專利名稱：一種海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋無脊椎動物細胞的培養(yǎng)，具體地說是一種海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
海綿是最低等的海洋無脊椎動物，屬多孔動物門(Porifera)，營濾食、固著生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海綿的次生代謝產(chǎn)物具有抗炎、抗腫瘤、抗HIV等生物活性。采用現(xiàn)代生物技術(shù)在體外生產(chǎn)這些活性物質(zhì)是目前國際上倍受關(guān)注的問題(文獻1.Belarbi EH，Gómez AC，Chisti Y.Camacho FG，Grima EM.Producing drugs from marine sponges，Biotechnology Advances，21(7)，585-598，2003)。海綿天然產(chǎn)物開發(fā)藥物的研究遇到的瓶頸問題是藥源的供給不足。解決途徑包括海水養(yǎng)殖、有機合成、細胞培養(yǎng)等。Custodio等(文獻2.Custodio MR，Prokic I，Steffen R，Koziol C，Borojevic，Brümmer F，NickelM，Müller WEG.Primmorphs generated from dissociated cells of the spongeSuberites domunculaa model system for studies of cell proliferation and celldeath，Mechanisms of Ageing and Development，105(1-2)，45-59，1998)的研究表明，通過細胞-細胞粘附形成聚集體——細胞團，可以恢復海綿細胞的端粒酶活性，使細胞具有增殖潛力。一些學者對不同的海綿形成細胞團做了進一步的研究，目前被認為是最有前途的海綿細胞離體培養(yǎng)方法之一。張衛(wèi)等(文獻3.Wei Zhang，Xiaoying Zhang，Xupeng Cao，Junyi Xu，QuanyuZhao，Xingju Yu，Meifang Jin，Maicun Deng.Optimizing the formation of Invitro sponge primmorph from Chinese sponge Stylotella agminata(Ridley).J.Biotechnol.100161-168，2003)對中國南海撅突針(Stylotella agminataRidley)海綿的細胞團培養(yǎng)也做了較深入的研究。
微載體技術(shù)廣泛應(yīng)用于動物細胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)，已開發(fā)的微載體包括實心和多孔微載體兩類，可以適應(yīng)不同類型細胞的貼附和高密度培養(yǎng)。微載體的材料較多，改性葡聚糖、玻璃、膠原等。其中，Cytodex系列微載體和玻璃微載體應(yīng)用較廣。Hillex是Solohill公司開發(fā)的新型微載體，可以適用于動物細胞在無血清及無蛋白培養(yǎng)基中的生長。這些微載體都是為陸地哺乳動物和昆蟲等細胞的高密度培養(yǎng)開發(fā)的，對海洋無脊椎動物細胞是否適用還有待研究。Mcmahon(文獻4.Mcmahon P.System for the cell cultureand cryopreservation of marine invertebrates.US 6054317，2000)將聚苯乙烯系列微載體用于海綿細胞的離體培養(yǎng)，還使用了腹足動物的血清。離散細胞易脫落；人工海水配方，細胞主要以細胞團形式存在；腹足動物血清獲得困難，價格昂貴，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)，但該工作為海綿細胞的離體培養(yǎng)提供了新的思路。細胞在微載體表面的貼附是應(yīng)用微載體技術(shù)的關(guān)鍵步驟。Zhao(文獻5.Zhao QY，Jin MF Müller WEG，Zhang W，Yu XJ，Deng MC.Attachment of Marine Sponge Cells of Hymeniacidon perleve on Microcarriers，Biotechnology progress，19(5)，1569-1573，2003)等考察了中國黃海繁茂膜海綿(Hymeniacidon perleve)離散細胞在Cytodex 3，玻璃微載體和Hillex三種微載體上的貼附性質(zhì)及不同接種條件對貼附的影響。該研究的重點是通過離散細胞與微載體的作用，選擇合適的微載體材料。結(jié)果表明，中國黃海繁茂膜海綿細胞在玻璃微載體表面的貼附明顯強于Cytodex 3和Hillex。海綿細胞長期培養(yǎng)中的一個關(guān)鍵是培養(yǎng)基，包括滲透壓等物理條件和營養(yǎng)條件。培養(yǎng)基為細胞的生長和代謝提供養(yǎng)分和適合的環(huán)境條件，是海綿細胞離體培養(yǎng)的研究重點之一。目前開發(fā)的培養(yǎng)基主要是哺乳動物和昆蟲細胞系的，迄今為止，有關(guān)海綿細胞培養(yǎng)基的研究還很少，針對不同種屬海綿開發(fā)針對性的培養(yǎng)基是非常重要的。