專利名稱：褐藻膠低聚糖作為益生元的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及褐藻膠低聚糖作為益生元的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
益生元(Prebiotic)是不被宿主胃腸道消化，能夠選擇性地刺激一種或幾種有益菌在宿主腸道內(nèi)生長，進而增進宿主健康的物質(zhì)。1995年Gibson首次提出益生元的概念，現(xiàn)在益生元作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的一種已經(jīng)得到了廣泛的研究與應(yīng)用。益生元可顯著促進雙歧桿菌等腸道益生菌增殖，而雙歧桿菌本身在自身繁殖的過程中產(chǎn)生大量乳酸，乳酸能夠刺激腸蠕動，排出體內(nèi)有害物質(zhì)，促進維生素B1、B2、B6及人體對鈣離子的吸收。同時益生元抑制病原菌、腐敗菌等有害菌的生長，減少腸道內(nèi)有害物質(zhì)的產(chǎn)生。通過上述作用改善腸道的微環(huán)境，進而雙向調(diào)節(jié)人體機能，提高人體免疫力，改善內(nèi)分泌系統(tǒng)，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而達到改善人體亞健康狀態(tài)，起到延年益壽、美容等作用；并可防治腫瘤、腸道感染等疾病的發(fā)生，維護人體健康。但是目前尚未見有將褐藻膠低聚糖用作益生元的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將褐藻膠低聚糖用作益生元，它能彌補現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
褐藻膠低聚糖用作益生元。
動物和人體試驗證明褐藻膠低聚糖是一種非消化性低聚糖，能顯著促進雙歧桿菌和乳酸桿菌等腸道益生菌的生長，抑制病原菌、腐敗菌等有害菌的生長，起到了改善腸道微生態(tài)環(huán)境和凈化腸道的作用，能提高人體免疫力，改善內(nèi)分泌系統(tǒng)，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而達到改善人體亞健康狀態(tài)，發(fā)揮防治腫瘤、腸道感染等疾病以及延年益壽、美容等作用。因此，褐藻膠低聚糖是一種新型的益生元，它是一種新的藥品、保健品、食品添加劑或飼料添加劑。
具體實施例方式(一)褐藻膠低聚糖的制備申請?zhí)枮?2135571.1的中國專利中提供了一種化學(xué)氧化法制備褐藻膠低聚糖的方法。申請?zhí)枮?1107952.5的中國專利中提供了一種酸水解法制備褐藻膠低聚糖的方法。
本發(fā)明提供了一種酶解法制備褐藻膠低聚糖的方法，用這種方法制備的褐藻膠低聚糖的分子結(jié)構(gòu)與上述兩種方法制備的褐藻膠低聚糖的結(jié)構(gòu)相比，主鏈都是由α-L-古羅糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸兩種糖單元連續(xù)或交替連接而成的線性分子，平均分子量在500-2000范圍內(nèi)，聚合度在2-10的范圍內(nèi)，不同之處在于其還原末端的碳4位與碳5位之間存在不飽和雙鍵。
酶解法制備褐藻膠低聚糖的步驟是首先提取褐藻膠裂合酶(見申請?zhí)枮?3112273.6的專利)，再將它按照10-50U的比例加入到1升重量百分比濃度為0.5％-1％的褐藻膠水溶液中，進行酶解，酶解溫度為25-38℃，時間為6-8小時，最后通過離心或過濾除去未降解的大分子褐藻膠，用Sephadex G25凝膠柱進行層析分離，收集褐藻膠低聚糖組分，濃縮干燥。
(二)褐藻膠低聚糖的益生元作用(對腸道菌群中的調(diào)節(jié)作用)(1)動物實驗①試驗動物及分組選用健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-20g，購于青島動檢所。按隨機分組的方法將小鼠分為六組，每組8只。第一組(A組)為空白對照組，第二組(B組)為大豆低聚糖陽性對照組，第三組(C組)為褐藻膠給藥組，第四組(D組)為低劑量褐藻膠低聚糖給藥組，第五組(E組)為中劑量褐藻膠低聚糖給藥組，第六組(F組)為高劑量褐藻膠低聚糖給藥組。
