專(zhuān)利名稱(chēng)：一種蟲(chóng)草真菌及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥用真菌，特別地，涉及一種大團(tuán)囊蟲(chóng)草(Cordycepsophioglossoides)純菌株及其分離的方法。
背景技術(shù)：
由于野生資源的匱乏和生長(zhǎng)環(huán)境的惡化，許多名貴藥用真菌瀕臨滅絕，如何挽救這些寶貴的藥用資源、滿足藥物開(kāi)發(fā)需要顯得尤為重要，利用微生物技術(shù)分離篩選出活性菌株，采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的藥材生產(chǎn)很有必要。
大團(tuán)囊蟲(chóng)草是一種名貴中草藥，我國(guó)南方地區(qū)民間使用較為普遍，具有悠久的歷史。其子實(shí)體內(nèi)含豐富的生物堿，總稱(chēng)麥角堿，在治療婦科疾病方面藥用價(jià)值極高，主要用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、閉經(jīng)等病，對(duì)產(chǎn)后出血、促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)原也具有顯著效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從一種名貴藥用蟲(chóng)草真菌的野生子實(shí)體上分離得到單一菌株，并根據(jù)其形態(tài)特征及基于18S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，從而使得采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的藥材生產(chǎn)成為可能。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明分離出的蟲(chóng)草真菌，其特征在于，它是從大團(tuán)囊蟲(chóng)草(Cordyceps ophioglossoides)子實(shí)體上分離純化得到的該真菌的純菌株，其18S rDNA具有SEQ ID No.1的序列。保存在中國(guó)專(zhuān)利局指定的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存編號(hào)為CGMCC No.1146。
本發(fā)明還提供了一種分離權(quán)利要求1所述的藥用蟲(chóng)草真菌的方法，其特征在于，分為以下步驟(1)選擇大團(tuán)囊蟲(chóng)草子實(shí)體選子囊果大、柄短、八九分成熟的大團(tuán)囊蟲(chóng)草子實(shí)體，切去蓋兩基部；(2)消毒滅菌在無(wú)菌箱內(nèi)以濃度為0.1％的升汞水浸泡，再用濃度為75％酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄，進(jìn)行表面消毒；3)接種接種時(shí)，將子實(shí)體切開(kāi)，在其萌蓋和菌柄交界處，挑取一小塊組織；移接到馬鈴薯蔗糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基PSA上；4)培養(yǎng)在20℃～30℃溫度下培養(yǎng)7～10天，待組織上產(chǎn)生白色絨毛狀菌絲，轉(zhuǎn)管擴(kuò)大即得到大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌種。
本發(fā)明具有以下技術(shù)效果大團(tuán)囊蟲(chóng)草是我國(guó)傳統(tǒng)的具有藥用價(jià)值的大型真菌，目前只有對(duì)野生資源的利用，以致藥源銳減。本發(fā)明利用從野生植株上分離純化得到純的大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌株，并通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法、發(fā)酵方法以及現(xiàn)代基因手段進(jìn)行鑒定，為利用此菌進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)該藥材、緩解野生資源的匱乏提供了基礎(chǔ)和可能。
本發(fā)明的大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌已在中國(guó)專(zhuān)利局指定的保藏單位“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”保藏，保藏日期為2004年5月14日，保藏編號(hào)為CGMCC No.1146。
具體實(shí)施例方式
下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的蟲(chóng)草真菌的分離方法如下本發(fā)明的大團(tuán)囊蟲(chóng)草野生植株寄生在地下生長(zhǎng)的大團(tuán)囊菌(Elaphomycesgranulatus Fr)的子實(shí)體上，子囊果球形，直徑為1～4.5厘米，褐色，堅(jiān)硬；子座根狀生于基物外，直立，頭狀，有長(zhǎng)柄多分枝，高矮不等，一般2～15厘米，棍棒狀，褐色。子囊柄不易水解，子囊孢子線形。分離得到的菌株在固體平板上的形態(tài)特征，菌落叢生、白色絲狀菌絲體。液體培養(yǎng)時(shí)菌液變混，產(chǎn)生球狀菌絲體，初菌絲體為白色，后漸變?yōu)楹稚?br> 本發(fā)明采用組織分離培養(yǎng)法，選子囊果大、柄短、八九分成熟的野生品種，切去蓋兩基部，在無(wú)菌箱內(nèi)以體積百分比濃度為0.1％的升汞水浸10～20分鐘，再用體積百分比濃度為75％酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進(jìn)行表面消毒。接種時(shí)，將種子實(shí)體切開(kāi)，在萌蓋和菌柄交界處，挑取一小塊組織；移接到馬鈴薯蔗糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(PSA)上。在20℃～30℃溫度下培養(yǎng)7～10天，待組織上產(chǎn)生白色絨毛狀菌絲，轉(zhuǎn)管擴(kuò)大即得到大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌種。
下面進(jìn)行蟲(chóng)草真菌菌種的鑒定(1)蟲(chóng)草真菌的形態(tài)及理化特征群體形態(tài)固體培養(yǎng)基上，菌落叢生、產(chǎn)生白色絲狀菌絲體、菌絲發(fā)達(dá)，液體振蕩培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生球狀菌絲體，初菌絲體為白色，后漸變?yōu)楹稚?br> 個(gè)體形態(tài)菌絲體具有規(guī)則的分隔，隔膜有簡(jiǎn)單隔孔，有伏魯寧體，細(xì)胞壁雙層，內(nèi)層厚而透明，外層薄而密集，子囊孢子線形。
理化特征對(duì)雙糖的利用效果比單糖要好，可以利用淀粉作為碳源。不能固定氮素，對(duì)無(wú)機(jī)氮源的利用效果較差。生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生一種抗生素—抗真菌素(ophiocordin)。
該菌株的培養(yǎng)特征及形態(tài)特征見(jiàn)表1。

表1(2)18S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析測(cè)定大團(tuán)囊蟲(chóng)草真菌(CGMCC No.1146)18S rDNA部分的序列表2為本發(fā)明所述的依據(jù)蟲(chóng)草真菌序列從GeneBank中調(diào)出的部分相關(guān)菌株的18S rDNA序列的登錄號(hào)。

表2結(jié)合上述形態(tài)特征及18S rDNA序列分析，可以確定該菌為子囊菌綱、球殼菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬真菌，從而確定分離得到的菌株確為大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌。大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌18S rDNA部分的序列SEQ ID No.1表<110>浙江大學(xué)<120>一種蟲(chóng)草真菌及其分離方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1519<212>DNA<213>Cordyceps sp.
