專利名稱：一株可高效降解噻吩硫的古地分枝桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一株新分離的可高效降解噻吩硫的古地分枝桿菌。
背景技術(shù)：
化石燃料煤和石油中所含有的有機(jī)硫和無機(jī)硫是環(huán)境的重要污染源，這些硫化物燃燒時(shí)排放出大量的二氧化硫等毒性氣體，由此造成大面積酸雨，嚴(yán)重污染大氣和水源，破壞生態(tài)平衡，危害人類生存。多年的持續(xù)開發(fā)使得現(xiàn)存含硫量較低的化石燃料越來越少。隨著能源危機(jī)的逐步加劇，高硫化石燃料的開采成為必然。高硫化石燃料必須預(yù)先經(jīng)過脫硫處理才能進(jìn)一步使用。物理的和化學(xué)的脫硫方法成本巨大，而微生物脫硫工藝由于操作壓力、溫度低，運(yùn)轉(zhuǎn)成本少，具有廣闊的前景?；剂现泻械挠袡C(jī)硫化合物成分復(fù)雜，大部分是雜環(huán)化合物，其中的C-S化學(xué)共價(jià)鍵十分牢固，用一般常規(guī)的物理和化學(xué)方法無法高效地除去有些雜環(huán)中的有機(jī)硫。
2000年夏天，我國(guó)開始實(shí)施新的燃油標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，汽油中硫化物的含量不得超過800ppm(part per million，百萬(wàn)分之，質(zhì)量百分比)。此項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)自2000年7月1日首先在北京、廣州和上海等城市實(shí)施，到2003年1月1日，國(guó)內(nèi)其它地區(qū)也將執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)。與舊標(biāo)準(zhǔn)中1200ppm的含硫量相比，新標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格。與此同時(shí)，最新的《世界汽車燃油規(guī)范》要求使用“無硫”或硫含量為5～10ppm的汽油和柴油。目前，我國(guó)仍然缺少有關(guān)低硫柴油的標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)估計(jì)，現(xiàn)今國(guó)內(nèi)使用的大部分柴油的含硫量都在3000ppm左右。這一現(xiàn)象引起了人們的廣泛關(guān)注，因?yàn)樽钚碌沫h(huán)保柴油和汽油發(fā)動(dòng)機(jī)都需要使用含硫量低的燃油，三元催化劑和微粒過濾裝置也會(huì)因硫化合物過多而中毒失效。如何降低化石燃料中的硫含量成為各國(guó)研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。
現(xiàn)今主要的燃油脫硫方法是物理化學(xué)及生物處理這兩種方法。物理化學(xué)的脫硫方法(Hydrodesulfurization，簡(jiǎn)稱HDS)是脫除燃料油中硫的主要的方法，HDS通過催化過程，將有機(jī)硫轉(zhuǎn)化成H2S氣體，反應(yīng)需要1033.5～20670kpa(千帕斯卡)的壓力和290～450℃的高溫。大部分的無機(jī)硫及沸點(diǎn)較低的有機(jī)硫化合物在此過程中很容易的脫去，但是沸點(diǎn)較高的雜環(huán)類含硫化合物卻很難脫除。
生物脫硫方法(Biodesulfurization，簡(jiǎn)稱BDS)條件溫和，設(shè)備簡(jiǎn)單，且具有高度的專一性，能夠脫除燃料中雜環(huán)含硫化合物中的有機(jī)硫且不損失燃料的熱值，是一種很有前途的脫硫方法，應(yīng)用前景十分廣泛。該方法具有成本廉價(jià)、高度專一性、反應(yīng)的條件溫和等一系列的優(yōu)點(diǎn)已被許多廠家所關(guān)注，很多國(guó)內(nèi)外的研究機(jī)構(gòu)也對(duì)BDS方法進(jìn)行了深入的研究。
最近幾年，發(fā)現(xiàn)能夠?qū)Ｒ恍越到獗讲⑧绶?Benzothiophene，簡(jiǎn)稱BT)的菌株，主要有戈登氏菌213E(Gordonia)，類芽孢桿菌A11-2(Paenibacillus)，紅球菌T09(Rhodococcus)，根瘤菌KT55(Sinorhizobium)及紅球菌KT462。它們的降解途徑已經(jīng)分析的較為清楚(如圖1)。其中Paenibacillus sp.A11-2，Sinorhizobium sp.KT55和Rhodococcus KT462菌株的BT降解途徑和二苯并噻吩(Dibenzothiophene，簡(jiǎn)稱DBT)的“4S”降解途徑比較類似。而Gordonia sp.213E和Rhodococcus sp.T09菌株BT降解途徑和上面的類似，只不過降解BT的終產(chǎn)物不是氧-羥基苯乙烯(o-hydroxystyrene)，而是2-(2’-羥苯基)乙醛(2-(2‘-hydroxyphenyl)ethan-1-al)。
目前，經(jīng)檢索能夠具有同時(shí)降解二苯并噻吩和苯并噻吩的能力的古地分枝桿菌還未見報(bào)道。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株新分離的可高效降解噻吩硫的古地分枝桿菌，該菌具有可同時(shí)降解二苯并噻吩和苯并噻吩的能力，這種能力在古地分枝桿菌中是首次發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明涉及的古地分枝桿菌為Mycobacterium goodii SDU-B，已于2004年1月13日保藏于德國(guó)微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏號(hào)為DSM 16135。