專利名稱：紅豆杉3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶a合成酶蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在紅豆杉中表達(dá)的tm-Hmgs蛋白(紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白，Taxusmedia 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Synthase，TMHMGS)及其核酸序列。
背景技術(shù)：
紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是一種存在于紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus spp.)植物樹皮、針葉中的紫杉烷二萜類化合物。紫杉醇是經(jīng)美國FDA(1992)認(rèn)證的目前最好的天然抗癌藥物之一，在臨床上被廣泛用于治療晚期卵巢癌，乳腺癌及其它癌癥。當(dāng)前，紫杉醇藥源的嚴(yán)重匱乏，已經(jīng)成為制約紫杉醇相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大障礙。近年來植物基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，為利用現(xiàn)代生物技術(shù)提高紫杉醇或其前體的含量開辟了一條嶄新的途徑。利用現(xiàn)代生物技術(shù)將紫杉醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因(或轉(zhuǎn)錄因子)導(dǎo)入紅豆杉中，獲得轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系、組織或再生植株，并進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，是實現(xiàn)從根本上提高紫杉醇含量的最佳途徑。
由于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶是MVA途徑中的一個重要的代謝酶，能夠催化乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A，隨后在HMG-CoA還原酶(HMGR)的作用下生成甲羥戊酸(MVA)，甲羥戊酸經(jīng)焦磷酸化和脫羧作用形成C5的IPP，從而為紫杉醇合成提供通用前體。通過提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶的活性或含量，可以間接的提高紅豆杉中紫杉醇或其前體的含量。
在對現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，“The Plant Journal(植物期刊)，2000，22415-426”和“Scinece Asia(亞洲科學(xué))2002，2829-36”等先后報道從油菜和橡膠樹中克隆了3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因，至今尚未發(fā)現(xiàn)有與本發(fā)明主題相同的文獻(xiàn)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種紅豆杉tm-Hmgs蛋白編碼序列。使其包含所說基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體，被所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的所說基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物將具有顯著提高的紫杉醇含量。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有紅豆杉tm-Hmgs蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第98-1528位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第98-1528位的核苷酸序列雜交。
所述的編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。
所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第98-1528位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的紅豆杉tm-Hmgs蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
所述的蛋白多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發(fā)明所提供的載體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。該宿主細(xì)胞包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“紅豆杉tm-Hmgs蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有紅豆杉tm-Hmgs蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第98-1528位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第98-1528位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第98-1528位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第98-1528位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第98-1528位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的紅豆杉tm-Hmgs蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“紅豆杉tm-Hmgs蛋白或多肽”指具有紅豆杉tm-Hmgs蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然紅豆杉tm-Hmgs蛋白相同功能的SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括紅豆杉tm-Hmgs蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的紅豆杉tm-Hmgs蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與紅豆杉tm-Hmgs蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用紅豆杉tm-Hmgs蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“紅豆杉tm-Hmgs蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


