專利名稱：一種提取超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取超氧化物歧化酶的方法，尤其涉及一種從野木瓜果實(shí)中提取超氧化物歧化酶的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于生物體中，催化氧自由基的歧化反應(yīng)，從而清除對生物體有強(qiáng)烈毒性的超氧化物自由基，對生物體起保護(hù)作用。因此SOD具有抗炎癥、抗衰老、抗輻射損傷及抗腫瘤作用，并已應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域。
目前商品SOD主要來自于動(dòng)物血液，也有研究對不少植物(如蔬菜、中草藥等)進(jìn)行了SOD提取的實(shí)驗(yàn)。中國專利申請93103820.0是關(guān)于煙草超氧化物歧化酶(SOD)的提取方法利用磷酸鉀緩沖液作抽提液，用醋酸調(diào)節(jié)pH至4.0除去堿性蛋白，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5除去酸性蛋白，利用硫酸銨鹽析提取SOD，得到粗酶制劑。到目前為止，提取SOD的主要工藝包括鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析、超濾等。
由于野木瓜果實(shí)的pH值在3以下，難以用緩沖液調(diào)節(jié)pH，使用現(xiàn)有工藝和工藝條件，很難從野木瓜果實(shí)中提取SOD。迄今為止尚未見到有從野木瓜果實(shí)中提取SOD的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從野木瓜果實(shí)中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法，應(yīng)用這種方法，可有效地從野木瓜果實(shí)中提取SOD粗制品，提高SOD粗制品的得率。這是其它SOD提取方法所不能達(dá)到的。
本發(fā)明所述的從野木瓜果實(shí)中提取超氧化物歧化酶(SOD)粗制品的方法是通過如下步驟實(shí)現(xiàn)的a.野木瓜果實(shí)中加入1～3倍野木瓜重量的水，以及堿性無機(jī)鹽，堿性無機(jī)鹽的加入量為野木瓜重量的3～9％，破碎野木瓜果實(shí)，粗提液pH為3～6；b.將上述的粗提液過濾，濾液離心；c.取上清液，并加入1～4倍上清液體積的丙酮溶液；d.離心，取沉淀，干燥。
本發(fā)明步驟a中，堿性無機(jī)鹽優(yōu)選為PO43-鹽、HPO42-鹽、H2PO4-鹽、CO32-鹽或HCO3-鹽，例如Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、Na2CO3、NaHCO3等。粗提液pH優(yōu)選為3～5。
本發(fā)明涉及的植物原料為野木瓜果實(shí)，是薔薇科植物貼梗海棠(皺皮木瓜、宣木瓜)Chaenomeles lagenaria的成熟果實(shí)，果實(shí)很酸，pH為2.7左右。
按照本發(fā)明所述的從野木瓜果實(shí)中提取超氧化物歧化酶(SOD)粗制品的方法，在破碎野木瓜的同時(shí)加入堿性無機(jī)鹽，調(diào)節(jié)pH至弱酸性；堿性無機(jī)鹽的加入量為野木瓜重量的3～9％，調(diào)節(jié)粗提液pH至3～6；野木瓜很酸，野木瓜鮮果的pH為2.7左右，破碎野木瓜，加入1～3倍野木瓜重量的水，其粗提液的pH為3.0左右，在pH為3.0左右的SOD粗提液中，SOD的活性很低；按照常規(guī)方法，用磷酸緩沖液等緩沖體系粗提SOD，緩沖體系會(huì)被野木瓜中的酸性物質(zhì)破壞，而致使提取液的pH接近3.0，達(dá)不到緩沖效果；只有加入大量的堿性無機(jī)鹽，才能保證提取液的pH接近弱酸性，從而保證在提取液中能檢測到較高的SOD活性。
按照本發(fā)明所述的從野木瓜果實(shí)中提取SOD的方法，加入丙酮的體積為上清液體積的1～4倍；在動(dòng)物血液中提取SOD，一般會(huì)使用丙酮等有機(jī)溶劑，用于去除脂溶性物質(zhì)；在植物SOD提取中，用硫酸銨鹽析法，尚沒有使用丙酮法；在野木瓜SOD提取中，硫酸銨鹽析法不起作用，硫酸銨鹽析提取液中難以檢測到SOD酶活性，但是用上清液1～4倍體積的丙酮提取，能在提取液中檢測到高活性的SOD。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.現(xiàn)有技術(shù)無法從野木瓜果實(shí)中提取到SOD，而用本發(fā)明的技術(shù)能有效地提取野木瓜中的SOD。
2.本發(fā)明工藝簡單，操作方便，成本低，適宜大規(guī)模生產(chǎn)。
3.本發(fā)明制得的SOD粗制品具有很高的得率，一般均可達(dá)到14U/g鮮組織。