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135不能運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢，形態(tài)為棒桿狀，長(zhǎng)2μm，直徑1μm，在MAMD培養(yǎng)基上以二苯并噻吩作為唯一硫源培養(yǎng)36小時(shí)后，菌落顏色為金黃色，由德國(guó)微生物菌種保藏中心所作的鑒定表明，上述Mycobacteriumgoodii SDU-B DSM 16135含有結(jié)核菌脂酸，并且上述結(jié)核菌脂酸的高效液相層析洗脫特征與Mycobacterium goodii DSM 44492非常相似，德國(guó)微生物菌種保藏中心所作的鑒定表明，上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的脂肪酸圖譜與Mycobacteriumgoodii DSM 44492非常相似，上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135不含有二級(jí)醇。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以在基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MAMD)上以無機(jī)硫，如Na2SO4，或有機(jī)含硫化合物如二甲基亞砜和噻吩類化合物作為唯一硫源生長(zhǎng)，也可以在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；上述基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母粉，200μL的維生素混合液，5mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升，115℃條件下滅菌20分鐘；固體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，115℃條件下滅菌20分鐘；其中微量元素混合液組成為1升蒸餾水中含ZnCl20.5g，F(xiàn)eCl20.5g，MnCl2·4H2O 0.5g，Na2MoO4·2H2O0.1g，CuCl2·2H2O 0.05g，Na2WO4·2H2O 0.05g，HCl 120mmol/L，維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)，200mg肌醇(Inositol)，400mg尼克酸/煙酸(Niacin)，400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)，200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，0.5mg VB12(Cyanocobalamin)；上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌15分鐘。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的生理生化特征，請(qǐng)參見說明書附圖5，附圖6和附圖7。
本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1384bp，序列如下ACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTTCGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATACCCTGCTGGTCGCATGGCCTGGTGGGGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCACAGACGAAGCGTAAGTGACGGTATGTGCAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCCCGTAGAGATATGGGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCTTTCAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGA通過在美國(guó)生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查閱國(guó)際相關(guān)的基因庫(kù)，本發(fā)明的菌株SDU-B其中有關(guān)菌株的16S rDNA基因序列雖有相似性(如表1所示)，但卻不完全相同，說明本菌株是首次分離鑒定。
表1 菌株SDU-B的16S rDNA與GenBank提交菌株序列相似性比較登陸路徑及菌相關(guān)菌株名稱 分值(Bits) 相似性gi|30065752|gb|AY177352.2| Mycobacterium sp.I5 137999％
gi|2072383|emb|Y12872.1|MSY12872 Mycobacterium goodii132699％gi|23477179|emb|AJ509013.1|MSP509013 Mycobacterium sp.CF1132699％gi|27527623|emb|AJ536041.1|MSM536041 Mycobacterium smegmatis 131798％gi|44526|emb|X52922.1|MSM16SRNMycobacterium smegmatis 131198％gi|707597|emb|Y08453.1|MS16S23S5 M.smegmatis 131198％gi|4107272|emb|AJ131761.1|MSM131761 Mycobacterium smegmatis 131198％gi|2072189|gb|U94745.1|MDU94745 Mycobacterium duvalii 130098％gi|1226011|emb|X93026.1|MCRO1016S Mycobacterium sp. 129698％gi|18447869|emb|AJ429044.1|MMO429044 Mycobacterium 129198％moriokaensegi|44274|emb|X52932.1|MFL16SRNMycobacterium flavescens128498％gi|19387302|gb|AF480575.1|Mycobacterium acapulcensis 127998％gi|45771901|emb|AJ634379.1| Mycobacterium confluentis 127898％gi|19387305|gb|AF480578.1|Mycobacterium flavescens strain ATCC127798％23008gi|27650897|emb|AJ536100.1|MEL536100 