專利名稱：重組干擾素卡介苗菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體是一種重組干擾素卡介苗菌株及其制備方法。
背景技術(shù)：
膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)大約75％的病例為淺表性膀胱癌，其中95％為高危淺表性腫瘤。高危淺表性腫瘤術(shù)后若不給予任何藥物治療，其近期復(fù)發(fā)率為60-90％。因此，預(yù)防膀胱腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、治療術(shù)后殘余瘤與原位癌是臨床亟待解決的重大問題。
卡介苗(BCG)是一種由毒力極強(qiáng)的牛型分枝桿菌形成的生物免疫調(diào)節(jié)劑，全世界廣泛用于預(yù)防結(jié)核病，已證明其有高度的安全性和極少的嚴(yán)重并發(fā)癥。膀胱腔內(nèi)灌注BCG在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、治療殘留腫瘤和原位癌等方面已經(jīng)取得了令人滿意的臨床療效，但仍有30％-45％的病人對(duì)腔內(nèi)BCG灌注治療無反應(yīng)，長(zhǎng)期隨訪的患者甚至可達(dá)50％。此外，腔內(nèi)BCG灌注亦可引起膀胱局部和全身反應(yīng)，5％患者可出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，0.5％甚至可以危及生命，也使BCG腔內(nèi)灌注用于預(yù)防和治療淺表膀胱腫瘤受到一定的限制。
近年來，干擾素(IFN)作為二線藥物也用于膀胱灌注，治療膀胱腫瘤。雖然其40％的緩解率明顯低于BCG，但對(duì)部分BCG無反應(yīng)的患者，IFN卻有一定效果。此外，IFN的局部和全身毒性較小。因此，也引起了人們的高度重視。然而，該方案費(fèi)用較高且需要多次反復(fù)灌注，影響了其進(jìn)一步廣泛應(yīng)用。
基于上述BCG和IFN在膀胱腫瘤治療方面應(yīng)用結(jié)果，人們?yōu)榱诉M(jìn)一步提高膀胱腫瘤免疫治療的療效，采用小劑量BCG和IFN-α聯(lián)合灌注。結(jié)果顯示，該方案具有較好的耐受性和較高的完全反應(yīng)率。在鼠膀胱癌模型的實(shí)驗(yàn)中也顯示，BCG和IFN-α聯(lián)合應(yīng)用的療效均優(yōu)于二者單獨(dú)應(yīng)用。BCG和IFN-α聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，由于降低了BCG的用量，從而減輕了其毒性，同時(shí)，又保持或提高了BCG的抗腫瘤活性。到目前為止，雖然IFN-α提高BCG的抗腫瘤作用的確切機(jī)制尚未清楚，但近來的研究結(jié)果顯示，IFN-α可在以下幾方面提高BCG的免疫活性(1)協(xié)同增加免疫細(xì)胞IFN-γ和IL-2的產(chǎn)生；(2)明顯增加T細(xì)胞；(3)提高對(duì)膀胱腫瘤的直接作用，如抑制生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α)等。
中國專利1353183公開了“一種重組卡介苗菌株建立及其應(yīng)用”，該發(fā)明通過構(gòu)建一種攜帶有兩種外源基因即IL-2基因和GFP基因的rBCG，使原有的BCG具有IL-2和GFP的功能，用豬苓多糖彌補(bǔ)生物制劑的不足，從而建立一種有效消除腫瘤細(xì)胞的方法。該發(fā)明的技術(shù)特征是利用綠色熒光蛋白(GFP)作為報(bào)告基因，在穿梭質(zhì)粒中插入IL-2基因片段，構(gòu)成復(fù)合表達(dá)綠色熒光蛋白和白介素2重組BCG(rBCG-GFP-IL-2)菌株。
中國專利200410019473.2涉及一種“重組人共刺激分子卡介苗菌株及其制備方法”，菌種保藏號(hào)CGMCC No.1120。本發(fā)明首先進(jìn)行hB7-2(IgC+IgV)片段聚合酶鏈反應(yīng)并建立質(zhì)粒pYL-hB7-2；經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，E.Coli-pYL-hB7-2單克隆菌落擴(kuò)增、質(zhì)粒提取和純化；電泳、酶切及PCR反應(yīng)鑒定pYL-hB7-2質(zhì)?？ń槊绲碾娹D(zhuǎn)化，rBCG-hB7-2單克隆菌落的挑選、擴(kuò)增、鑒定。本發(fā)明與野生型卡介苗相比，在達(dá)到同樣的甚至增加免疫效果的條件下，卡介苗用量降低，從而降低毒副作用；避免了直接使用細(xì)胞因子帶來的高額費(fèi)用和反復(fù)灌注的缺點(diǎn)；能在最為合適的時(shí)間和部位分泌細(xì)胞因子。一次接種可獲得強(qiáng)而持久的抗腫瘤免疫。本發(fā)明可望為膀胱腫瘤臨床治療提供一種新型制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了降低卡介苗用量而減少其副作用，又能通過重組卡介苗的持續(xù)分泌細(xì)胞因子來解決直接使用細(xì)胞因子時(shí)所帶來的高額費(fèi)用及反復(fù)灌注的缺點(diǎn)，而提供一種重組干擾素卡介苗菌株及其制備方法。