②給藥量及方法褐藻膠為市售產(chǎn)品。大豆低聚糖為無色透明液體，由山東臨沂山松生物制品有限公司生產(chǎn)。B組灌胃大豆低聚糖的量為3.33毫升/(千克體重)(相當(dāng)于廠方推薦的成人日服用建議量的20倍)。C組灌胃0.3％(重量百分比)的褐藻膠水溶液。D組灌胃15.0-18.7mg/ml的褐藻膠低聚糖。E組灌胃20.0-37.5mg/ml的褐藻膠低聚糖。F組灌胃50.0-75.0mg/ml的褐藻膠低聚糖。C、D、E、F組灌胃液體總量按0.02毫升/(克體重)計算。A組灌胃等量的蒸餾水。各組連續(xù)灌胃14天，灌胃完取小鼠盲腸內(nèi)含物與糞便進行腸道菌的計數(shù)分析。
③培養(yǎng)基雙歧桿菌采用BL培養(yǎng)基或BLb培養(yǎng)基；乳桿菌采用LBs培養(yǎng)基；腸球菌采用膽鹽一七葉苷—疊氮鈉培養(yǎng)基；擬桿菌采用Bds培養(yǎng)基；腸桿菌采用EMB培養(yǎng)基；糞便樣品稀釋液采用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；盲腸內(nèi)含物稀釋液采用KH2PO44.5g，Na2HPO46.0g，L-鹽酸半胱氨酸0.5g，吐溫-80 0.5ml，瓊脂1g，加蒸餾水稀釋至1000ml，115℃滅菌20min。
④小鼠檢測材料的取得和測定取小鼠糞便0.2-0.4g，加入液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，梯度稀釋，使其重量百分比濃度為原液的10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-8，10-9，選取合適的稀釋度涂于各種選擇性培養(yǎng)基上，每個稀釋度做三個平板，培養(yǎng)后進行計數(shù)(活菌數(shù)/克糞便標(biāo)本)，取平均值，同時挑選特征性菌落，進行形態(tài)和生化形狀檢測鑒定，確定其菌屬。其中EMB培養(yǎng)基，膽鹽—七葉苷—疊氮鈉培養(yǎng)基37℃，需氧培養(yǎng)24-48小時，其余厭氧菌厭氧培養(yǎng)48-72小時。結(jié)果如表1所示。
將盲腸內(nèi)含物用稀釋液洗出，梯度稀釋，使其重量百分比濃度為原液的10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-8，10-9，選取合適的稀釋度涂于各種選擇性培養(yǎng)基上，每個稀釋度做三個平板，培養(yǎng)后進行計數(shù)(活菌數(shù)/克糞便標(biāo)本)，取平均值，同時挑選特征性菌落，進行形態(tài)和生化形狀檢測鑒定，確定其菌屬。其中EMB培養(yǎng)基，膽鹽—七葉苷—疊氮鈉培養(yǎng)基37℃，需氧培養(yǎng)24-48小時，其余厭氧菌厭氧培養(yǎng)48-72小時。結(jié)果如表2所示。
表1褐藻膠低聚糖連續(xù)灌胃后小鼠各種腸道菌群數(shù)量檢測結(jié)果(x±s，n＝8)

表2褐藻寡糖連續(xù)灌胃后小鼠盲腸菌群數(shù)量檢測結(jié)果(x±s，n＝8)

注*與對照組比較(P＜0.05)⑤.實驗結(jié)果雙歧桿菌的形態(tài)及生化特性在BL平板上經(jīng)48-72小時培養(yǎng)后形成直徑為0.5-1mm的凸起、邊緣整齊，成乳白色的不透明菌落；鏡檢為G+，呈Y字型、V字型、彎曲狀等形態(tài)。
生化反應(yīng)接觸酶試驗(-)，吲哚試驗(-)，明膠液化實試驗(-)，硝酸鹽還原試驗(-)，尿素酶試驗(-)。
表1是褐藻膠低聚糖連續(xù)灌胃后小鼠各種腸道菌群數(shù)量檢測結(jié)果，表2是褐藻膠低聚糖連續(xù)灌胃后小鼠盲腸菌群數(shù)量檢測結(jié)果。表中的數(shù)值為活菌數(shù)/克糞便標(biāo)本的對數(shù)值。計數(shù)方法為每1g糞便的細菌數(shù)CFU·g-1＝菌落數(shù)×10n×40(10n為與菌落相對應(yīng)的稀釋度；40為換算常數(shù))，結(jié)果以每克糞便中的細菌菌落的對數(shù)值log CFU·g-1表示。表1和表2中所列的數(shù)值是以平均數(shù)(x)與標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示為x±s，n為各組小鼠的數(shù)量，n＝8。