表286％ identity in 1330 nt over lapQuery119 gttggtattttggcgatggaggtttactttccgactacttgtgtccagcaggatgccctg 178||||| |||||||| |||||| | |||||||| ||||| |||||||||||||| | | ||Sbjct112 gttgggattttggctatggagatctactttcctactacatgtgtccagcaggaggacttg 171Query179 gaaacatttgatggagtaagtaaaggaaaatatacaattggccttggacaagactgcatg 238||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||Sbjct172 gaaacttttgatggagtaagtaaaggaaaatatacaattggtcttggacaagactgcatg 231
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表385％identity in 466 aa over lap，92％similarity in 466 aa over lapQuery1 MASPQENVGILAMEVYFPTTCVQQDALETFDGVSKGKYTIGLGQDCMTFCTDLEDVISMS 60MAS ENVGILAME+YFPTTCVQQ+ LETFDGVSKGKYTIGLGQDCMTFCTDLEDVISMSSbjct1 MASRPENVGILAMEIYFPTTCVQQEDLETFDGVSKGKYTIGLGQDCMTFCTDLEDVISMS 60Query61 LTVVTSLLEKYAIDPKQIGRLEVGSETVIDKSKSIKTWLMCIFEKCGNTEIEGVDSTNAC 120LT VTSLLEKY IDPKQIGRLEVGSETVIDKSKSIKTWLM IFEKCGNTEIEGVDSTNACSbjct61 LTAVTSLLEKYEIDPKQIGRLEVGSETVIDKSKSIKTWLMHIFEKCGNTEIEGVDSTNAC 120Query121 YGGTAALFNCVNWVQSSSWDGRYGLVVATDSAVYAEGPARPTGGAAAIAMLIGPNAPIAF 180YGGTAALFNC+NW++SSSWDGRYGLVVATDSAVYAEG ARPTGGAAA+AMLIGPNAPIASbjct121 YGGTAALFNCINWIESSSWDGRYGLVVATDSAVYAEGAARPTGGAAAVAMLIGPNAPIAT 180Query181 ENRYRGTHMAHAYDFYKPNLASEYPVVDGKLSQTCYLKALDSCYKRFCNKFEKGEGHQFS 240E++YRGTHMAH YDFYKPNLASEYPVVDGKLSQTCYL ALDSCYKRFCNKFEK EG QFSSbjct181 ESKYRGTHMAHVYDFYKPNLASEYPVVDGKLSQTCYLMALDSCYKRFCNKFEKEEGRQFS 240Query241 LLDADYVAFHSPYNKLVQKSFARLLFNDFSRHASSAGKDAQEKLEPYAGLSEEESYSSRD 300LLD DY+AFHSPYNKLVQKSF RLLFNDFSRHA S GKDAQEKLEP+AGLSE++SY+SRDSbjct241 LLDTDYIAFHSPYNKLVQKSFGRLLFNDFSRHARSVGKDAQEKLEPFAGLSEQDSYNSRD 300Query301 LEKVSQQAAKPLYDEKVQPSTLLPKKEGNMYTASLYAALASIIHNKYSTLEGQRVLMFSY 360LEKVSQQ AKPLYD K+QPSTLLPK+ GNMYTASLYAALASIIHNK++TL+GQRV+MFSYSbjct301 LEKVSQQLAKPLYDAKIQPSTLLPKQVGNMYTASLYAALASIIHNKHTTLDGQRVMMFSY 360Query361 GSGLASTMFSLKIREGQHPFILSNIAEAMDLQSKLESQHEFSPEDFVDNLRLMETLYGAK 420GSGLAST+FS KIREGQ PF LSNI E MD+Q+KL+S+HEF PEDFV+NL+ METLYGAKSbjct361 GSGLASTLFSFKIREGQFPFTLSNITEVMDVQNKLDSRHEFLPEDFVENLKRMETLYGAK 420Query421 DFVSCAQHNLLRPGTFYLTEVDSMYRRFYSQKLVSLDDNCRETKFANGT 469DFVS +Q +LLRPG FYLT+VDSMYRRFYS+K++S DN ++K ANGTSbjct421 DFVSTSQLSLLRPGAFYLTKVDSMYRRFYSRKVISAGDNFEKSKLANGT 469Query紅豆杉tm-Hmgs氨基酸序列Sbjct歐洲赤松ps-Hmgs氨基酸序列(GenBank Accession No.CAA65250.1)表3為本發(fā)明的紅豆杉tm-Hmgs蛋白的氨基酸序列與歐洲赤松ps-Hmgs的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
發(fā)明還包括紅豆杉tm-Hmgs蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的紅豆杉tm-Hmgs蛋白多肽時，可以將紅豆杉tm-Hmgs蛋白編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成紅豆杉tm-Hmgs蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析紅豆杉tm-Hmgs蛋白基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析紅豆杉tm-Hmgs蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有紅豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼紅豆杉tm-Hmgs蛋白的核酸分子。
本發(fā)明涉及檢測樣品中是否存在紅豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于紅豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的紅豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選紅豆杉tm-Hmgs蛋白同源基因或同源蛋白。
為了得到與紅豆杉tm-Hmgs蛋白基因相關(guān)的紅豆杉cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選紅豆杉cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對紅豆杉tm-Hmgs蛋白的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自紅豆杉的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與紅豆杉tm-Hmgs蛋白的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的紅豆杉tm-Hmgs蛋白核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的紅豆杉tm-Hmgs蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與紅豆杉tm-Hmgs蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。本發(fā)明的紅豆杉tm-Hmgs蛋白基因可通過基因工程技術(shù)用來提高紅豆杉中紫杉醇或其前體的含量，而紫杉醇在臨床抗癌上具有巨大的應(yīng)用價值，對保護(hù)人民的健康生長有所幫助。因而本發(fā)明具有很大的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
