專利名稱：提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用花粉管通道導(dǎo)入基因的技術(shù)是一種借助植物的種質(zhì)細(xì)胞或受精卵為轉(zhuǎn)化對(duì)象的直接轉(zhuǎn)化技術(shù)，該技術(shù)是我國(guó)周光宇先生創(chuàng)立并首先進(jìn)行應(yīng)用的(周光字等，Inheritance of exogenous DNA into cotton embryos，Methods inEnzymology，1983，101433-488)。1978年周光宇充分調(diào)查了國(guó)內(nèi)外植物遠(yuǎn)緣雜交變異后代，發(fā)現(xiàn)植物遠(yuǎn)緣雜交后代可產(chǎn)生的表型變異，但觀察不到其染色體水平的形態(tài)變化，由此推測(cè)表型變異是DNA片段雜交的結(jié)果。根據(jù)植物受精過程的解剖學(xué)特性，認(rèn)為外源DNA可以通過花粉管通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化受精卵或者早期的胚胎細(xì)胞，該技術(shù)開創(chuàng)了整體植物活體轉(zhuǎn)化的新途徑(龔蓁蓁等，授粉后外源DNA導(dǎo)入植物技術(shù)-DNA通過花粉管道進(jìn)入胚囊，中國(guó)科學(xué)(B輯)，1988(6)611-614。)。在早期進(jìn)行的花粉管通道遺傳轉(zhuǎn)化研究中，利用的是含有目標(biāo)性狀的總DNA進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，無法用分子雜交的技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，而導(dǎo)致國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該技術(shù)的可行性產(chǎn)生了質(zhì)疑。直到20世紀(jì)九十年代，隨著基因克隆技術(shù)的完善和發(fā)展，克隆了大量的目的基因，這些目的基因通過花粉管通道技術(shù)導(dǎo)入棉花(謝道昕等，蘇云金芽孢桿菌(Bt)殺蟲晶體蛋白基因?qū)朊藁ǐ@得轉(zhuǎn)基因植株，中國(guó)科學(xué)，1991(4)367-373)、小麥(曾君祉等，花粉管通道(或運(yùn)載)法轉(zhuǎn)化的植株后代遺傳表現(xiàn)及轉(zhuǎn)化機(jī)理的探討，科學(xué)通報(bào)，1998，43(6)561-566)和水稻(Luo Zhongxun，Wu Ray.，A simple method for thetransformation of rice via the pollen-tube pathway，Plant Mol Bio Rep，1988，6(3)165-174)等農(nóng)作物中，利用分子雜交驗(yàn)證了目的基因可以整合到植物的基因組中，從而使利用花粉管通道技術(shù)進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化的可行性得到了證實(shí)?；ǚ酃芡ǖ兰夹g(shù)簡(jiǎn)單易行，成本低，可以克服組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)植株再生等一套復(fù)雜的人工培養(yǎng)過程，避免了植物組織培養(yǎng)過程中對(duì)基因型的依賴和各種難以預(yù)測(cè)的體細(xì)胞變異。因此，花粉管通道技術(shù)在我國(guó)的農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。
棉花的花器官大、花期長(zhǎng)且組織培養(yǎng)受基因型的限制，因此利用花粉管通道技術(shù)進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化的研究開始比較早。目前利用該技術(shù)已將Bt殺蟲毒蛋白基因(郭三堆，崔洪志，中國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉又取得新進(jìn)展，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，31(6)91-94。郭三堆等，雙價(jià)抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花研究，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，32(3)1-7)、蛋白酶抑制劑基因(李燕娥等，豇豆胰蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)基因棉花的獲得，棉花學(xué)報(bào)，1998，10(5)237-243)、幾丁質(zhì)酶基因(王偉等，雙價(jià)抗蟲基因陸地棉轉(zhuǎn)化植株的獲得，植物學(xué)報(bào)，1999，41(4)384-388)和葡萄糖氧化酶基因(鞏萬奎等，葡萄糖氧化酶基因在棉花中的高效轉(zhuǎn)化，棉花學(xué)報(bào)，1999，11(5)241-246.)等導(dǎo)入不同的棉花品種中，并且選育出了生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的棉花品種(劉方等，中國(guó)棉花轉(zhuǎn)基因研究與應(yīng)用，棉花學(xué)報(bào)，2002，14(4)249～253)。