表1和表2中某些數(shù)值的右上方標(biāo)號“1”表示與自身對照比較(P＜0.05)；標(biāo)號“2”表示與自身對照比較(P＜0.01)；標(biāo)號“3”表示與對照組比較(P＜0.05)。P為顯著性差異，采用SPSS 10.0 for Windows統(tǒng)計軟件得出。P＜0.01為差異極為顯著，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異無顯著性。
由表1可見，經(jīng)口給予小鼠褐藻膠低聚糖后，小鼠腸道內(nèi)的5種細菌數(shù)量發(fā)生變化。大豆低聚糖陽性對照組(B組)與空白對照組(A組)相比，雙歧桿菌的數(shù)量有增加趨勢，差異無顯著性(P＞0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量明顯增加，差異顯著(P＜0.05)；單獨褐藻膠給藥組(C組)與空白對照組(A組)相比，雙歧桿菌的數(shù)量有增加趨勢，差異無顯著性(P＞0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量明顯增加，差異顯著(P＜0.05)；低劑量褐藻膠低聚糖給藥組(D組)與空白對照組(A組)相比，雙歧桿菌的數(shù)量明顯增加(P＜0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量顯著增加(P＜0.05)，大腸桿菌與擬桿菌的數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。中劑量褐藻膠低聚糖給藥組(E組)與空白對照組(A組)相比，雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加(P＜0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量顯著增加(P＜0.05)，高劑量褐藻膠低聚糖給藥組(F組)與空白對照組(A組)相比，雙歧桿菌的數(shù)量明顯增加(P＜0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量有增加趨勢，差異無顯著性(P＞0.05)。
B組雙歧桿菌的數(shù)量增加了2.29倍，乳酸桿菌的數(shù)量增加了5.25倍。
C組雙歧桿菌的數(shù)量增加了1.23倍，乳酸桿菌的數(shù)量增加了5.37倍。
D組雙歧桿菌的數(shù)量增加了15.85倍，乳酸桿菌的數(shù)量增加了6.16倍。
E組雙歧桿菌的數(shù)量增加了7.58倍，乳酸桿菌的數(shù)量增加了4.17倍。
F組雙歧桿菌的數(shù)量增加了11.22倍，乳酸桿菌的數(shù)量增加了3.09倍。
經(jīng)以上的比較可知，B組對雙歧桿菌數(shù)量的增加低于D組，即，褐藻膠低聚糖對雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量增加程度優(yōu)于大豆寡糖。雙歧桿菌與乳酸桿菌數(shù)量的增加并不是因為褐藻膠多糖的原因。
由表2可見，經(jīng)口給予小鼠褐藻膠低聚糖后，小鼠盲腸內(nèi)的5種細菌數(shù)量發(fā)生變化。與對照組比較，D組(低劑量褐藻膠低聚糖給藥組)雙歧桿菌的數(shù)量明顯增加(P＜0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量顯著增加(P＜0.05)，大腸桿菌與擬桿菌的數(shù)量明顯減少(P＜0.05)。E組(中劑量褐藻膠低聚糖給藥組)雙歧桿菌的數(shù)量增加(P＜0.05)，乳酸桿菌的數(shù)量顯著增加(P＜0.05)。經(jīng)比較表中數(shù)據(jù)可知，B組對雙歧桿菌數(shù)量的增加低于D組，即，褐藻膠低聚糖對雙歧桿菌的數(shù)量增加程度優(yōu)于大豆寡糖。
綜上可知，褐藻膠低聚糖不被宿主胃腸道消化，選擇性的刺激雙歧桿菌與乳酸桿菌這兩種有益菌在宿主腸道內(nèi)生長，抑制大腸桿菌與擬桿菌的生長，進而增進宿主健康，是一種新型的益生元。褐藻膠低聚糖益生元用于調(diào)節(jié)腸道菌群的有效劑量為15.0-75.0mg/ml，以15.0-30.0mg/ml的劑量范圍為最優(yōu)。對雙歧桿菌的數(shù)量增加的效果優(yōu)于市售大豆低聚糖。
