專(zhuān)利名稱(chēng)：腸球菌屬乳酸菌以及乳酸菌死菌體的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸球菌屬乳酸菌的培養(yǎng)方法、以及腸球菌屬乳酸菌死菌體的制造方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著日本人個(gè)人對(duì)動(dòng)物性脂肪的攝入量增大，以及飲食生活方式歐美化的演變，患高血脂癥以及與此相關(guān)的動(dòng)脈硬化癥等生活習(xí)慣病、成人病的患者不斷增加。
為此，現(xiàn)在已有多種用于治療高血脂癥的藥物供應(yīng)。但是，用于抑制此種疾病的藥物中，無(wú)論哪一種在服用后均有出現(xiàn)胃部不適、嘔吐、肝臟機(jī)能異常、急性腎臟不良、四肢無(wú)力等副作用的報(bào)道，并且對(duì)正在施用其他藥物的患者還存在必須限制服用上述藥物的情況。
根據(jù)新的抗動(dòng)脈硬化劑的研究結(jié)果，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)乳酸菌，特別是腸球菌屬的各種微生物的活菌體及死菌體可顯著地降低血液中的膽固醇和甘油三酯的數(shù)值，并且由于所述的微生物來(lái)源是存在于人體內(nèi)的腸道內(nèi)細(xì)菌，所以服用本發(fā)明的藥劑不但無(wú)毒，而且沒(méi)有目前治療動(dòng)脈硬化和高血脂癥的藥物(例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)1)所引起的副作用。
另外，這些微生物具有各種各樣的生理活性，不僅上述微生物的活菌體，而且經(jīng)特定條件處理所得的上述微生物的死菌體也具有作為其生理活性例子的、可使血液中膽固醇和甘油三酯的數(shù)值降低的活性。日本特許公報(bào)第2756778號(hào)但是，即使具有這樣的顯著降低膽固醇值和甘油三酯值的活性的腸球菌屬乳酸菌(乳酸球菌)，也能判斷出通過(guò)現(xiàn)有的培養(yǎng)方法會(huì)降低所述乳酸菌的活性，從而不能得到所期待的效果。另外，腸球菌屬乳酸菌死菌體與所述活菌體一樣，也能顯著降低膽固醇值和甘油三酯值，但是能判斷出通過(guò)現(xiàn)有的從所述活菌體得到死菌體的處理方法，將會(huì)喪失所期待的效果。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供不喪失腸球菌屬乳酸菌具有的降低血液中膽固醇值和甘油三酯值的活性的培養(yǎng)方法、以及腸球菌屬乳酸菌死菌體的制造方法。
為此，本發(fā)明提供腸球菌屬乳酸菌的培養(yǎng)方法，包括將腸球菌屬的乳酸菌在下述培養(yǎng)條件下進(jìn)行需氧培養(yǎng)，再?gòu)呐囵B(yǎng)物中收集活菌體制成具有降低膽固醇和甘油三酯活性的腸球菌屬乳酸菌，所述培養(yǎng)條件為(i)pH5.5-7.5、(ii)攪拌方法平均每分鐘5-40次、(iii)溫度條件30-40℃、(iv)培養(yǎng)時(shí)間6-24小時(shí)。
此處，上述的培養(yǎng)基成分含有(i)葡萄糖1-4％、(ii)酵母提取物0.3-6％、(iii)蛋白胨0.1-5％，和(iv)磷酸氫二鉀1-5％。
另外，上述屬于腸球菌屬的乳酸菌是選自由腸球菌屬的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、牛腸球菌(Enterococcus bovis)、鳥(niǎo)腸球菌(Enterococcus avium)、耐久腸球菌(Enterococcus durans)、唾液腸球菌(Enterococcus salivarius)、緩癥腸球菌(Enterococcus mitis)、和馬腸球菌(Enterococcus equinus)所組成的組中的一種或一種以上的活菌體。
本發(fā)明還提供腸球菌屬乳酸菌死菌體的制造方法，該方法包括(1)將腸球菌屬乳酸菌在(i)pH5.5-7.5、(ii)攪拌方法平均每分鐘5-40次、(iii)溫度條件30-40℃、(iv)培養(yǎng)時(shí)間6-24小時(shí)的培養(yǎng)條件下需氧培養(yǎng)，(2)將含有上述活菌體的菌液用生理鹽水洗凈、(3)將用生理鹽水懸浮所得的菌液在(i)溫度為80-125℃、(ii)壓力為5-25磅環(huán)境下，(iii)放置時(shí)間5-25分鐘的條件下放置，得到具有降低膽固醇和甘油三酯活性的腸球菌屬乳酸菌死菌體。
此處，上述(1)所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分含有(i)葡萄糖1-4％、(ii)酵母提取物0.3-6％、(iii)蛋白胨0.1-5％，和(iv)磷酸氫二鉀1-5％。
具體實(shí)施方式以下就本發(fā)明的腸球菌屬乳酸菌的培養(yǎng)方法、以及腸球菌屬乳酸菌死菌體的制造方法中所使用的微生物的種類(lèi)、所述微生物的培養(yǎng)方法、已培養(yǎng)的微生物的死菌體的制備方法以及由此得到的乳酸菌和乳酸菌死菌體的藥理作用等進(jìn)行詳細(xì)描述。