但是，由于影響棉花花粉管通道技術(shù)的因素多，導(dǎo)致該技術(shù)的轉(zhuǎn)化率低且不穩(wěn)定(在棉花中它的轉(zhuǎn)化率為1％左右)(王長(zhǎng)海等，利用花粉管通道法將外源質(zhì)粒DNA注入棉花的改良方法，棉花學(xué)報(bào)，1999，11(4)220～221)。提高棉花花粉管通道技術(shù)的轉(zhuǎn)化率是棉花遺傳轉(zhuǎn)化研究急需解決的問題之一。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是采取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討導(dǎo)入緩沖液不同成分、DNA濃度、和導(dǎo)入液的體積對(duì)棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的影響，以篩選出提高棉花花粉管通道技術(shù)轉(zhuǎn)化率的緩沖液配方。
根據(jù)影響棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率主要因素，選取四種因子(因素)TE(Tris-HCl、EDTA-Na2和NaCl)(均為市售化學(xué)試劑)緩沖液的濃度、DNA的濃度、甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，簡(jiǎn)稱EMS，Sigma公司產(chǎn)品)的濃度和導(dǎo)入液體的體積，每個(gè)因素分別選用三個(gè)水平，利用L9(34)的正交表，通過3年的多點(diǎn)、不同基因型棉花品種的試驗(yàn)，獲得了提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的緩沖液配方比，具體配方為TE緩沖液的適宜濃度為10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)，10mmol/L氯化鈉(NaCl)。DNA的適宜濃度為當(dāng)利用外源總DNA時(shí)，DNA的濃度為0.1-0.2μg·μl-1，當(dāng)利用外源質(zhì)粒DNA時(shí)，濃度為0.01-0.02μg·μl-1。EMS的適宜濃度為0.01μg·μl-1-0.05μg·μl-1。導(dǎo)入液體的總體積為10-15·μl。
本配方的關(guān)鍵是加入了適宜濃度的EMS，EMS作為化學(xué)誘變劑，在提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率方面具有2個(gè)作用一是使受體棉花DNA受到損傷，在棉花DNA復(fù)制時(shí)，有利于外源基因的整合；二是EMS具有抑制棉花自身核酸酶的作用，減少外源基因被受體棉花核酸酶的水解，從而保證了有足量的外源基因轉(zhuǎn)化受體棉花。但是，EMS的濃度不能過高，否則對(duì)受體棉花造成危害，也易降低花粉管通道導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)化率。


圖1提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的程序示意圖1是配制10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液2是配制0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)溶液3是配制10mmol/L氯化鈉(NaCl)溶液
4是將10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)和10mmol/L氯化鈉(NaCl)混合形成TE緩沖液，用于稀釋的脫氧核糖核酸(DNA)5是配制甲基磺酸乙酯(EMS)6是配制轉(zhuǎn)化DNA溶液7是將DNA導(dǎo)入棉花花粉管通道具體實(shí)施方式
1、DNA的提取進(jìn)行目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，提取質(zhì)粒DNA，然后在0.8％的瓊脂糖膠上電泳，檢測(cè)質(zhì)粒DNA的純度和濃度，用TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，0.5mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl)稀釋質(zhì)粒DNA到1μg·μl-1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，使用時(shí)分別稀釋至0.01-0.02μg·μl-1。進(jìn)行總DNA的遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，提取植物的總DNA，DNA經(jīng)純化后，TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，0.5mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl)稀釋總DNA到1μg·μl-1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要，使用時(shí)分別稀釋至0.1-0.2μg·μl-1。
2、EMS溶液的配制甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，簡(jiǎn)稱EMS)為Sigma公司產(chǎn)品，用磷酸緩沖液配成1mg·ml-1的母液，過濾滅菌，4℃保存。
