專利名稱：一種生產(chǎn)丙酮酸的方法及其專用工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種生產(chǎn)丙酮酸的方法及其專用工程菌。
背景技術(shù)：
丙酮酸是生物體糖代謝的重要中間代謝物，也是具有重要應(yīng)用價值的一種有機酸，在化工、制藥、食品、農(nóng)用化學(xué)品等工業(yè)及科學(xué)研究中有著廣泛的用途，并具有保健生理功能(Pyruvic acid’s health function.Soft Drinks International，1998(5)24.)。丙酮酸可通過微生物發(fā)酵葡萄糖得到(Wang Q，He P，Lu D，ShenA，Jiang NLet. Appl.Microbiol.，2002，35338-342；Qiang Hua，Chen Yang，kazuyuki ShimizuJ.Biosci.Bioeng.1999，87(2)206-213；A.Yokota，H.Shimizu，Y.Terasawa et alAppl.Microbiol.Biotech..1994，41638-643；Mitsuaki MoriguchiAgric.Biol.Chem..1982，46(4)955-961；M.Moriguchi，K.Shuto，T.HashimotoJ.Ferment.Technol..1984，62(3)243-248；S.Takao，M.TanidaJ.Ferment.Technol..1982，60(4)277-280；CarstenSchinschel，Helmut SimonJ.Biotech..1993，31191-203)。目前國外發(fā)酵水平最高的菌種是光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)IF00005(大阪發(fā)酵研究所Institute for Fermentation，Osaka)，用該菌種補料流加發(fā)酵63小時產(chǎn)酸水平達到67.8g/L，生產(chǎn)強度1.08g/L.h(Reiko Miyata，Tetsu YoneharaJ.Ferment.Bioeng..1996，82(5)475-479)。我國也用光滑球擬酵母發(fā)酵得到了類似的結(jié)果(Li Y，Chen J，Lun SY，Rui XYAppl.Microbiol.Biotechnol.，2001，55680-685)。
丙酮酸作為生物體糖代謝的中間代謝物，它經(jīng)丙酮酸脫羧酶催化生成乙醛，再還原得到乙醇。副產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生降低了丙酮酸的產(chǎn)量。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株丙酮酸生產(chǎn)工程菌。
本發(fā)明所提供的丙酮酸生產(chǎn)工程菌是光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號，已于2003年01月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №0879。
光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號CGMCC №0879是以光滑球擬酵母IF00005為出發(fā)菌株，通過基因敲除技術(shù)(gene knockout)敲除其丙酮酸脫羧酶基因得到的。該菌形態(tài)為球狀，菌落灰白、圓形、邊緣光滑、突出，能發(fā)酵葡萄糖。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)丙酮酸的方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)丙酮酸的方法，是發(fā)酵光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)3672號CGMCC №0879得到丙酮酸。
利用光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號CGMCC №0879生產(chǎn)丙酮酸的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源和無機鹽。所述碳源可為質(zhì)量百分含量為5％-40％的蔗糖和/或葡萄糖和/或糖蜜和/或淀粉；所述氮源可為質(zhì)量百分含量為0.2％-7％的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆餅粉和/或銨鹽和/或尿素；所述無機鹽包括質(zhì)量百分含量為0.05％-0.5％的KH2PO4，0.01％-0.1％的MgSO4，1％-10％的CaCO3。為了提高丙酮酸的產(chǎn)量，所述培養(yǎng)基中還含有維生素；所述維生素可為質(zhì)量百分含量為0.000001％-0.01％的維生素B1和/或維生素B2和/或維生素B6和/或維生素B12和/或葉酸和/或煙酸和/或生物素。
培養(yǎng)條件通常為培養(yǎng)溫度24-37℃，pH 4.5-6，培養(yǎng)時間24-148小時。通過分離、精制等常規(guī)方法，從上述的培養(yǎng)液中收集丙酮酸。