本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
一種重組干擾素卡介苗菌株，該菌株利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的phIFN-α-2B穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)到BCG內(nèi)，構(gòu)建出rBCG-hIFN-α-2B菌株。該卡介苗菌株可以分泌hIFN-α-2B。
所述的重組干擾素卡介苗菌株，其phIFN-α-2B穿梭質(zhì)粒含有phIFN-α-2BcDNA。
所述的重組干擾素卡介苗菌株，每毫升重組BCG菌液上清液的hIFN-α-2B含量平均為997.2pg。
一種重組干擾素卡介苗菌株的制備方法，該方法是phIFN-α-2B穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)導(dǎo)并在BCG中的表達(dá)。
所述的制備方法，其hIFN-α-2BcDNA片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)。
上游引物CAAGggatccTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG；下游引物GCCGgaattcTCATTCCTTACTTAAACTTTCTT。
所述的制備方法，其phIFN-α-2B質(zhì)粒鑒定PCR反應(yīng)上游引物5’ATCTTCACCATACGACGTCC 3’下游引物5’GTTAACTACGTCGACATCG 3’所述的制備方法，以含有hIFN-α-2B cDNA的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后將PCR產(chǎn)物純化，利用BamHI、EcoRI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，切膠回收DNA片段，即為具有粘性末端可用于連接的hIFN-α-2BcDNA；將pMAO-4質(zhì)粒利用BamHI、EcoRI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)后電泳，切膠回收即為具有粘性末端的pMAO-4質(zhì)粒片段；上述兩個(gè)片段連接，形成phIFN-α-2B質(zhì)粒。
本發(fā)明通過構(gòu)建在BCG中具有高效表達(dá)分泌功能的穿梭質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到BCG中，使重組BCG能夠分泌性表達(dá)hIFN-α-2B。該重組BCG與野生型BCG相比有以下創(chuàng)新之處①重組BCG能夠分泌干擾素-α-2B，在達(dá)到同樣甚至增加免疫效果的條件下可較野生型BCG降低用量，從而降低了毒副作用；②避免了直接使用細(xì)胞因子所帶來的高額費(fèi)用和反復(fù)灌注的缺點(diǎn)；③能夠在最為合適的時(shí)間和部位分泌細(xì)胞因子。
重組BCG的生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征與野生型基本相同，傳代10次后仍能穩(wěn)定表達(dá)。


附圖為重組pYL-hIFN-α-2B質(zhì)粒示意圖。
圖中1 hIFN-α-2B基因序列 2卡那霉素抗性基因3 大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn) 4分枝桿菌復(fù)制起點(diǎn)5 熱休克蛋白60啟動(dòng)子 6信號(hào)序列。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施離對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
一.材料與方法質(zhì)粒載體質(zhì)粒pMAO-4和含有hIFN-α-2B cDNA的質(zhì)粒均由美國IOWA大學(xué)YI LUO教授提供。
二.方法(一)hIFN-α-2BcDNA片段PCR反應(yīng)上游引物CAAGggatccTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG，50μmol/l；下游引物GCCGgaattcTCATTCCTTACTTAAACTTTCTT，50μmol/l。
(二)pMAO-4質(zhì)粒與hIFN-α-2BcDNA PCR產(chǎn)物的BamHI與EcoRI酶切pMAO-4質(zhì)粒與hIFN-α-2BcDNA利用T4 DNA連接酶16℃水浴中過夜連接。