下面結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1曼地亞紅豆杉tm-Hmgs蛋白基因的克隆1.組織分離(isolation)紅豆杉(品種為“曼地亞”)幼嫩葉片來源于西南師范大學(xué)，采取材料后，立即置于液氮中冷凍保存。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Ful1-length cDNA)根據(jù)一些植物Hmgs的氨基酸保守序列，設(shè)計兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個階段進(jìn)行(1)3’-RACEPCR(UPM+F2)得到TMF2’(1580bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知的木本植物如橡膠樹(Heveabrasiliensis)等的Hmgs基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個Hmgs基因。
(2)5’-RACE根據(jù)3’RACE結(jié)果，設(shè)計反向特異引物R2，經(jīng)PCR (UPM+R2)得到TMR2’(885bp)(過程同(1))?；厥?，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。
(3)將5’RACE測序結(jié)果與3’RACE測序結(jié)果比序并進(jìn)行拼接，得到全長片段序列信息，并設(shè)計一對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增tm-Hmgs編碼區(qū)(KF1+KR1)得到tm-Hmgs編碼區(qū)(1431bp)(過程同(1))。
BLAST的結(jié)果證明從紅豆杉中新得到的基因確為一個植物Hmgs基因。由于已知的擬南芥3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶具有乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的功能(Montamat，et al.，1995)，故推測此新克隆的基因具有相同的功能。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的紅豆杉TmHMGS的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計引物TmHMGSF15’-GGCAGAGAGCCATATTTGTTCTC-3’(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸TmHMGSR15’-CTTTTCAAAATGTATATTGATTGA-3’(SEQ ID NO.2)為反向引物，以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，TmHMGSF1/TmHMGSR2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃1分鐘、58℃1分鐘和72℃2分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為1776bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.3所示的序列。
實施例2紅豆杉tm-Hmgs蛋白基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的紅豆杉tm-Hmgs蛋白全長eDNA的長度為1776bp，詳細(xì)序列見SEQID NO.3，其中開放讀框位于98-1528位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出紅豆杉tm-Hmgs蛋白的氨基酸序列，共476個氨基酸殘基，分子量52859.09，pI為5.23。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.4。
將曼地亞紅豆杉tm-Hmgs蛋白的全長eDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與歐洲赤松3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因(X96386.1)在核苷酸水平上具有86％的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它與歐洲赤松3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶(GenBank Accession No.CAA65250.1)有85％的相同性和92％的相似性(見表3)。由此可見，曼地亞紅豆杉tm-Hmgs蛋白與歐洲赤松3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認(rèn)為曼地亞紅豆杉tm-Hmgs蛋白在功能上也相似。
實施例3紅豆杉tm-Hmgs蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)及提純在該實施例中，將全長的紅豆杉tm-Hmgs蛋白編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
將紅豆杉tm-Hmgs蛋白多肽以融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)紅豆杉tm-Hmgs蛋白的氨基酸序列，設(shè)計蛋白編碼區(qū)的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這根據(jù)選用的pET32a(+)載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將紅豆杉tm-Hmgs蛋白基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pET32a(+)載體(Novagen)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，篩選鑒定得到含有pET32a(+)-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶表達(dá)載體的工程菌BL21-pET32a(+)-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶。
表達(dá)Trx-tm-Hmgs重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的BL21-pET32a(+)-tm-Hmgs工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達(dá)Trx-3-tm-Hmgs融合蛋白的工程菌。
Trx-3-tm-Hmgs融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)Trx-tm-Hmgs融合表達(dá)蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-tm-Hmgs，經(jīng)離心沉淀收集菌體，并根據(jù)廠家(Novagen)的說明書以BugBuster試劑和Benzonase核酸酶來純化包涵體。包涵體可用溶解緩沖液(50mM CAPS，pH11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)來溶解，再用透析緩沖液(200mMTris-HCl，pH8.5)來透析。然后用組氨酸結(jié)合(His·Bind)樹脂進(jìn)行親和層析，并經(jīng)洗脫緩沖液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脫來收集Trx-tm-Hmgs融合蛋白。融合蛋白經(jīng)腸激酶20℃酶切16小時后即可分離獲得tm-Hmgs的表達(dá)蛋白。