3、轉(zhuǎn)化DNA溶液的配制利用花粉管通道導(dǎo)入基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化前，在溶解DNA的TE緩沖液中，加入EMS溶液，使最終EMS濃度為0.01μg·μl-1-0.05μg·μl-1；利用外源質(zhì)粒時(shí)，質(zhì)粒DNA濃度為0.01-0.02μg·μl-1，利用總DNA時(shí)，其濃度0.1-0.2μg·μl-1。
4、待轉(zhuǎn)化棉花的種植在進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，要求稀植，每公頃30,000棵，在肥料、水條件較好的地塊進(jìn)行，有利于提高轉(zhuǎn)化率。
5、花蕾的自交在棉花開花的前一天，選擇快速伸長(zhǎng)、突出花萼、花冠顏色為淡黃色或乳白色的花蕾，將花冠的前端用細(xì)線扎緊，并將細(xì)線的另一端系于鈴柄，作為收獲時(shí)的標(biāo)記。
6、轉(zhuǎn)化操作開花的次日，選擇每個(gè)果枝1-2節(jié)位、成鈴率較高的花朵作為轉(zhuǎn)基因操作的對(duì)象，以醫(yī)用50μl的微量進(jìn)樣器作為轉(zhuǎn)基因注射的工具(使用前后用淡洗滌劑清洗，再用蒸餾水漂洗)。注射時(shí)，摘除或剝?nèi)セü冢ㄆ街^，防止損傷幼子房的表皮層。一只手持微量注射器，另一只手輕扶去除花冠的幼子房，從抹平花柱處沿子房的縱軸方向進(jìn)針至子房長(zhǎng)度的2/3處，并后退至約1/3處。輕輕操作微量注射器，將10μl轉(zhuǎn)基因液推入受精的子房，使每朵花中EMS的量為0.1μg-0.5μg，總DNA的量為1-2μg，質(zhì)粒DNA的量為0.1-0.2μg。
7、轉(zhuǎn)化后處理在注射鈴的鈴柄基部涂抹40μg·l-1的赤霉素溶液，并掛牌進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)摘除注射鈴所在果枝的頂心，以提高成鈴率。收獲時(shí)對(duì)注射鈴要單獨(dú)收、軋和保持，供下一步檢測(cè)。
轉(zhuǎn)基因棉花的檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)基因收獲的種子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，以原品種作為對(duì)照。
(1)進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)化的檢測(cè)根據(jù)構(gòu)建載體上的標(biāo)記基因，首先進(jìn)行標(biāo)記基因的檢測(cè)，然后進(jìn)行目標(biāo)性狀的檢測(cè)，最后，進(jìn)行目的基因和表達(dá)的分子鑒定。
(2)進(jìn)行總DNA轉(zhuǎn)化的檢測(cè)主要根據(jù)轉(zhuǎn)基因棉花與原品種的形態(tài)特征、生理特性的差異進(jìn)行檢測(cè)。
以本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因液，利用花粉管通道技術(shù)導(dǎo)入基因，于2002-2003連續(xù)2年，將含有IPT基因的表達(dá)載體pBG121分別導(dǎo)入不同的陸地棉品種中棉所10號(hào)、中棉所24號(hào)和中棉所36號(hào)中，同時(shí)，以TE緩沖液作為對(duì)照，中棉所10號(hào)、中棉所24號(hào)和中棉所36號(hào)兩年的平均轉(zhuǎn)化率分別為2.4％、3.8％和2.9％，而對(duì)照處理平均轉(zhuǎn)化率分別為0.7％、1.3％和1.2％。
權(quán)利要求
1一種提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于導(dǎo)入基因緩沖液的組成成分為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)，氯化鈉(NaCl)、甲基磺酸乙酯(EMS)和脫氧核糖核酸(DNA)。
2根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于緩沖液Tris-HCl、EDTA-Na2和NaCl三者濃度分別為10、0.5和10mmol/L。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于導(dǎo)入基因時(shí)EMS的濃度為0.01μg·μl-1-0.05μg·μl-1，每朵花的用量為0.1-0.5μg。
4根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于導(dǎo)入外源總DNA時(shí)濃度為0.1-0.2μg·μl-1，導(dǎo)入外源質(zhì)粒DNA時(shí)濃度為0.01-0.02μg·μl-1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。采取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討了不同緩沖液成分對(duì)棉花花粉管通道導(dǎo)入外源總DNA或者質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化率的影響，篩選出了適宜提高棉花花粉管通道導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化率的緩沖液配方，其主要成分是在TE緩沖液中加入0.01μg·μl
文檔編號(hào)C12N15/09GK1624125SQ200410036058
公開日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月4日
發(fā)明者沈法富, 韓秀蘭, 李靜 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)