專利名稱：一株治療金黃色葡萄球菌感染的噬菌體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療細菌感染，特別是如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)感染的噬菌體，及其治療方法和組合物。
背景技術：
細菌的多重抗生素耐藥性已成為細菌感染性疾病的治療難題。尤其是近年來醫(yī)院內和社區(qū)獲得性耐藥菌感染大幅升高(National Nosocomial InfectionsSurveillance(NNIS)report，data summary from October 1986-April 1996，issued May 1996.Am J Infect Control.1996；24380-8.)。其中金黃色葡萄球菌，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)已成為這類感染的主要原因之一。因此需要尋求抗生素之外的替代方法來克服細菌耐藥性。
噬菌體是細菌的病毒，能特異性地感染細菌，多數(shù)噬菌體能烈解宿主菌，或者以其它機制來抑制或破壞特定的菌株。正是利用噬菌體的特異性烈解感染細菌，而不影響患者組織或正常菌群這一特性，噬菌體治療提供了克服抗生素耐藥性細菌感染的治療前景(Smith，H.W.，a.H.，M.B.J.of Gen.Microbiol.，1982，128((Pt 2))p.307-318；Merril，C.R.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93(8)p.3188-3192)。
噬菌體治療的有效性在大腸桿菌(Smith，同上)，傷寒沙門氏菌(Merril，同上)和金黃色葡萄球菌(Shigenobu Matsuzaki，et al，J.of Infec.Dis.2003，187p.613-624)感染的相應動物模型研究中得到證實。
本發(fā)明以新分離出的金黃色葡萄球菌噬菌體，并對臨床分離的金黃色葡萄球菌，包括多重耐藥性菌株進行離體和動物在體模型研究，實現(xiàn)本發(fā)明。

發(fā)明內容
本發(fā)明已經(jīng)研究噬菌體治療抗生素耐藥菌的潛在性。特別是，本發(fā)明已經(jīng)確定能烈解金黃色葡萄球菌，尤其是烈解MRSA的特異性烈性噬菌體。本發(fā)明尤其證明該噬菌體可用于廣譜烈解臨床分離出的多重抗生素耐藥性金黃色葡萄球菌。
本發(fā)明涉及篩選出的金黃色葡萄球菌噬菌體，用作活性治療物質顯著地治療細菌性感染疾病，更適宜治療抗生素耐藥性細菌感染疾病。
本發(fā)明也涉及分離和純化該金黃色葡萄球菌噬菌體。
進而，本發(fā)明提供一種治療細菌感染性疾病的方法，尤其是治療抗生素耐藥性細菌感染的方法，以一種動物組合給藥給予動物需要的篩選出的金黃色葡萄球菌噬菌體。本發(fā)明也提供一種減少細菌毒力，尤其是減少抗生素耐藥性細菌毒力的方法，以一種從屬于組合給藥給予篩選出的有效劑量的金黃色葡萄球菌噬菌體。
本發(fā)明也提供組合給藥方式殺滅或抑制細菌生長。使用該方法的媒介可以是食品，制造食品的物質，動物飼料，醫(yī)學設備，皮膚，外科灌輸，或金屬，塑料，搪瓷器，瓷器，或玻璃表面。該媒介可以是惰性載體，也可以常規(guī)殺菌的方式加以使用。
本發(fā)明也提供一種新的由一種或多種分離并純化的金黃色葡萄球菌噬菌體制備的殺菌劑，用于消毒或殺滅致病性細菌，以保護任何需要，包括但不限于食品，制造食品的物質，食物制備區(qū)域，動物飼料，外科灌輸，金屬，塑料，搪瓷器，瓷器，或玻璃表面，醫(yī)學設備和儀器，皮膚。
本發(fā)明所涉及金黃色葡萄球菌噬菌體，phi006，能融合性烈解臨床分離出的58.70％金黃色葡萄球菌，并能抑制29.35％金黃色葡萄球菌生長，尤其包括MRSA。
本發(fā)明所涉及的陳述，組合物，殺菌劑，和方法對抵抗致病菌有用，尤其是多重耐藥菌。例如，適合抵抗像金黃色葡萄球菌。本陳述和方法對于抵抗對如萬古霉素糖肽敏感性降低的葡萄球菌尤其有用。本發(fā)明中具體的葡萄球菌也是甲氧西林耐藥性的。