1.微生物用于本發(fā)明的微生物可以是腸球菌屬乳酸菌，特別是其中的，例如，由糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、牛腸球菌(Enterococcus bovis)、鳥(niǎo)腸球菌(Enterococcus avium)、耐久腸球菌(Enterococcus durans)、唾液腸球菌(Enterococcus salivarius)、緩癥腸球菌(Enterococcus mitis)，馬腸球菌(Enterococcus equinus)所組成的組中的一種或一種以上的活菌體。所述腸球菌屬乳酸菌可通過(guò)，例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的保藏號(hào)為[ATCC 700802]的微生物保藏得到。
2.活菌體的制備條件上述活菌體的培養(yǎng)條件如下所示(i)培養(yǎng)基成分的氫離子濃度指數(shù)(pH)pH為5.5-7.5的范圍內(nèi)。
(ii)攪拌方法平均每分鐘5-40次緩緩攪拌。
(iii)培養(yǎng)時(shí)間6-24小時(shí)的范圍內(nèi)。
(iv)培養(yǎng)基組成含有1-4％葡萄糖、0.3-6％酵母提取物、0.1-5％蛋白胨、1-5％磷酸氫二鉀。
(v)溫度30-45℃的溫度環(huán)境下。
(vi)需氧性培養(yǎng)，但無(wú)需特意添加氧。
3.死菌體的制備條件將在上述2中所述的條件下培養(yǎng)所得的活菌體培養(yǎng)物進(jìn)一步用生理鹽水洗凈1到2次后，將用生理鹽水懸浮得到的菌液進(jìn)行下述條件的加熱/加壓處理(i)溫度80-125℃(ii)壓力5-25磅(iii)時(shí)間5-25分鐘經(jīng)上述加熱/高壓處理可得到具有上述微生物活性的死菌體。
4.藥理作用如下述各實(shí)驗(yàn)例所示，本發(fā)明的死菌體制備方法、乳酸菌特別是腸球菌屬微生物對(duì)降低血液中膽固醇和甘油三酯值非常有效。
(1)實(shí)驗(yàn)例1將上述1中所示的腸球菌屬的各種微生物的活菌體，以及經(jīng)加熱、加壓處理后所得的菌體施用于小鼠(雄性18周齡、平均體重20g每組10只)，在4周的時(shí)間內(nèi)經(jīng)口連續(xù)施用，給藥量為活菌體1010個(gè)/天、死菌體1010個(gè)/天，測(cè)定血液中的膽固醇降低率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
表1活菌體和死菌體對(duì)膽固醇降低率的比較(小鼠)
(2)實(shí)驗(yàn)例2用與上述實(shí)驗(yàn)例1相同的方式，將腸球菌屬的各種微生物的活菌體，以及經(jīng)加熱、加壓處理后所得的菌體施用于普通大鼠(雄性18周齡、平均體重250g每組7只)，在4周的時(shí)間內(nèi)經(jīng)口連續(xù)施用，給藥量為活菌體1010個(gè)/天、死菌體1010個(gè)/天，測(cè)定血液中的膽固醇降低率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。
表2
(*1)日常飲食中添加有膽固醇的大鼠(*2)日常飲食中添加有果糖的大鼠(3)實(shí)驗(yàn)例3比例經(jīng)調(diào)整的上述腸球菌屬的各種微生物的活菌體，以及經(jīng)加熱、加壓處理后所得的死菌體施用于普通小鼠(雄性18周齡、平均體重20g每組10只)，在4周的時(shí)間內(nèi)經(jīng)口連續(xù)施用，給藥量為活菌體1010個(gè)/天、死菌體1010個(gè)/天，測(cè)定血液中的甘油三酯降低率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。
表3
(4)實(shí)驗(yàn)例4用與上述實(shí)驗(yàn)例3相同的方式將比例經(jīng)調(diào)整的腸球菌屬的各種微生物的活菌體，以及經(jīng)加熱、加壓處理后所得的死菌體施用于普通大鼠(雄性18周齡、平均體重250g每組7只)，在4周的時(shí)間內(nèi)經(jīng)口連續(xù)施用，給藥量為活菌體1010個(gè)/天、死菌體1010個(gè)/天，測(cè)定血液中的甘油三酯的降低率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。
表4
(*1)日常飲食中添加有膽固醇的大鼠(*2)添加有果糖的大鼠(5)有關(guān)腸球菌屬微生物的安全性根據(jù)急性毒性試驗(yàn)，將以經(jīng)口途徑可能施用的最大量糞腸球菌K-23經(jīng)加熱、加壓處理后所得的菌體施用于普通大鼠(雄性18周齡、平均體重250g每組7只)(5600mg/kg體重)，未觀(guān)察到任何異?，F(xiàn)象，事實(shí)上經(jīng)口施用是無(wú)毒的，并且腹腔內(nèi)(雄性18周齡小鼠、體重20g每組10只)的施用量可達(dá)802mg/kg體重的高值。與該安全性相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。
