīng)20分鐘，使DNA的3′端加dA尾。此混合物經(jīng)等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)溶液抽提和等體積乙醚抽提后與Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy載體于16℃連接24小時(shí)，總體積為90ul，其中有9ul的10×buffer和25單位的T4DNA連接酶；最后用1/10體積的3MNaAc(pH5.2)和2倍體積的無水乙醇沉淀連接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到連接產(chǎn)物；用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，取2-3ul連接產(chǎn)物與50ul感受態(tài)大腸桿菌DH5α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5千伏，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入1ml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用EcoRI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群構(gòu)成了大腸桿菌O163的O-抗原基因簇文庫；(4)對(duì)文庫中的克隆測(cè)序從文庫中挑選插入片段在1000bp以上的100個(gè)克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段單向進(jìn)行測(cè)序，使序列達(dá)到80％的覆蓋率，再通過將相聯(lián)系的序列進(jìn)行反向測(cè)序及測(cè)通得到剩余20％的序列，從而獲得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Staden package軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸全長(zhǎng)序列，序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)大腸桿菌O163的基因組作6個(gè)Long PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以產(chǎn)生文庫。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率；在得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息學(xué)中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder發(fā)現(xiàn)基因，找到12個(gè)開放的閱讀框，用blast系列軟件與GenBank中的基因比較以發(fā)現(xiàn)這些開放的閱讀框的功能并確定它們是什么基因，再用英國(guó)sanger中心的Artemis軟件完成基因注釋，用Clustral W軟件做DNA和蛋白質(zhì)序列間的精確比對(duì)，最后得到大腸桿菌O163的O-抗原基因簇的結(jié)構(gòu)；(6)特異基因篩選針對(duì)大腸桿菌O163的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因設(shè)計(jì)引物；在每個(gè)基因內(nèi)各設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，每對(duì)引物分布在相應(yīng)基因內(nèi)不同地方以確保其特異性；用這些引物以166種血清型的大腸桿菌和43株志賀氏菌基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物在大腸桿菌O163中得到陽性結(jié)果，在其他組中沒有擴(kuò)增到任何大小正確的帶，也就是，在大多數(shù)組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，雖在少數(shù)組中得到PCR產(chǎn)物帶，但其大小不符合預(yù)期大小，所以wzx、wzy基因?qū)Υ竽c桿菌O163及其O-抗原都是高度特異的。(7)引物靈敏度的檢測(cè)將大腸桿菌O163的凍存菌液接種到有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至飽和，取培養(yǎng)好的菌液稀釋，取稀釋菌液涂布LB瓊脂平板，30℃至40℃，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)計(jì)數(shù)，計(jì)算原液中活菌濃度；在5份重量均為20g的生豬肉餡中分別摻入5×103，5×102，5×101，5個(gè)和0個(gè)活菌，攪拌均勻，加入LB培養(yǎng)基，過濾，過濾液于30℃-40℃培養(yǎng)，180至250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；從培養(yǎng)好的菌液中取數(shù)ml于6,000g離心數(shù)分鐘，去上清，加MQ超純水吹開沉淀并混勻，放入100℃沸水中煮數(shù)分鐘，裂解液于12,000g離心數(shù)分鐘，取上清做為PCR模板；用4對(duì)寡核苷酸對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若有與預(yù)期大小相符的擴(kuò)增帶，則結(jié)果為陽性，若沒有，則結(jié)果為陰性；參入了5×103，5×102，5×101，和5個(gè)活菌的每份豬肉餡均在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陽性結(jié)果；參入0個(gè)活菌的豬肉餡在4對(duì)引物的PCR反應(yīng)中得到陰性結(jié)果；說明使用上述方法時(shí)，這4對(duì)引物對(duì)豬肉餡中的大腸桿菌O163的檢測(cè)靈敏度均為0.25個(gè)菌/g。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)大腸桿菌O163(Escherichiacoli O163)的O－抗原特異的核苷酸，它是大腸桿菌O163中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分離的核苷酸，全長(zhǎng)15433個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；還包括源于大腸桿菌O163的O－抗原基因簇中的寡糖單位處理基因(包括wzx基因或與wzx有相似功能的基因、wzy基因或與wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本發(fā)明通過PCR證實(shí)寡核苷酸對(duì)大腸桿菌O163的O－抗原都有高度的特異性；本發(fā)明還公開了用本發(fā)明的寡核苷酸檢測(cè)和鑒定人體及環(huán)境中的大腸桿菌O163的方法。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1563059SQ20041001904
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者王磊, 楊靜華, 馮露 申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司