Mycobacterium elephantis127598％gi|18447871|emb|AJ429046.1|MPU429046 Mycobacterium pulveris 127398％gi|23955535|gb|AF544639.1|Mycobacterium vaccae127297％gi|23955534|bg|AF544638.1|Mycobacterium vaccae127297％gi|14583102|gb|AF385898.1|Mycobacterium elephantis127198％gi|1226013|emb|X93028.1|MCRO1716S Mycobacterium sp126598％進(jìn)一步通過軟件在美國(guó)生物工程信息中心使用BLASTN程序比對(duì)，對(duì)給出的序列使用Vector NTI軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，SDU-B和古地分枝桿菌位于同一個(gè)分支上，鑒定SDU-B為Mycobacterium goodii，如附圖8所示。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脫除石油及其產(chǎn)品中有機(jī)硫化合物的硫中的應(yīng)用。
上述脫硫的應(yīng)用方法中，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135脫除含硫有機(jī)化合物中的硫，是通過氧化斷裂C-S鍵的途徑實(shí)現(xiàn)的。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的應(yīng)用方法有(1)用二苯并噻吩為唯一硫源培養(yǎng)，收集菌體后用于化石燃料的脫硫；(2)用硫酸鈉為唯一硫源培養(yǎng)，收集菌體，直接用DBT誘導(dǎo)后用于化石燃料的脫硫；(3)用冷凍干燥的菌體細(xì)胞進(jìn)行脫硫；(4)用該細(xì)胞的片段或者細(xì)胞提取液進(jìn)行脫硫；(5)用該菌株中提純的生物活性物質(zhì)進(jìn)行脫硫；(6)該菌進(jìn)一步誘變處理后進(jìn)行脫硫。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可有效降解二苯并噻吩(DBT)和苯并噻吩(BT)及它們的甲基衍生物。上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135降解苯并噻吩后的中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的質(zhì)譜圖請(qǐng)參見說明書附圖2，附圖3和附圖4。上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135尤其可以脫除以二苯并噻吩(DBT)為代表的有機(jī)含硫化合物中的硫元素。在脫除以二苯并噻吩(DBT)為代表的一大類化石燃料中的含硫化合物時(shí)，專一性的攻擊C-S鍵，對(duì)C-C鍵不起作用，保留的化合物的碳架結(jié)構(gòu)。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在MAMD培養(yǎng)基中以二甲基亞砜、4，6-二甲基-二苯并噻吩、DBT-砜、二苯并噻吩、4-甲基-二苯并噻吩、5-甲基-苯并噻吩、3-甲基-苯并噻吩、噻吩乙酸、噻吩羧酸、噻吩等含硫化合物作為硫源時(shí)生長(zhǎng)良好。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的生長(zhǎng)和對(duì)不同硫源的利用情況見表2。
表2 Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135對(duì)不同硫源的生長(zhǎng)、利用情況生長(zhǎng)情況 含硫化合物含硫化合物*(OD620)的降解率(％)對(duì)照0.75aNTc二甲基亞砜 11.50aNT4，6-二甲基-二苯并噻吩 6.73a45.8DBT-砜 7.75a56.6二苯并噻吩 2.25a74.44-甲基-二苯并噻吩 2.38b61苯并噻吩2.46aNT5-甲基-苯并噻吩 4.63aNT3-甲基-苯并噻吩 6.13aNT噻吩乙酸8.85aNT噻吩羧酸4.83aNT噻吩1.04aNT*所用培養(yǎng)基為MAM培養(yǎng)基，所有含硫化合物的濃度均為0.5mMa以不同的含硫化合物作為硫源，在45℃下培養(yǎng)古地分枝桿菌SDU-B，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。
b以不同的含硫化合物作為硫源，在45℃下培養(yǎng)古地分枝桿菌SDU-B，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。
c代表沒有檢測(cè)。
上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135具有專一性的有效脫除含硫化合物的功能，特別是脫除石油及其產(chǎn)品中的硫的功能。該菌的休止細(xì)胞、固定化細(xì)胞和破碎的菌體片段以及細(xì)胞粗酶液和分離純化的酶組分同樣也具有專一性的有效脫除含硫化合物的功能。


本發(fā)明涉及的一株可高效降解噻吩硫的古地分枝桿菌，名為Mycobacteriumgoodii SDU-B，已于2004年1月13日保藏于“德國(guó)微生物菌種保藏中心”(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏號(hào)為DSM 16135。
附圖1為菌株代謝苯并噻吩(BT)的硫?qū)Ｒ煌緩?；其中A為苯并噻吩，B為苯并噻吩亞砜，C為苯并噻吩砜，D為苯并氧硫己二烯亞砜，E為苯并氧硫己二烯砜，F(xiàn)為氧-羥基苯乙烯。