Willoughby(文獻6.Willoughby R，Pomponi SA.Quantitative Assessment of Marine Sponge Cells in VitroDevelopment Of Improved Growth Medium.In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal36194-200，2000) 研究了Teichaxinella morchella海綿(Porifera，Demospongiae，Axinellida，Axinellidae)培養(yǎng)基中谷氨酰胺、硒和小牛血清的影響。Zhang XY等(文獻7.Zhang XY，Pennec GL，Steffen R，Müller WEG，Zhang W.Application of a MTT Assay for Screening Nutritional Factors inGrowth Media of Primary Sponge Cell Culture.Biotechnology progress，20(1)，151-155，2004)考察了幾個營養(yǎng)因素(SiO32-、Fe3+、谷氨酰胺、丙酮酸等)對寄居蟹皮海綿Suberites domuncula生長的影響。Muller WEG.提出海綿細胞的細胞團培養(yǎng)技術(shù)(文獻8.Muller WEG.Production of primmorphs fromdissociated cells of sponges and coral.US 6664106B1)；但其未給出優(yōu)化培養(yǎng)基配方。另外，不同種屬的海綿有不同的營養(yǎng)需要，開發(fā)通用和專用培養(yǎng)基是必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海綿細胞團在微載體表面貼附和培養(yǎng)的海綿細胞微載體三維培養(yǎng)方法，為海綿細胞的離體培養(yǎng)提供一種可行的新技術(shù)；在一定的條件下，將細胞團牢固的貼附在微載體表面，更有利于保持海綿細胞的端粒酶活性和增殖性。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為微載體的選取微載體可以選擇玻璃微載體、Cytodex 3等實心微載體，也可以選擇ImmobaSil系列、Cytoline系列多孔微載體、明膠、明膠+聚賴氨酸或明膠+殼聚糖等復合材料制備的實心或多孔微載體。實心微載體的接種條件為5～20g/L(培養(yǎng)液)，多孔微載體的接種條件為2～10g/L(培養(yǎng)液)。
海綿在改進人工海水中的培養(yǎng)海水組成包括Na+300～500mM，SO42-7.0mM，HCO3-0.2mM，K+10.0mM，Tris HCl 20.0mM，Cl-300～500mM，Mg2+50mM，Ca2+10.0mM，SiO32-5～150μM，F(xiàn)e3+30～120μM，Zn2+0.5～4μM，C6H5O73-30～120μM，pH7.6～8.2。PHA的添加濃度為1.5～2.5％。
在培養(yǎng)5～8天后，添加碳源(葡萄糖、山梨醇或丙酮酸鈉)、氮源(包括甘氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)和維生素C的濃度5～20μM，之后每隔2～3天更換培養(yǎng)液體積的50～80％，用改進的人工海水替換并添加碳源和氮源使其最終濃度達到20～50μM，在此條件下海綿細胞能進行正常生長。
培養(yǎng)基的添加成分還可能包括0.01～10.0％的DMEM或RPMI1640，5～15μg/L的刀豆蛋白(ConA)。
適合的海綿細胞接種范圍為1×106～9×107cells/ml。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.可大規(guī)模生產(chǎn)藥源。本發(fā)明提出細胞團的微載體培養(yǎng)，細胞聚集體貼壁牢固，在保證海綿端粒酶活性的同時，為海綿細胞增殖提供貼附表面，有利于海綿細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
2.可選材料更廣泛。本發(fā)明培養(yǎng)基優(yōu)化后，細胞貼壁能力增強，細胞形成聚集體后以貼附于微載體表面的形式存在，海綿細胞培養(yǎng)的可選擇微載體范圍擴大；可用于海綿細胞培養(yǎng)的微載體除實心微載體外，還包括多孔微載體(商用微載體玻璃等實心微載體，以及ImmobaSil系列和Cytoline系列多孔微載體)；材料擴大到有機硅材料、明膠及其改性復合材料。
3.本發(fā)明提出了海綿細胞團的微載體培養(yǎng)技術(shù)；是以海綿細胞的聚集體形式進行微載體培養(yǎng)；提出了適合微載體培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中包括鋅等元素，以及促生長因子以及抑制分裂劑；并采用營養(yǎng)成分的逐步添加的方法控制污染。
4.應(yīng)用前景好。本發(fā)明屬海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，可實現(xiàn)海綿細胞的大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)海綿次生代謝產(chǎn)物，為海洋藥物的開發(fā)提供藥源生產(chǎn)技術(shù)。