<400>1aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa gcaattatac agcgaaactg cgaatggctc 60
attatataag ttatcgttta tttgatagta ccttactact tggataaccg tggtaattct120agagctaata catgctaaaa atcccgactt cggaagggat gtatttatta gattaaaaac180caatgccctc tgggctctct ggtgattcat gataacttct cgaatcgcat ggccttgcgc240cggcgatggt tcattcaaat ttcttcccta tcaactttcg atgtttgggt agtggccaaa300catggttgca acgggtaacg gagggttagg gctcgacccc ggagaaggag cctgagaaac360ggctactaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg420tagtgacaat aaatactgat acagggctct tttgggtctt gtaattggaa tgagtacaat480ttaaatccct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt540ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt gtggttaaaa agctcgtagt tgaaccttgg600gcctggctgg ccggtccgcc tcaccgcgtg tactggtccg gccgggcctt tccctctgtg660gaaccccatg cccttcactg ggtgtggcgg ggaaacagga cttttacttt gaaaaaatta720gagtgctcca ggcaggccta tgctcgaata cattagcatg gaataatgaa ataggacgtg780cggttctatt ttgttggttt ctaggaccgc cgtaatgatt aatagggaca gtcgggggca840tcagtattca attgtcagag gtgaaattct tggatttatt gaagactaac tactgcgaaa900gcatttgcca aggatgtttt cattaatcag gaacgaaagt taggggatcg aagacgatca960gataccgtcg tagtcttaac cataaactat gccgactagg gatcggacga tgttattttt 1020
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權(quán)利要求
1.一種蟲(chóng)草真菌，其特征在于，它是從大團(tuán)囊蟲(chóng)草(Cordycepsophioglossoides)子實(shí)體上分離純化得到的該真菌的純菌株，其18S rDNA具有SEQ ID No.1的序列。保存在中國(guó)專(zhuān)利局指定的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存編號(hào)為CGMCC No.1146。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用蟲(chóng)草真菌，其特征在于，所述大團(tuán)囊蟲(chóng)草子實(shí)體的形態(tài)為大團(tuán)囊蟲(chóng)草寄生在地下生長(zhǎng)的大團(tuán)囊菌(Elaphomycesgranulatus Fr)的子實(shí)體上，子囊果球形，直徑為1～4.5厘米，褐色，堅(jiān)硬；子座根狀生于基物外，直立，頭狀，有長(zhǎng)柄多分枝，高矮不等，一般2～15厘米，棍棒狀，褐色；子囊柄不易水解，子囊孢子線形。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用蟲(chóng)草真菌，其特征在于所述蟲(chóng)草真菌的形態(tài)和生理特征及培養(yǎng)條件為1)分離得到的菌株在固體平板上的形態(tài)特征為菌落叢生、白色絲狀菌絲體；液體培養(yǎng)時(shí)菌液變混，產(chǎn)生球狀菌絲體，初菌絲體為白色，后漸變?yōu)楹稚?)生理特征為好氧菌，對(duì)雙糖作為碳源的效果比單糖好，不能固定氮素，對(duì)無(wú)機(jī)氮源利用較差，次生代謝過(guò)程中產(chǎn)生抗菌素ophiocordin。3)培養(yǎng)條件為生長(zhǎng)溫度為0～40℃，最適生長(zhǎng)溫度20～30℃，在pH4～8的環(huán)境下都能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)的pH為4.2～6.5。
4.一種分離權(quán)利要求1所述的藥用蟲(chóng)草真菌的方法，其特征在于，分為以下步驟1)選擇大團(tuán)囊蟲(chóng)草子實(shí)體選子囊果大、柄短、八九分成熟的大團(tuán)囊蟲(chóng)草子實(shí)體，切去蓋兩基部。2)消毒滅菌在無(wú)菌箱內(nèi)以濃度為0.1％的升汞水浸泡，再用濃度為75％酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄，進(jìn)行表面消毒。3)接種接種時(shí)，將子實(shí)體切開(kāi)，在其萌蓋和菌柄交界處，挑取一小塊組織；移接到馬鈴薯蔗糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基PSA上。4)培養(yǎng)在20℃～30℃溫度下培養(yǎng)7～10天，待組織上產(chǎn)生白色絨毛狀菌絲，轉(zhuǎn)管擴(kuò)大即得到大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蟲(chóng)草真菌及其分離方法。本發(fā)明從野生大團(tuán)囊蟲(chóng)草子實(shí)體上分離并篩選出單一囊菌。本發(fā)明分離該蟲(chóng)草真菌的方法分為選擇大團(tuán)囊蟲(chóng)草子實(shí)體、消毒滅菌、接種和培養(yǎng)等步驟。
文檔編號(hào)C12N1/12GK1594541SQ20041002577
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月30日
發(fā)明者李永泉, 鄭靜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)