(2)受試者實驗受試者為血液，尿、便常規(guī)檢查及肝功能檢查，心率、血壓、心電圖檢查，指標(biāo)全部正常的志愿者15名(男7名，女8名)，受試者平均年齡(42.3±7.5)歲，近期無明顯內(nèi)分泌代謝性疾患，未曾使用抗生素等藥物，試驗期間正常飲食，無其他乳酸菌飲料使用。
實驗方法與動物實驗相同，受試者分別于服用前、服用7天后以及服用14天后，取糞便進行腸道菌群的分析。受試者服用受試物7天后，雙歧桿菌與乳酸桿菌的數(shù)量明顯增加，雙歧桿菌比服用前增加了5-7倍，乳酸桿菌比服用前增加了4.5-6倍，個別受試者雙歧桿菌比服用前增加了10倍，乳酸桿菌比服用前增加了11倍。大腸桿菌與擬桿菌的數(shù)量明顯減少，大腸桿菌比服用前減少了2-4倍，擬桿菌比服用前減少了3-4倍，腸球菌的數(shù)量未有明顯變化，4人便秘情況有所改善，表現(xiàn)為排便規(guī)律，糞便性狀正常，排便通暢。受試者服用受試物14天后雙歧桿菌比服用前增加了6.5-7.5倍，乳酸桿菌比服用前增加了5-6倍，大腸桿菌比服用前減少了2-4倍，擬桿菌比服用前減少了3-4倍，腸球菌的數(shù)量未有明顯變化。3人有食欲增加現(xiàn)象，2人排氣有所增加。無腹瀉，無腹痛癥狀出現(xiàn)。飲食、睡眠及精神狀態(tài)均良好。
本實施例中所用的褐藻膠低聚糖為酶解法制備的褐藻膠低聚糖，在上述實驗中把它改用化學(xué)氧化法制備的褐藻膠低聚糖和酸水解法制備的褐藻膠低聚糖時，其實驗方法與酶解法制備的褐藻膠低聚糖相同，效果也近似，在此不再重復(fù)。三者均具有選擇性的刺激雙歧桿菌與乳酸桿菌這兩種有益菌在宿主腸道內(nèi)生長，抑制大腸桿菌與擬桿菌的生長，進而增進宿主健康的功效，是一種新型的益生元。
本發(fā)明的褐藻膠低聚糖用作藥品時的劑量為5mg-10mg，每日2次口服；用作保健品時的劑量為2.5mg-5mg，每日2次口服；用作食品添加劑時的重量百分?jǐn)?shù)為0.1％-0.8％；用作飼料添加劑時的重量百分?jǐn)?shù)為0.5％-1％。所述的食品為酸奶、奶粉；所述的飼料為雞飼料、豬飼料、牛飼料。這四種用途經(jīng)7-14天就能明顯見效。
權(quán)利要求
1.褐藻膠低聚糖用作益生元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的益生元，其特征在于所述的褐藻膠低聚糖包括酶解法制備的褐藻膠低聚糖或化學(xué)氧化法制備的褐藻膠低聚糖或酸水解法制備的褐藻膠低聚糖；它們的平均分子量在500-2000kD范圍內(nèi)，聚合度在2-10的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的褐藻膠低聚糖，其特征在于所述的酶解法制備褐藻膠低聚糖的步驟是首先提取褐藻膠裂合酶，再將它按照10-50U的比例加入到1升重量百分比濃度為0.5％-1％的褐藻膠水溶液中，進行酶解反應(yīng)，酶解反應(yīng)溫度25-38℃，時間為6-8小時，最后通過離心或過濾除去未降解的大分子褐藻膠，用SephadexG25凝膠柱進行層析分離，收集褐藻膠低聚糖組分，濃縮干燥。
4.褐藻膠低聚糖用作藥品、保健品、食品添加劑或飼料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明將褐藻膠低聚糖用作益生元。動物和人體試驗證明褐藻膠低聚糖是一種非消化性低聚糖，能顯著促進雙歧桿菌和乳酸桿菌等腸道益生菌的生長，抑制病原菌、腐敗菌等有害菌的生長，起到了改善腸道微生態(tài)環(huán)境和凈化腸道的作用，能提高人體免疫力，改善內(nèi)分泌系統(tǒng)，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而達到改善人體亞健康狀態(tài)，發(fā)揮防治腫瘤、腸道感染等疾病以及延年益壽、美容等作用。因此，褐藻膠低聚糖是一種新型的益生元，它是一種新的藥品、保健品、食品添加劑或飼料添加劑。
文檔編號A23L1/30GK1562071SQ20041002392
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者于文功, 王曄, 李京寶, 韓峰, 路新枝, 宮倩紅 申請人:中國海洋大學(xué)