具體實(shí)施例方式
通過下面給出的實(shí)施例可以進(jìn)一步清楚了解本發(fā)明，但它們并非是對本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1野木瓜SOD粗制品的提取野木瓜100kg，初步破碎，加入150kg蒸餾水，加入6kg Na2HPO4，破碎，粗提液pH為4.8；120目紗網(wǎng)過濾，濾液7000rpm 4℃下離心15min，得上清液220L；加入丙酮440L，混勻；7000rpm 4℃下離心15min，取沉淀，晾干，即為SOD粗制品。利用連苯三酚自氧化法測定粗制品中SOD活性，得率為15.3U/g鮮組織。該提取液在280nm處有吸收峰；在320nm至540nm處也有吸收峰，整個(gè)吸收峰較平緩，最大吸收峰在340nm處。光譜測定結(jié)果表明所提取的酶是Fe-SOD酶。
利用連苯三酚自氧化法測定粗制品中SOD活性，得率為15.3U/g鮮組織。
實(shí)施例2野木瓜SOD粗制品的提取野木瓜100kg，初步破碎，加入100kg蒸餾水，加入3kg NaHCO3，破碎，粗提液pH為3.4；120目紗網(wǎng)過濾，濾液7000rpm 4℃下離心15min，得上清液170L；加入丙酮170L，混勻；7000rpm 4℃下離心15min，取沉淀，晾干，即為SOD粗制品。利用連苯三酚自氧化法測定粗制品中SOD活性，得率為13.7U/g鮮組織。
實(shí)施例3野木瓜SOD粗制品的提取野木瓜100kg，初步破碎，加入150kg蒸餾水，加入9kg Na2HPO4，破碎，粗提液pH為5.8；120目紗網(wǎng)過濾，濾液7000rpm 4℃下離心15min，得上清液220L；加入丙酮880L，混勻；7000rpm 4℃下離心15min，取沉淀，晾干，即為SOD粗制品。利用連苯三酚自氧化法測定粗制品中SOD活性，得率為15.1U/g鮮組織。
實(shí)施例4野木瓜SOD粗制品的提取野木瓜100kg，初步破碎，加入300kg蒸餾水，加入9kg K2HPO4，破碎，粗提液pH為6.0；120目紗網(wǎng)過濾，濾液7000rpm 4℃下離心15min，得上清液370L；加入丙酮800L，混勻；7000rpm 4℃下離心15min，取沉淀，晾干，即為SOD粗制品。利用連苯三酚自氧化法測定粗制品中SOD活性，得率為14.2U/g鮮組織。
利用連苯三酚自氧化法測定現(xiàn)有技術(shù)(以申請?zhí)枮?3103820.0的技術(shù)為例)和本專利技術(shù)在各步驟中提取的SOD活性，結(jié)果表明用現(xiàn)有技術(shù)最后無法從野木瓜果實(shí)中提取到SOD，而用本專利技術(shù)能有效地提取野木瓜SOD。
表1.現(xiàn)有技術(shù)和本專利技術(shù)提取的野木瓜SOD得率(U/g鮮組織)

權(quán)利要求
1.一種從野木瓜果實(shí)中提取SOD粗制品的方法，該方法是通過如下步驟實(shí)現(xiàn)的a.野木瓜果實(shí)中加入1～3倍野木瓜重量的水，以及堿性無機(jī)鹽，堿性無機(jī)鹽的加入量為野木瓜重量的3～9％，破碎野木瓜果實(shí)，粗提液pH為3～6；b.將上述的粗提液過濾，濾液離心；c.取b中離心后的上清液，并加入1～4倍上清液體積的丙酮；d.將步驟c得到的溶液離心，取沉淀，干燥后獲得SOD粗制品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于加入的堿性無機(jī)鹽選自PO43-鹽、HPO42-鹽、H2PO4-鹽、CO32-鹽和HCO31-鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于加入的堿性無機(jī)鹽選自Na3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、Na2CO3和NaHCO3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于調(diào)整粗提液的pH至3～5。
全文摘要
一種從野木瓜果實(shí)中提取超氧化物歧化酶(以下簡稱SOD)粗制品的方法，所述的提取方法是破碎野木瓜的同時(shí)，加入堿性無機(jī)鹽，調(diào)節(jié)pH至弱酸性；過濾，離心；在上清液中，加入丙酮，離心后得沉淀；晾干。本發(fā)明適宜于從野木瓜果實(shí)中有效地提取SOD粗制品，提高SOD粗制品的得率。應(yīng)用該方法提取的野木瓜果實(shí)SOD，在醫(yī)藥、食品中具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/02GK1673364SQ20041003136
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月25日
發(fā)明者張洪基 申請人:張洪基