附圖2底物苯并噻吩(BT)質(zhì)譜圖附圖3產(chǎn)物苯并氧硫己二烯砜(benzo[c][1，2]oxathiin S，S-dioxide)質(zhì)譜圖附圖4產(chǎn)物氧-羥基苯乙烯(o-hydroxystyrene)質(zhì)譜圖附圖5為本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在德國(guó)微生物菌種保藏中心所作的可利用碳源的檢測(cè)結(jié)果附圖6為本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在德國(guó)微生物菌種保藏中心所作的結(jié)核菌脂酸的高壓液相檢測(cè)結(jié)果附圖7為本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在德國(guó)微生物菌種保藏中心所作的結(jié)核菌脂酸高溫分解產(chǎn)物的氣相色譜檢測(cè)結(jié)果附圖8為本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的進(jìn)化樹附圖9為本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的降解二苯并噻吩(DBT)的結(jié)果附圖10為本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的降解4，6-二甲基-二苯并噻吩(4，6-DM-DBT)的結(jié)果附圖11為本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的降解4-甲基-二苯并噻吩(4-M-DBT)的結(jié)果附圖12為本發(fā)明的菌株Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的降解5-甲基-苯噻吩(5-M-BT)的結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的篩選從煉油廠污水排放口等地取得土樣、水樣，用基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MAMD)浸泡過夜，于45℃，200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)液去除土樣后離心得到菌體，所得菌體用生理鹽水洗滌兩次，懸浮于濃度為100mM的pH7.0的磷酸鉀緩沖液中，調(diào)整菌體濃度在2克干細(xì)胞/升。以體積百分比為10％的接種量將此菌液加入到含有0.5mM的DBT的上述基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基試管中，45℃培養(yǎng)48小時(shí)，再以體積百分比為10％的接種量轉(zhuǎn)入新鮮的含有0.5mM的DBT的基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天以上。用基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基作對(duì)照，有明顯生長(zhǎng)的，將此管的培養(yǎng)液稀釋涂布在固體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)挑出單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，得到能降解DBT的菌株。
該菌株不能運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢，形態(tài)為棒桿狀，長(zhǎng)2μm，直徑1μm，在MAMD培養(yǎng)基上以二苯并噻吩作為唯一硫源培養(yǎng)36小時(shí)后，菌落顏色為金黃色。
由德國(guó)微生物菌種保藏中心所作的鑒定表明，該菌株含有結(jié)核菌脂酸，并且上述結(jié)核菌脂酸的高效液相層析洗脫特征與Mycobacterium goodii DSM 44492非常相似，德國(guó)微生物菌種保藏中心所作的鑒定表明，該菌株的脂肪酸圖譜與Mycobacterium goodiiDSM 44492非常相似，該菌株不含有二級(jí)醇。
該菌株可以在基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MAMD)上以無機(jī)硫，如Na2SO4，或有機(jī)含硫化合物如二甲基亞砜和噻吩類化合物作為唯一硫源生長(zhǎng)，也可以在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
該菌株定名為Mycobacterium goodii SDU-B，已于2004年1月13日保藏于德國(guó)微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)，其保藏號(hào)為DSM 16135。
上述MAMD培養(yǎng)基組成1升蒸餾水中含10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母粉，200μL的維生素混合液，5 mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升。115℃條件下滅菌20分鐘。固體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，115℃條件下滅菌20分鐘。其中微量元素混合液組成為1升蒸餾水中含ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoicacid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌15分鐘。
實(shí)施例2上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株16S