本發(fā)明的光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata) 3672號CGMCC №0879的丙酮酸脫羧酶基因被敲除，發(fā)酵時減少了副產(chǎn)物乙醇的生成，從而使丙酮酸的產(chǎn)量提高。實驗證明，光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號CGMCC №0879發(fā)酵液中的丙酮酸脫羧酶酶活性遠低于其出發(fā)菌株光滑球擬酵母IF00005(丙酮酸脫羧酶活性降低了70％)，乙醇含量也遠低于光滑球擬酵母IF00005發(fā)酵液，該菌株在24℃-37℃發(fā)酵24小時-148小時，得到的發(fā)酵液中的丙酮酸含量最高可達81g/L，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
具體實施例方式
實施例1、光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號CGMCC №0879的獲得光滑球擬酵母IF00005接種于1％酵母提取物，2％蛋白胨，10％葡萄糖pH5.5的培養(yǎng)基中，在250ml三角瓶中于30℃、220轉(zhuǎn)/分的搖床培養(yǎng)6小時后，細胞濃度達到2×107/ml，離心收獲細胞，用20mM Tris-EDTA緩沖液洗2次，重新懸浮在0.3M乙酸鋰溶液中，于4℃保持8小時后，加入在丙酮酸脫羧酶基因內(nèi)插入URA3基因的重組DNA和聚乙二醇(PEG)4000，于室溫下保持1小時后，在42℃保持5分鐘，細胞用水洗滌后在不加尿嘧啶的瓊脂培養(yǎng)基平板上于30℃培養(yǎng)1～2天后，生長出的菌落即是工程菌，工程菌用偶聯(lián)酶法(Ulrich，J.Meth.Enzymol.18，109-115)測定丙酮酸脫羧酶活性進行鑒定，得到光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata) 3672號。
實施例2、丙酮酸脫羧酶的活性比較光滑球擬酵母3672號和光滑球擬酵母IF00005分別接種于具有下述質(zhì)量百分比成分的培養(yǎng)基中1％酵母提取物，2％蛋白胨，10％葡萄糖pH5.5，在250ml三角瓶中于30℃、220轉(zhuǎn)/分的搖床培養(yǎng)16小時后，分別離心收獲細胞，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)洗2次，重新懸浮在該緩沖液中，加入玻璃珠，在4℃下劇烈振蕩10分鐘，15,000×g離心30分鐘，分別按常規(guī)方法測定上清液的丙酮酸脫羧酶酶活。結(jié)果表明光滑球擬酵母3672號的丙酮酸脫羧酶酶活為0.49U/ml，光滑球擬酵母IF0005的丙酮酸脫羧酶酶活為1.72U/ml。
實施例3、丙酮酸與副產(chǎn)物乙醇的比較光滑球擬酵母3672號和光滑球擬酵母IF0005分別接種于具有下述質(zhì)量百分比成分的培養(yǎng)基中10％葡萄糖，3％魚蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO1.7H2O，和4％CaCO3，pH5.5，在250ml三角瓶中于30℃、220轉(zhuǎn)/分的搖床培養(yǎng)24小時。然后以10％的接種量分別轉(zhuǎn)接到具有下述質(zhì)量百分比成分的培養(yǎng)基中10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨，0.6％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O和4％CaCO3，pH5.5，在250ml三角瓶中于30℃、220轉(zhuǎn)/分的搖床培養(yǎng)32小時，分別按常規(guī)方法測定兩菌株發(fā)酵液的丙酮酸和乙醇含量。結(jié)果表明光滑球擬酵母3672號發(fā)酵液的丙酮酸含量為20.2g/L，乙醇含量為4.6g/L；光滑球擬酵母IF0005發(fā)酵液的丙酮酸含量為7.3g/L，乙醇含量為7.4g/L。
實施例4、搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸光滑球擬酵母3672號接種于裝有30ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5，含有下述質(zhì)量百分比的組分葡萄糖40％，蛋白胨7％，維生素B1 0.000001％，維生素B2 0.002％，維生素B12 0.0001％，葉酸0.0001％，KH2PO40.5％，MgSO40.1％，CaCO35％。在30℃，220rpm發(fā)酵7天后，離心分離菌體，按常規(guī)方法測得上清液中含有丙酮酸60g/L。
實施例5、搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸光滑球擬酵母3672號接種于裝有25ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為4.8，含有下述質(zhì)量百分比的組分糖蜜8％，牛肉膏5％，KH2PO10.1％，MgSO40.02％，CaCO31％。在24℃，220rpm發(fā)酵1天后，取2.5ml發(fā)酵液接種于裝有22.5ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5.2，含有下述質(zhì)量百分比的組分淀粉水解糖15％，蛋白胨2％，大豆水解液2％，維生素B2 0.001％，維生素B12 0.001％，葉酸0.0001％，生物素0.002％，KH2PO40.15％，MgSO40.07％，CaCO35％。在28℃，220rpm發(fā)酵3天后，離心分離菌體，按常規(guī)方法測得上清液中含有丙酮酸53g/L。