(三)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化每管加入100μl感受態(tài)細(xì)菌DH-5α，加入1μl phIFN-α-2B質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后樣品接種到含30μg/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。選擇陽性菌落。在含有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基可出現(xiàn)許多散在淡黃色菌落。將這些單克隆菌落擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒。
(四)E.Coli-hIFN-α-2B單克隆菌落的擴(kuò)增、WizardPureFection Plasmid DNAPurification System試劑盒提取質(zhì)粒(五)phIFN-α-2B質(zhì)粒的鑒定1.酶切重組質(zhì)粒以BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后，電泳出現(xiàn)兩條帶，分別在500和5000bp處左右。
2.PCR上游引物5’ATCTTCACCATACGACGTCC 3’，80umol/l下游引物5’GTTAACTACGTCGACATCG 3’，80umol/l1％瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。以該對(duì)引物的上游引物進(jìn)行的測(cè)序反應(yīng)證明該質(zhì)粒含有hIFN-α-2BcDNA序列，且與gene bank上序列完全相同。
3.測(cè)序4.將上述構(gòu)建的phIFN-α-2B質(zhì)粒為作模板。以pMAO-4質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)前的部分序列(5’ATCTTCACCATACGACGTCC 3’)作為引物進(jìn)行測(cè)序。
(六)BCG的電轉(zhuǎn)化1.感受態(tài)BCG的制備(1)7H9液體培養(yǎng)基的制備，A液7H9培養(yǎng)粉0.47g+Tween800.5ml+甘油0.5ml，加水至90ml，121℃高壓滅菌(103.4Kpa)15分鐘。B液Nacl 0.08g，牛血清白蛋白0.5g，葡萄糖0.2g，過氧化氫酶0.3ml，加水至10ml。0.22um濾膜過濾。待A液冷卻至50℃時(shí)，加入已過濾的B液即為試驗(yàn)用7H9液體培養(yǎng)基。
(2)取購買的丹麥菌株BCG原漿液1ml，加入上述已配好的7H9液體培養(yǎng)基50ml中(不含抗菌素)放置到振蕩搖床內(nèi)。以150rpm速度連續(xù)振蕩培養(yǎng)。取600nm處OD值為0.5左右BCG菌液50ml，冰浴1.5小時(shí)后4000rpm離心10分鐘。棄上清，重懸沉淀。加入10％4℃預(yù)冷甘油20ml洗滌沉淀，再次離心。重復(fù)洗滌一次。以10％預(yù)冷甘油重懸沉淀并混勻分裝到eppendorff管。直接用于電轉(zhuǎn)或保存于-70℃?zhèn)溆谩?br> 2.電轉(zhuǎn)前準(zhǔn)備將5-15μg質(zhì)粒DNA(溶于10-20μl液體)置于1.5ml管中。然后將100μl感受態(tài)BCG菌液倒入，使總體積不超過150μl，充分混合。加入到0.1cm的電轉(zhuǎn)杯中。
3.電轉(zhuǎn)條件電壓1.8KV，電容25μF，電阻100Ω，0.1cm電轉(zhuǎn)杯。
4.電轉(zhuǎn)后處理電轉(zhuǎn)后迅速將1ml不含卡那霉素的7H9培養(yǎng)基加入到電轉(zhuǎn)杯中?；靹蚝筠D(zhuǎn)入7ml試管，180rpm振蕩培養(yǎng)5小時(shí)。取200ul上述培養(yǎng)液涂布到含30ug/ml卡那霉素的7H10固體培養(yǎng)皿上，封口 膜嚴(yán)密封好培養(yǎng)皿，4～6周后選取陽性菌落。
(七)rBCG-hIFN-α-2B單克隆菌落的挑選、擴(kuò)增及PCR模板的制備1.調(diào)取單個(gè)菌落接種到含有30μg/ml卡那霉素的10ml 7H9液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)。當(dāng)600nm處OD值為1.0左右時(shí)，取1ml菌液，10000rpm離心10分鐘。
2.去上清，用雙蒸水洗滌沉淀三遍，離心去上清。加入30μl雙蒸水，混勻，煮沸10分鐘。
3.10000rpm離心10分鐘后，取上清液20μl作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。