rDNA基因的提取培養(yǎng)5ml的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.5ml培養(yǎng)物，6000g離心2分鐘；沉淀物加入565μl的TE緩沖液，TE緩沖液配方如下10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用鹽酸調(diào)整pH為8.0，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，加入30μl質(zhì)量體積比為10％的十二烷基磺酸鈉(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1小時(shí)；加入100μl，5mol/LNaCl，充分混勻，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，CTAB/NaCl溶液配方如下質(zhì)量體積比為10％的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中，混勻，于65℃溫育10分鐘；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000g離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中，如果難以移出上清，先用牙簽除去界面物質(zhì)；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12000g離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入一支新管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻直到DNA沉淀下來，用一個(gè)封口的離心管將沉淀轉(zhuǎn)移至1ml的70％乙醇中洗滌；12000g離心5分鐘，棄上清，用凍干機(jī)稍加干燥，重溶于100μl的TE緩沖液。以提取的基因組DNA為模板，利用購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)有限公司的真細(xì)菌引物27f和1492r，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在50μl反應(yīng)體系依次混勻下列試劑35μl H2O，5μl10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)、100mmol/L的用鹽酸調(diào)整pH為8.8的Tris緩沖液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2，4μl 25mmol/LMgCl2，1μl 4種dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的基因組DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘。加入50μl礦物油再離心5秒鐘；將混合物在94℃加熱5分鐘。94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，總共25個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)混合物擴(kuò)增充分。PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序。該菌的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1384bp，序列如下ACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTTCGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATACCCTGCTGGTCGCATGGCCTGGTGGGGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCACAGACGAAGCGTAAGTGACGGTATGTGCAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCCCGTAGAGATATGGGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCTTTCAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGA實(shí)施例3制備上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)古地分枝桿菌Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株一環(huán)接種在裝有滅菌50ml的基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中，加入已滅菌的DBT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液，使DBT濃度為0.5mM，于45℃，180轉(zhuǎn)/分在搖床上培養(yǎng)36小時(shí)。吸取培養(yǎng)獲得的菌液5ml接種在裝有100ml的基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中，再加入已滅菌的DBT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液，使DBT濃度為0.1～0.5mM。將該錐形瓶放在搖床中，45℃，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48小時(shí)，制得Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135細(xì)胞的液體培養(yǎng)液。
實(shí)施例4制備上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株休止細(xì)胞液將通過實(shí)施例3的方法獲得菌株SDU-B的細(xì)胞的液體培養(yǎng)液5000g，離心10分鐘，倒去上清液。用適量生理鹽水洗滌離心3次，將所獲得的離心沉淀物懸浮于生理鹽水中，然后冷凍保藏于冰箱中，即制得Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的休止細(xì)胞。