純化的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶的活力測定按Suwanmanee等(Plant science，2004，166531～537)的方法對表達(dá)純化的3-羥基3甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白進(jìn)行酶活力的測定，研究其對3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A生成的影響。反應(yīng)體系含有0.1M Tris-HCL(pH＝8.0)，0.2mM乙酰輔酶A，0.05mM乙酰乙酰輔酶A，0.1mM EDTA及10ul酶蛋白樣品，總體積為100ul.反應(yīng)流程如下首先將14C標(biāo)記的乙酰輔酶A加入到?jīng)]有標(biāo)記的?；?67dpsnmol-1)中稀釋成混合物，30℃預(yù)培養(yǎng)2分鐘.在加入乙酰輔酶A后的2和4分鐘，取等量的40微升的混合物轉(zhuǎn)移到玻璃小瓶中并加入100微升的6M HCL，然后在95℃干燥。在烘干的過程中，硫酯被羥化，未參與反應(yīng)的14C標(biāo)記的乙?；徽舭l(fā)了，只有14C標(biāo)記的HMG酸仍然保留在瓶子中，加入500微升的水，用液體閃爍記數(shù)器測定14C標(biāo)記的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的含量。為了計算在上述程序沒有去除干凈的14C標(biāo)記的乙酰輔酶A的殘余量，實驗中設(shè)計了一個平行對照。結(jié)果表明，表達(dá)的蛋白的確具有催化乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的酶活性。
實施例4紅豆杉tm-Hmgs蛋白在煙草中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)將含目的基因(紅豆杉tm-Hmgs蛋白基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)紅豆杉tm-Hmgs蛋白的全長序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將紅豆杉tm-Hmgs蛋白基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草1.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落，接種于2ml YEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時；7.將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；8.約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
利用Northern blotting檢測tm-Hmgs蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)1.RNA的提取待轉(zhuǎn)基因煙草葉片長到2-3片葉時抽取煙草葉的RNA。以正常生長的植株作為對照(條件同上)，利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5.膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；轉(zhuǎn)基因煙草的tm-HMGS轉(zhuǎn)錄水平比未轉(zhuǎn)基因的對照材料的表達(dá)水平明顯高得多。
含紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因(tmhmgs)的轉(zhuǎn)基因煙草植株中的tm-Hmgs蛋白活性測定1.蛋白的提取a)取500mg葉片，加入1000ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于50ml eppondorf管中研磨；b)13000，4℃離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過程于冰上進(jìn)行。
2.蛋白的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入1ml Bradford試劑，混勻后，分光光度計測OD595；蛋白含量計算1 OD595＝28.57μg。
3.tm-Hmgs蛋白活性測定參考Suwanmanee等(Plant science，2004，166531～537)的方法(詳細(xì)操作過程同實例3)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株的中的tm-Hmgs蛋白酶活性比沒有轉(zhuǎn)基因的對照明顯高得多(P＜0.05)。從而再次證明所克隆的紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因的確具有催化乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的酶活性，將可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高植物的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A酶表達(dá)量的研究和產(chǎn)業(yè)化中。本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GGCAGAGAGCCATATTTGTTCTC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2CTTTTCAAAATGTATATTGATTGA(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度1776bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3
(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度476(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.4
<110>上海交通大學(xué)<120>紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白編碼序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1776<212>DNA<213>紅豆杉(Taxus media)<220>
<221>CDS<222>(98)..(1528)<223>
<400>1ggcagagagc catatttgtt ctctgtgttt ccagcggcaa aaactcggtg caaggtagag60gaactgtaaa ctatttttga atttttttca ataggga atg gcg tcc cct caa gaa 115Met Ala Ser Pro Gln Glu1 5aac gtt ggt att ttg gcg atg gag gtt tac ttt ccg act act tgt gtc 163Asn Val Gly Ile Leu Ala Met Glu Val Tyr Phe Pro Thr Thr Cys Val10 15 20cag cag gat gcc ctg gaa aca ttt gat gga gta agt aaa gga aaa tat 211Gln Gln Asp Ala Leu Glu Thr Phe Asp Gly Val Ser Lys Gly Lys Tyr25 30 35