(八)hIFN-α-2B和野生型BCG混合培養(yǎng)與單純野生型BCG培養(yǎng)比較為了探討hIFN-α-2B是否影響B(tài)CG的正常生長(zhǎng)，為重組BCG-hIFN-α-2B的建立提供依據(jù)，因此，將100萬單位hIFN-α-2B與野生型BCG在7H9液體培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)。將其結(jié)果與單純培養(yǎng)的野生型BCG生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較。從第一天到第七天它們均為近似對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，600nm處OD值單純培養(yǎng)組從0.1升到1.29，混合培養(yǎng)組從0.1到1.33。第八天兩者均稍有下降，分別為1.22和1.3。結(jié)果顯示二者無顯著性差異。
(九)phIFN-α-2B質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BCG后重組BCG內(nèi)、外表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)定將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型BCG制成感受態(tài)后，與上述已純化的重組phIFN-α-2B質(zhì)?；旌想娹D(zhuǎn)。4周左右在含有卡那抗性的7H10培養(yǎng)皿內(nèi)開始出現(xiàn)少量散在的乳白色菌落，表面光滑，進(jìn)行挑菌在含有卡那抗性的7H9液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增。菌液制作PCR反應(yīng)模板。以根據(jù)hIFN-α-2B序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)后電泳，在500bp處可出現(xiàn)一條條帶。將該條帶切膠回收測(cè)序，結(jié)果顯示該條帶即為hIFN-α-2BcDNA。
當(dāng)重組BCG-hIFN-α-2B培養(yǎng)到600nm處10D值時(shí)，取1ml菌液離心，利用ELISA法測(cè)定上清液中hIFN-α-2B濃度作為細(xì)菌外含量，每毫升重組BCG菌液上清液的hIFN-α-2B含量平均為997.2pg；將離心后的沉淀物進(jìn)行超聲破碎后細(xì)菌內(nèi)hIFN-α-2B含量平均為99.3pg。
(十)野生型BCG與重組BCG生長(zhǎng)情況、形態(tài)學(xué)及活菌數(shù)比較從第一天到第七天兩者均為近似對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，600nm處OD值野生組從0.1升到1.29；重組組從0.13到1.2。第八天重組組進(jìn)入平臺(tái)期，為1.22，野生組稍有下降，也為1.22。野生型BCG與重組BCG生長(zhǎng)無顯著性差異。600nm處10D值野生型BCG活菌數(shù)為2.8×107CFU，重組型為2.6×107CFU。
重組BCG和野生型BCG抗酸染色均為陽性，均保持相互連接的特點(diǎn)。但重組BCG較野生型BCG稍大，余無明顯異常。
連續(xù)傳代10次后rBCG-hIFN-α-2B表達(dá)產(chǎn)物含量測(cè)定及形態(tài)學(xué)觀察連續(xù)傳代10次后再次利用ELISA法測(cè)定hIFN-α-2B含量。當(dāng)培養(yǎng)到600nm處10D值時(shí)，每毫升重組rBCG-hIFN-α-2B細(xì)菌外hIFN-α-2B含量為990.3pg，菌體內(nèi)為96.5pg。與第一代重組BCG相比基本相同，仍能分泌性表達(dá)hIFN-α-2B。形態(tài)學(xué)方面二者也未見明顯差異。
該部分利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了phIFN-α-2B穿梭質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到BCG內(nèi)，構(gòu)建出rBCG-hIFN-α-2B。測(cè)定了hIFN-α-2B在重組BCG內(nèi)外的表達(dá)情況，同時(shí)還將其與野生型BCG生長(zhǎng)與形態(tài)學(xué)特性進(jìn)行了比較。進(jìn)一步探討了連續(xù)10代培養(yǎng)后hIFN-α-2B的分泌表達(dá)情況，為其應(yīng)用于膀胱腫瘤的治療奠定基礎(chǔ)。
序列ctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacagatgaggagaatctctcttttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggaggagtttggcaaccagtccaaaaggctgaaaccatccctgtcctccatgagatgatccagcagatcttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagaccctcctagacaaattctacactgaactctaccagcagctgaatgacctggaagcctgtgtgatacagggggtgggggtgacagagactcccctgatgaaggaggactccattctggctgtgaggaaatacttccaaagaatcactctctatctgaaagagaagaaatacagcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcaagaaagtttaagaagtaaggaatga本發(fā)明菌株分類命名為結(jié)核分枝桿菌，Mycobacteriumtuberculosis；已于2004年03月23日由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào))保藏。菌種保藏編號(hào)CGMCC No.1121。