實(shí)施例5上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脫除二苯并噻吩(DBT)中有機(jī)硫的應(yīng)用(1)將DBT配成50mM的DBT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液，并過濾除菌；(2)在300ml錐形瓶中依次放入滅菌培養(yǎng)基50ml，DBT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液0.5ml，使錐形瓶中DBT的濃度為0.5mM；(3)將實(shí)施例3制得的Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的細(xì)胞培養(yǎng)液5ml加入上述步驟(2)錐形瓶中，將錐形瓶放置在搖床中，于45℃，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，隔1小時(shí)取樣測(cè)定。其DBT降解的測(cè)定結(jié)果見附圖9，結(jié)果表明，Mycobacteriumgoodii SDU-B DSM 16135可以較好的脫除DBT中的硫，在6小時(shí)可以將0.5mM的DBT降解完全。
實(shí)施例6上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脫除4，6-二甲基-二苯并噻吩(4，6-DM-DBT)中有機(jī)硫的應(yīng)用(1)將4，6-DM-DBT配成50mM的4，6-DM-DBT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液，并過濾除菌；(2)在300ml錐形瓶中依次放入滅菌培養(yǎng)基50ml，4，6-DM-DBT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液0.5ml，使錐形瓶中4，6-DM-DBT的濃度為0.5mM；(3)將實(shí)施例3制得的Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的細(xì)胞培養(yǎng)液，或?qū)?shí)施例4制得的休止細(xì)胞培養(yǎng)液5ml加入上述步驟(2)錐形瓶中，將錐形瓶放置在搖床中，于45℃，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，隔1小時(shí)取樣測(cè)定。其4，6-DM-DBT降解的測(cè)定結(jié)果見附圖10，結(jié)果表明，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以較好的脫除4，6-DM-DBT中的硫，在12小時(shí)可以將0.5mM的4，6-DM-DBT降解掉93％。
實(shí)施例7上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脫除4-甲基-二苯并噻吩(4-M-DBT)中有機(jī)硫的應(yīng)用(1)將4-M-DBT配成50mM的4-M-DBT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液，并過濾除菌；(2)在300ml錐形瓶中依次放入滅菌培養(yǎng)基50ml，4-M-DBT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液0.5ml，使錐形瓶中4-M-DBT的濃度為0.5mM；(3)將實(shí)施例3制得的Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的細(xì)胞培養(yǎng)液，或?qū)?shí)施例4制得的休止細(xì)胞培養(yǎng)液5ml加入上述步驟(2)錐形瓶中，將錐形瓶放置在搖床中，于45℃，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，隔1小時(shí)取樣測(cè)定。其4-M-DBT降解的測(cè)定結(jié)果見附圖11，結(jié)果表明，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以較好的脫除4-M-DBT中的硫，在12小時(shí)可以將0.5mM的4-M-DBT降解掉70.6％。
實(shí)施例8上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135在脫除5-甲基-苯噻吩(5-M-BT)中有機(jī)硫的應(yīng)用(1)將5-M-BT配成50mM的5-M-BT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液，并過濾除菌；
(2)在300ml錐形瓶中依次放入滅菌培養(yǎng)基50ml，5-M-BT-二甲基甲酰胺儲(chǔ)液0.5ml，使錐形瓶中5-M-BT的濃度為0.5mM；(3)將實(shí)施例3制得的Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135菌株的細(xì)胞培養(yǎng)液，或?qū)?shí)施例4制得的休止細(xì)胞培養(yǎng)液5ml加入上述步驟(2)錐形瓶中，將錐形瓶放置在搖床中，于45℃，180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)，隔1小時(shí)取樣測(cè)定。其5-M-BT降解的測(cè)定結(jié)果見附圖12，結(jié)果表明，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以較好的脫除5-M-BT中的硫，在4小時(shí)可以將0.5mM的5-M-BT降解完全。
權(quán)利要求
1.一株可高效降解噻吩硫的古地分枝桿菌，其特征在于該古地分枝桿菌名為Mycobacterium goodii SDU-B，2004年1月13日保藏于“德國(guó)微生物菌種保藏中心”，其保藏號(hào)為DSM 16135。