實施例6、搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸光滑球擬酵母3672號接種于裝有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5.4，含有下述質(zhì)量百分比的組分葡萄糖8％，玉米漿2％，維生素B1 0.00001％，維生素B2 0.002％，維生素B12 0.0001％，葉酸0.0001％，煙酸0.0001％，生物素0.0001％，KH2PO40.05％，MgSO40.01％，CaCO31％。在34℃，220rpm發(fā)酵1天后，離心分離菌體，按常規(guī)方法測得上清液中含有含丙酮酸44g/L。
實施例7、發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸光滑球擬酵母3672號接種于裝有25ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為6，含有下述質(zhì)量百分比的組分蔗糖5％，NH4Cl 1％，尿素1％，KH2PO40.1％，MgSO40.02％，CaCO31％。在37℃，220rpm發(fā)酵8小時后，取20ml發(fā)酵液接種于裝有300ml發(fā)酵培養(yǎng)基的2000ml搖瓶中，該培養(yǎng)基的pH為5.8，含有下述質(zhì)量百分比的組分葡萄糖10％，酵母提取物1％，KH2PO40.1％，MgSO40.05％，CaCO32％。在28℃，220rpm發(fā)酵12小時后，取300ml發(fā)酵液接種于裝有3000ml發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐(NBS Bioflo III)中，該培養(yǎng)基的pH為5.5，含有下述質(zhì)量百分比的組分葡萄糖20％，蛋白胨3％，維生素B1 0.00001％，維生素B2 0.00001％，維生素B60.00001％，維生素B12 0.000001％，葉酸0.000001％，煙酸0.0004％，生物素0.00001％，KH2PO40.1％，MgSO40.05％。在30℃，通氣量為1∶1的條件下發(fā)酵60小時后，離心分離菌體，按常規(guī)方法測得上清液中含有丙酮酸81g/L。
權(quán)利要求
1.光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號CGMCC №0879。
2.一種丙酮酸的生產(chǎn)方法，是用光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號CGMCC №0879發(fā)酵得到丙酮酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于發(fā)酵所用的培養(yǎng)基包括碳源、氮源和無機鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基還包括維生素。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述碳源為質(zhì)量百分含量為5％-40％的蔗糖和/或葡萄糖和/或糖蜜和/或淀粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述氮源為質(zhì)量百分含量為0.2％-7％的玉米漿和/或牛肉膏和/或酵母提取物和/或蛋白胨和/或豆餅粉和/或銨鹽和/或尿素。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述無機鹽包括質(zhì)量百分含量為0.05％-0.5％的KH2PO4，0.01％-0.1％的MgSO4，1％-10％的CaCO3。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述維生素為質(zhì)量百分含量為0.000001％-0.01％的維生素B1和/或維生素B2和/或維生素B6和/或維生素B12和/或葉酸和/或煙酸和/或生物素。
9.根據(jù)權(quán)利要求3、4、5、6、7或8所述的方法，其特征在于發(fā)酵溫度為24℃-37℃；pH為4.5-6。
10.根據(jù)權(quán)利要求3、4、5、6、7或8所述的方法，其特征在于發(fā)酵時間為24小時-148小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)丙酮酸的方法及其專用工程菌。本發(fā)明用于生產(chǎn)丙酮酸的工程菌是光滑球擬酵母(Torulopsis，glabrata)3672號CGMCC №0879。光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號CGMCC №0879的丙酮酸脫羧酶基因被敲除，發(fā)酵時減少了副產(chǎn)物乙醇的生成，從而使丙酮酸的產(chǎn)量提高。實驗證明，光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)3672號CGMCC №0879發(fā)酵液中的丙酮酸脫羧酶酶活性遠低于其出發(fā)菌株光滑球擬酵母IF00005(丙酮酸脫羧酶活性降低了70％)，乙醇含量也遠低于光滑球擬酵母IF00005發(fā)酵液，該菌株在24℃－37℃發(fā)酵24小時－148小時，得到的發(fā)酵液中的丙酮酸含量最高可達81g/l，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/16GK1690188SQ20041003384
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者江寧, 沈安, 王欽宏, 賀鵬, 王淑豪, 盧大軍 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所