圖1為繁茂膜海綿細胞在Glass Beads上的貼附過程的光鏡照片(×100；接種A0h；B2h；C12h；D25h)；圖2為繁茂膜海綿細胞在改進人工海水中的培養(yǎng)的光鏡照片(A×40；B×400)；圖3為繁茂膜海綿的人工海水培養(yǎng)的光鏡照片(×250)；圖4為繁茂膜海綿細胞的ImmobaSil FS培養(yǎng)SEM照片；圖5為繁茂膜海綿細胞的ImmobaSil FS培養(yǎng)光鏡照片(×400)。
具體實施例方式
實施例11)繁茂膜海綿1×107cells/ml，培養(yǎng)體積4ml，18～22℃，海綿細胞在改進的人工海水中的培養(yǎng)海水組成包括Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218g/L，KCl 0.7455g/L，Na2SiO3·9H2O 0.0085g/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 0.0201g/L，NaCl 20.0g/L，ZnCl20.00054g/L，MgCl2·6H2O10.165g/L，CaCl21.1099g/L。PHA的添加濃度為2.5％。選取玻璃微載體，接種條件15g/L(改進人工海水)。
2)在培養(yǎng)7天后，添加葡萄糖15μM、甘氨酸10μM、天冬酰胺10μM和谷氨酰胺10μM、維生素C 10μM，之后每隔2～3天更換培養(yǎng)液體積的50～80％，用改進的人工海水替換并添加碳源和氮源使其最終濃度達到50μM，維生素C的濃度在20μM，在此條件下海綿細胞能進行正常生長。同時培養(yǎng)液中添加80U慶大霉素，控制微生物污染的發(fā)生。
參見圖1所示，觀察繁茂膜海綿細胞的玻璃微載體培養(yǎng)過程，游離細胞很快貼附在微載體上；部分游離細胞脫落，部分細胞在培養(yǎng)液中形成細胞聚集體；細胞聚集體會貼附在微載體上，同時空球率增加。這與細胞團的形成過程略有不同。游離細胞在玻璃微載體上貼附最好，由多個細胞聚集體和微載體形成的更大的聚集體也是在玻璃微載體中出現(xiàn)的最快。海綿細胞細胞團更牢固的貼附在微載體表面，甚至形成粘附和細胞的拓展。
實施例2繁茂膜海綿1×107cells/ml，培養(yǎng)體積4ml，18～22℃，海綿細胞在改進的人工海水(Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218g/L，KCl 0.7455g/L，Na2SiO3·9H2O 0.0085g/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 0.0201g/L，NaCl20.0g/L，ZnCl20.00054g/L，MgCl2·6H2O 10.165g/L，CaCl21.1099g/L)以及2.5％PHA中培養(yǎng)，海綿細胞團貼在培養(yǎng)孔板底部，在對照培養(yǎng)基(Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.418g/L，KCl 0.7455g/L，NaCl31.5591g/L，MgCl2·6H2O 10.165g/L，CaCl21.1099g/L)中，細胞以聚集體的形式存在但不貼壁(參見圖2、3所示)。
實施例3繁茂膜海綿細胞3.0～8.0×106cells/ml，并以3g/L ImmobaSil FS多孔微載體接種。在多孔微載體內(nèi)，離散細胞和細胞聚集體都可以貼附在微載體(參見圖2、3所示)。細胞的人工海水組成為Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218 g/L，KCl 0.7455g/L，NaCl 31.5591g/L，MgCl2·6H2O10.165g/L，CaCl21.1099g/L。
實施例4在96孔板(聚苯乙烯材質(zhì))中，分別加入50μl繁茂膜海綿提取液、腎指海綿提取液、1％殼聚糖溶液、0.2％明膠溶液、0.9％瓊脂，4℃保存48h后，取出制膜液，CMFSW清洗海綿提取液膜和明膠膜；在殼聚糖膜中加1％NaOH作用10h，CMFSW清洗數(shù)次。96孔板冰箱4℃保存。使用前，紫外照射。經(jīng)過不連續(xù)Ficoll密度梯度富集海綿原細胞。在靜止的環(huán)境中，細胞的遷移形成細胞聚集體。不同的有機基質(zhì)會影響細胞的運動，進而影響細胞-細胞粘附。繁茂膜海綿細胞可以在繁茂膜海綿提取物、明膠上發(fā)生貼附并拓展。瓊脂可以促進海綿細胞聚集，但不促進貼附。
實施例5繁茂膜海綿約1×107cells/ml，18～22℃培養(yǎng)，海綿細胞在改進的培養(yǎng)基(Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218g/L，KCl 0.7455g/L，Na2SiO3·9H2O 0.0041g/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 0.0201g/L，NaCl 23.0g/L，ZnCl20.000032g/L，MgCl2·6H2O 10.165g/L，CaCl21.1099g/L，PHA 1.5％，選取Cytodex 3微載體，接種條件5g/L(改進人工海水)。
在培養(yǎng)5天后，添加0.1％(v/v)DMEM，葡萄糖0.0040g/L、谷氨酰胺0.0029g/L、天冬酰胺0.0027g/L、甘氨酸0.0015g/L和維生素C 0.0035g/L)中培養(yǎng)，生物量(MTT法檢測)比對照培養(yǎng)基(Na2SO40.9943g/L，NaHCO30.0168g/L，Tris-HCl 2.4218g/L，KCl 0.7455g/L，NaCl 31.5591g/L，MgCl2·6H2O 10.165g/L，CaCl21.1099g/L)高40％；之后每隔2～3天更換培養(yǎng)液體積的50％，用改進的人工海水替換并添加碳源和氮源使其最終濃度達到40μM，維生素C的濃度在10μM，在此條件下海綿細胞能進行正常生長。同時培養(yǎng)液中添加100U慶大霉素，控制微生物污染的發(fā)生。營養(yǎng)成分分步加入并不斷更新培養(yǎng)液，可以有效控制微生物污染的發(fā)生。