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Phe Cys Thr Asp Leu Glu Asp Val Ile Ser Met Ser Leu Thr Val Val50 55 60Thr Ser Leu Leu Glu Lys Tyr Ala Ile Asp Pro Lys Gln Ile Gly Arg65 70 75 80Leu Glu Val Gly Ser Glu Thr Val Ile Asp Lys Ser Lys Ser Ile Lys85 90 95Thr Trp Leu Met Cys Ile Phe Glu Lys Cys Gly Asn Thr Glu Ile Glu100 105 110Gly Val Asp Ser Thr Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Thr Ala Ala Leu Phe115 120 125Asn Cys Val Asn Trp Val Gln Ser Ser Ser Trp Asp Gly Arg Tyr Gly130 135 140Leu Val Val Ala Thr Asp Ser Ala Val Tyr Ala Glu Gly Pro Ala Arg145 150 155 160Pro Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ile Ala Met Leu Ile Gly Pro Asn Ala165 170 175Pro Ile Ala Phe Glu Asn Arg Tyr Arg Gly Thr His Met Ala His Ala180 185 190Tyr Asp Phe Tyr Lys Pro Asn Leu Ala Ser Glu Tyr Pro Val Val Asp195 200 205Gly Lys Leu Ser Gln Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Ser Cys Tyr210 215 220
Lys Arg Phe Cys Asn Lys Phe Glu Lys Gly Glu Gly His Gln Phe Ser225 230 235240Leu Leu Asp Ala Asp Tyr Val Ala Phe His Ser Pro Tyr Asn Lys Leu245 250 255Val Gln Lys Ser Phe Ala Arg Leu Leu Phe Asn Asp Phe Ser Arg His260 265 270Ala Ser Ser Ala Gly Lys Asp Ala Gln Glu Lys Leu Glu Pro Tyr Ala275 280 285Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ser Tyr Ser Ser Arg Asp Leu Glu Lys Val290 295 300Ser Gln Gln Ala Ala Lys Pro Leu Tyr Asp Glu Lys Val Gln Pro Ser305 310 315 320Thr Leu Leu Pro Lys Lys Glu Gly Asn Met Tyr Thr Ala Ser Leu Tyr325 330 335Ala Ala Leu Ala Ser Ile Ile His Asn Lys Tyr Ser Thr Leu Glu Gly340 345 350Gln Arg Val Leu Met Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Leu Ala Ser Thr Met355 360 365Phe Ser Leu Lys Ile Arg Glu Gly Gln His Pro Phe Ile Leu Ser Asn370 375 380Ile Ala Glu Ala Met Asp Leu Gln Ser Lys Leu Glu Ser Gln His Glu
385 390 395 400Phe Ser Pro Glu Asp Phe Val Asp Asn Leu Arg Leu Met Glu Thr Leu405 410 415Tyr Gly Ala Lys Asp Phe Val Ser Cys Ala Gln His Asn Leu Leu Arg420 425 430Pro Gly Thr Phe Tyr Leu Thr Glu Val Asp Ser Met Tyr Arg Arg Phe435 440 445Tyr Ser Gln Lys Leu Val Ser Leu Asp Asp Asn Cys Arg Glu Thr Lys450 455 460Phe Ala Asn Gly Thr Ile Ser Ser Asn Gly Glu Leu465 470 47權(quán)利要求
1.一種紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白編碼序列，其特征在于，所分離出的DNA分子包括編碼具有紅豆杉tm-Hmgs蛋白多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第98-1528位的核苷酸序列有至少70％的同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白編碼序列，其特征是，所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第98-1528位的核苷酸序列雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白編碼序列，其特征是，所述的紅豆杉tm-Hmgs蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白編碼序列，其特征是，所述的DNA分子，其轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，是真核細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的紅豆杉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白編碼序列，其特征是，所述的宿主細(xì)胞，包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
一種涉及生物基因工程領(lǐng)域的紅豆杉3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A合成酶蛋白編碼序列。所分離出的DNA分子包括編碼具有紅豆杉tm－Hmgs蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第98－1528位的核苷酸序列有至少70％的同源性；所述的核苷酸序列能在40－55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第98－1528位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明是一種催化乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合生成3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A的酶，有助于提高紫杉醇或其前體的含量，對于紫杉醇藥源的嚴(yán)重匱乏問題的解決和保護(hù)人民的健康生長有所幫助。
文檔編號C12N9/00GK1584033SQ20041002489
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月3日
發(fā)明者開國銀, 苗志奇, 唐克軒 申請人:上海交通大學(xué)