權(quán)利要求
1.一種重組干擾素卡介苗菌株，其特征在于該菌株利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的phIFN-α-2B穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)到丹麥I型BCG菌株內(nèi)，構(gòu)建出rBCG-hIFN-α-2B菌株，該卡介苗菌株可以分泌hIFN-α-2B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組干擾素卡介苗菌株，其特征在于phIFN-α-2B穿梭質(zhì)粒含有phIFN-α-2BcDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組干擾素卡介苗菌株，其特征在于每毫升重組BCG菌液上清液的hIFN-α-2B含量平均為997.2pg。
4.一種重組干擾素卡介苗菌株的制備方法，其特征在于該方法是phIFN-α-2B穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)導(dǎo)并在BCG中的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于hIFN-α-2BcDNA片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)上游引物CAAGggatccTGTGATCTGCCTCAAACCCACAG；下游引物GCCGgaattcTCATTCCTTACTTAAACTTTCTT。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于phIFN-α-2B質(zhì)粒鑒定PCR反應(yīng)上游引物5’ATCTTCACCATACGACGTCC 3’；下游引物5’GTTAACTACGTCGACATCG 3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于以含有hIFN-α-2B cDNA的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后將PCR產(chǎn)物純化，利用BamHI、EcoRI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，切膠回收DNA片段，即為具有粘性末端可用于連接的hIFN-α-2BcDNA；將pMA0-4質(zhì)粒利用BamHI、EcoRI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)后電泳，切膠回收即為具有粘性末端的pMA0-4質(zhì)粒片段；上述兩個(gè)片段連接，形成phIFN-α-2B質(zhì)粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)到丹麥I型BCG菌株內(nèi)，構(gòu)建rBCG-hIFN-α-2B菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組干擾素卡介苗菌株及其制備方法，屬于基因工程技術(shù)。本發(fā)明是將構(gòu)建的phIFN－α－2B穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)到BCG內(nèi)，構(gòu)建出rBCG－h(huán)IFN－α－2B菌株。這樣制備的本發(fā)明由于能夠分泌干擾素IFN－α－2B，在達(dá)到同樣甚至增加免疫效果的條件下可較野生型BCG降低用量，從而降低了毒副作用；避免了直接使用細(xì)胞因子所帶來的高額費(fèi)用和反復(fù)灌注的缺點(diǎn)；能夠在最為合適的時(shí)間和部位分泌細(xì)胞因子。因此，本發(fā)明為其應(yīng)用于膀胱腫瘤的治療奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/20GK1597931SQ200410020080
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者韓瑞發(fā), 劉春雨, 姚智, 韓育植, 馬騰驤 申請(qǐng)人:天津市泌尿外科研究所, 韓瑞發(fā), 劉春雨, 姚智, 韓育植, 馬騰驤