實施例6與實施例5不同之處在于，在改進人工海水的水溶液中同時使用1.5％PHA和5μg/L刀豆蛋白(ConA)，生物量比實施例5改進培養(yǎng)液高5～10％。
實施例7與實施例1不同之處在于，選取明膠+殼聚糖復合材料制備的多孔微載體，接種條件8g/L(改進人工海水)，海綿細胞能進行正常生長。
明膠+殼聚糖復合材料制備的多孔微載體的制備參照文獻Li KG，WangY，Miao ZC，Xu DY，Tang YF，F(xiàn)eng MF.Chitosan/gelatin compositemicrocarrier for hepatocyte culture.Biotechnology Letters，26879-883，2004。
權(quán)利要求
1.一種海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法，其特征在于1)在改進人工海水中接種微載體和海綿細胞進行培養(yǎng)；改進人工海水的水溶液中包括Na+300～500mM，SO42-5.0～10.0mM，HCO3-0.1～0.5mM，K+5.0～15.0mM，Tris HCl 10.0～30.0mM，Cl-300～500mM，Mg2+20～60mM，Ca2+5.0～20mM，SiO32-5～150μM，F(xiàn)e3+30～120μM，Zn2+0.5～4μM，C6H5O73-30～120μM，pH7.6～8.2，PHA的重量濃度為1.5～2.5％；2)在海綿細胞培養(yǎng)5～8天后，向上述改進人工海水中添加有機碳源、有機氮源和維生素C，使它們的濃度分別為5～20μM，形成新的培養(yǎng)液體系；3)在步驟2)之后，每隔2～3天更換培養(yǎng)液體積的50～80％，用改進的人工海水替換并添加有機碳源和氮源使其最終濃度達到20～50μM，添加維生素C使其最終濃度達到10～20μM，在此條件下海綿細胞能進行正常生長。
2.按照權(quán)利要求1所述海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法，其特征在于所述有機碳源為葡萄糖、山梨醇和/或丙酮酸鈉；有機氮源為甘氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺。
3.按照權(quán)利要求1所述海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法，其特征在于所述微載體可以選擇實心微載體或多孔微載體，實心微載體的接種條件為每升改進人工海水5～20g，多孔微載體的接種條件為每升改進人工海水2～10g。
4.按照權(quán)利要求3所述海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法，其特征在于所述實心微載體為玻璃微載體、Cytodex 3，明膠、明膠+聚賴氨酸或明膠+殼聚糖復合材料制備的實心微載體；多孔微載體為ImmobaSil系列、Cytoline系列多孔微載體，明膠、明膠+聚賴氨酸或明膠+殼聚糖復合材料制備的多孔微載體。
5.按照權(quán)利要求1所述海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法，其特征在于所述海綿細胞接種范圍為1×106～9×107cells/ml。
6.按照權(quán)利要求1所述海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法，其特征在于在所述有機碳源和氮源添加的同時還可添加DMEM或RPMI1640，使其在培養(yǎng)液中的體積濃度為0.01～10.0％。
7.按照權(quán)利要求1所述海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法，其特征在于在所述改進人工海水的水溶液中還可添加刀豆蛋白，其添加量為每升培養(yǎng)液5～15μg/L。
8.按照權(quán)利要求1所述海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法，其特征在于所述改進人工海水的水溶液中包括Na+350～400mM，SO42-7.0mM，HCO3-0.2mM，K+10.0mM，Tris HCl 20.0mM，Cl-350～400mM，Mg2+50mM，Ca2+10.0mM，SiO32-5～150μM，F(xiàn)e3+40～80μM，Zn2+0.5～4μM，C6H5O73-40～50μM，pH7.6～8.2，PHA的重量濃度為1.5～2.5％。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋無脊椎動物細胞的培養(yǎng)，具體地說是一種海綿細胞的微載體三維培養(yǎng)方法；1)在改進人工海水中接種微載體和海綿細胞進行培養(yǎng)；改進人工海水的水溶液中包括Na
文檔編號C12N5/06GK1706937SQ200410020708
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月9日
發(fā)明者張衛(wèi), 趙權(quán)宇, 虞星炬, 金美芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所