2.如權(quán)利要求1所述的古地分枝桿菌，其特征在于該Mycobacterium goodiiSDU-B DSM 16135菌株，其細(xì)菌學(xué)特征是形態(tài)為棒桿狀，長(zhǎng)2μm，直徑1μm，菌落顏色為金黃色，不能運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢；上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135含有結(jié)核菌脂酸，并且上述結(jié)核菌脂酸的高效液相層析洗脫特征與Mycobacterium goodii DSM 44492非常相似；上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135的脂肪酸圖譜與Mycobacteriumgoodii DSM 44492非常相似，上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135不含有二級(jí)醇；上述Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135可以在基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MAMD)上以噻吩類化合物作為唯一硫源生長(zhǎng)，也可以在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；上述基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL質(zhì)量百分比為1％的CaCl2，2mL質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O，200μL質(zhì)量百分比為1％的FeCl3，200μL質(zhì)量百分比為5％的NaCl，5mL質(zhì)量百分比為1％的酵母粉，200μL的維生素混合液，5mL的金屬離子混合液，加蒸餾水到1升，115℃條件下滅菌20分鐘；固體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，115℃條件下滅菌20分鐘；其中微量元素混合液組成為1升蒸餾水中含ZnCl20.5g，F(xiàn)eCl20.5g，MnCl2·4H2O 0.5g，Na2MoO4·2H2O0.1g，CuCl2·2H2O 0.05g，Na2WO4·2H2O 0.05g，HCl 120mmol/L，維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calcium pantothenate)，200mg肌醇(Inositol)，400mg尼克酸/煙酸(Niacin)，400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)，200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，0.5mg VB12(Cyanocobalamin)；上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌15分鐘。
3.如權(quán)利要求1或2所述的古地分枝桿菌，其特征在于所述菌株Mycobacteriumgoodii SDU-B DSM 16135可在MAMD培養(yǎng)基中以二苯并噻吩、二苯并噻吩衍生物、苯并噻吩、苯并噻吩衍生物和噻吩衍生物為唯一硫源生長(zhǎng)。
4.如權(quán)利要求3中所述的古地分枝桿菌，其特征在于，所述的二苯并噻吩衍生物包括4，6-二甲基-二苯并噻吩、DBT-砜、4-甲基-二苯并噻吩。
5.如權(quán)利要求3中所述的古地分枝桿菌，其特征在于，所述的苯并噻吩衍生物包括5-甲基-苯并噻吩、3-甲基-苯并噻吩。
6.如權(quán)利要求3中所述的古地分枝桿菌，其特征在于，所述的噻吩衍生物包括噻吩乙酸、噻吩羧酸。
7.如權(quán)利要求1或2所述的古地分枝桿菌，其特征在于所述菌株Mycobacteriumgoodii SDU-B DSM 16135的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1384bp，其序列如下ACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCTTCGGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGAATATACCCTGCTGGTCGCATGGCCTGGTGGGGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCACAGACGAAGCGTAAGTGACGGTATGTGCAGAAGAAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCCCGTAGAGATATGGGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCTTTCAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTTGTGGGA
8.如權(quán)利要求1或2所述的古地分枝桿菌在脫除石油及其產(chǎn)品中有機(jī)硫化合物的硫中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求7所述的古地分枝桿菌在脫除石油及其產(chǎn)品中有機(jī)硫化合物的硫中的應(yīng)用，其特征在于脫硫的應(yīng)用方法中，Mycobacterium goodii SDU-B DSM 16135脫除含硫有機(jī)化合物中的硫，是通過氧化斷裂C-S鍵的途徑實(shí)現(xiàn)的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株可高效降解噻吩硫的古地分枝桿菌，名為Mycobacterium goodii SDU－B，已于2004年1月13日保藏于“德國(guó)微生物菌種保藏中心”，其保藏號(hào)為DSM16135；該菌株不能運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢，形態(tài)為棒桿狀，長(zhǎng)2μm，直徑1μm，菌落顏色為金黃色，結(jié)核菌脂酸和脂肪酸分析表明，該菌株與Mycobacterium goodii DSM 44492非常相似；本發(fā)明還公開了該菌株的細(xì)胞培養(yǎng)液通過氧化斷裂C－S鍵高效脫除石油及其產(chǎn)品中的含硫化合物中的硫的應(yīng)用方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1644678SQ20041002451
公開日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2004年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月21日
發(fā)明者許平, 李福利, 馮進(jìn)輝, 馬翠卿, 鄭媛, 孟玲 申請(qǐng)人:山東大學(xué)