表5糞腸球菌K的安全性
如上所述，本發(fā)明的腸球菌屬乳酸菌的培養(yǎng)方法中，是將腸球菌屬乳酸菌在下述培養(yǎng)條件下需氧培養(yǎng)，再?gòu)呐囵B(yǎng)物中收集活菌體(i)pH5.5-7.5、(ii)攪拌方法平均每分鐘5-40次、(iii)溫度條件30-40℃、(iv)培養(yǎng)時(shí)間6-24小時(shí)。
另外，通過(guò)將上述方法培養(yǎng)的活菌體再進(jìn)行培養(yǎng)，即將含有上述活菌體的菌液用生理鹽水洗凈，將用生理鹽水懸浮所得的菌液在下述條件下處理得到所述乳酸菌的死菌體，所述條件是(i)溫度為80-125℃、(ii)壓力為5-25磅環(huán)境下、(iii)放置5-25分鐘。
通過(guò)上述方法，本發(fā)明確立了具有降低血液中膽固醇值和甘油三酯值的活性的乳酸菌的培養(yǎng)方法、以及腸球菌屬乳酸菌死菌體的制造方法。
本發(fā)明可提供保持腸球菌屬乳酸菌的生理活性的培養(yǎng)方法以及腸球菌屬乳酸菌死菌體的制造方法，具有實(shí)用性。
權(quán)利要求
1.一種腸球菌屬乳酸菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，將腸球菌屬乳酸菌在下述培養(yǎng)條件下進(jìn)行需氧培養(yǎng)，再?gòu)呐囵B(yǎng)物中收集活菌體，所述條件為(i)pH5.5-7.5、(ii)攪拌方法平均每分鐘5-40次、(iii)溫度條件30-40℃、(iv)培養(yǎng)時(shí)間6-24小時(shí)。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基成分含有(i)葡萄糖1-4％、(ii)酵母提取物0.3-6％、(iii)蛋白胨0.1-5％，和(iv)磷酸氫二鉀1-5％。
3.如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的腸球菌屬乳酸菌是選自由糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、牛腸球菌(Enterococcus bovis)、鳥(niǎo)腸球菌(Enterococcus avium)、耐久腸球菌(Enterococcus durans)、唾液腸球菌(Enterococcus salivarius)、緩癥腸球菌(Enterococcus mitis)、和馬腸球菌(Enterococcus equinus)所組成的組中的一種或一種以上的活菌體。
4.一種腸球菌屬乳酸菌死菌體的制造方法，其特征在于，該方法包括(1)將所述乳酸菌在下述培養(yǎng)條件下需氧培養(yǎng)(i)pH5.5-7.5、(ii)攪拌方法平均每分鐘5-40次、(iii)溫度條件30-40℃、(iv)培養(yǎng)時(shí)間6-24小時(shí)；(2)將含有上述活菌體的菌液用生理鹽水洗凈；(3)將用生理鹽水懸浮所得的菌液在下述條件下處理得到腸球菌屬乳酸菌死菌體，所述條件是(i)溫度為80-125℃、(ii)壓力為5-25磅環(huán)境下、(iii)放置時(shí)間5-25分鐘。
5.如權(quán)利要求4所述的制造方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基成分含有(i)葡萄糖1-4％、(ii)酵母提取物0.3-6％、(iii)蛋白胨0.1-5％，和(iv)磷酸氫二鉀1-5％。
6.如權(quán)利要求4或5所述的制造方法，其特征在于，所述的腸球菌屬乳酸菌是選自由糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、牛腸球菌(Enterococcus bovis)、鳥(niǎo)腸球菌(Enterococcus avium)、耐久腸球菌(Enterococcus durans)、唾液腸球菌(Enterococcus salivarius)、緩癥腸球菌(Enterococcus mitis)、馬腸球菌(Enterococcus equinus)所組成的組中的一種或一種以上的活菌體。
全文摘要
本發(fā)明提供了保持腸球菌屬乳酸菌的生理活性的培養(yǎng)方法以及腸球菌屬乳酸菌死菌體的制造方法。作為腸球菌屬乳酸菌的培養(yǎng)方法可以將腸球菌屬乳酸菌在如下條件下需氧培養(yǎng)且從培養(yǎng)物中收集活菌體(i)pH5.5－7.5、(ii)攪拌方法平均每分鐘5－40次、(iii)溫度條件30－40℃、(iv)培養(yǎng)時(shí)間6－24小時(shí)。
文檔編號(hào)C12N1/06GK1550545SQ20041003477
公開(kāi)日2004年12月1日 申請(qǐng)日期2004年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者河合康雄 申請(qǐng)人:河合康雄