在本說明書和具體實施方法中，使用常規(guī)分子生物學和微生物學技術和操作。如Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，(1989)分子克隆實驗室手冊(第2版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)；Parker，M.T.(1972)微生物學方法7B卷(紐約和倫敦學術出版社)中所述。
本發(fā)明方法中所使用的噬菌體是能直接或間接破壞細菌的噬菌體株。相適應的噬菌體可以包括烈性噬菌體，溶源性而后變?yōu)榱倚缘氖删w(即，噬菌體遺傳改造為烈性噬菌體)，和能產(chǎn)生對細菌有害物質的非烈性噬菌體。本發(fā)明中首選烈性噬菌體。
本發(fā)明中陳述和方法中所使用的噬菌體屬于金黃色葡萄球菌噬菌體，特別是本發(fā)明所使用噬菌體，phi006，能烈解大約58.70％的金黃色葡萄球菌，和抑制29.35％的金黃色葡萄球菌。
噬菌體可以籍修飾使該噬菌體能延遲被宿主防御系統(tǒng)滅活，宿主防御系統(tǒng)滅活表現(xiàn)為使噬菌體數(shù)量減少，或/和使噬菌體殺滅感染的細菌能力降低。修飾噬菌體可以籍連續(xù)通過噬菌體，或噬菌體遺傳工程選擇性修飾噬菌體株，使修飾噬菌體在體內保留比野生型噬菌體更長的時間(U.S.Pat.Nos.5,811,0935,766,892，5,688,501.)。
該噬菌體能與其它抗菌劑聯(lián)合使用。能與噬菌體聯(lián)合使用的適當抗菌劑包括，但不限于抗生素和化學療法制劑。此類制劑包括青霉素，頭孢菌素，糖肽類(如萬古霉素，替考拉寧)，該噬菌體能在適當培養(yǎng)基的適當細菌中生長(此處為SA006)。烈解物經(jīng)處理制成無活菌和無像細胞壁類的毒性物質的制劑。例如，烈解物可用如過濾的常規(guī)方法除菌，使用超濾純化除去細菌細胞壁。如陳述中描述該噬菌體可以密封包裝于安瓿或其它包裝形式用于給藥。并以檢測噬菌體稀釋液與特異性的標準菌株共同接種產(chǎn)生的烈解斑數(shù)量確定制劑的近似滴度，同時每批均檢測殘存細菌。具體的為噬菌體制劑的最低濃度介于108至109pfu。此噬菌體制劑可用于注射，也可對其進行濃縮(如凍干)，隨后再重新懸浮于諸如生理鹽水的緩沖液中。該噬菌體制劑還應用諸如豚鼠的實驗動物測定毒性，以確保不含殘存的細菌表面碎片。
據(jù)此，該噬菌體制劑可以確立其組成或原則，以一種適合活體給藥的生物學相容形式給藥于動物體或人體?！斑m合活體給藥的生物學相容形式”是指活性物質的給藥形式，其治療效應超過其毒性效應。該活性物質可以給藥于動物，包括人，寵物動物，家畜，漁業(yè)，動物園動物，和水上公園動物。本發(fā)明確立的治療性活性給藥劑量定義為一種在用量和必要時間間期取得預期效果的有效劑量。例如，一種物質的治療性活性劑量可以依據(jù)諸如個體疾病狀態(tài)，年齡，性別，體重因素而變化。用量范圍可調節(jié)到給出最佳治療反應。例如，每天可給幾個分開的用量，或該用量可按治療情況的需要指征適當?shù)販p少。
該用量可以在106至108pfu/千克/天，最好是108至1011pfu/千克/天。噬菌體給藥可以直至完全消滅致病性細菌。
該活性物質可以用便利的方式給藥，諸如注射(皮下注射，靜脈注射，等)，口服，肺部氣霧劑，鼻腔噴霧，肌肉注射，腹腔注射，陰道灌注，直腸灌注，局部注射，腰椎穿刺，和直接敷用。依據(jù)給藥途徑，此活性物質可被以保護層(如腸衣片或丸劑)避免酶，酸和其它天然條件下的滅活作用。該噬菌體亦可組合成一種氣霧劑形式，特別適合于氣霧吸入給藥至肺。
在此所描述的藥用形式可配制成藥物學允許的可用于人或動物的制劑形式，諸如有效量的活性物質與藥物學許可的載體混合組成。
技術成熟的賦形劑可用作傳輸載體。
噬菌體可凍干，于靜脈注射給藥前再溶解。噬菌體可溶解于適當?shù)拿浇?，如水溶液，或緩沖液，或懸浮于任何適當?shù)囊后w，膠體，或多聚混合物制成抗菌劑?？咕鷦┛山M合成藥膏，或敷料作為藥用，諸如治療創(chuàng)傷感染的敷料，或外科插管，或制成廣譜消毒劑用于皮膚和口腔清潔液，消毒擦洗劑，洗劑。該殺菌劑也可用于清潔醫(yī)療器械，外科手術前擦洗，等等。
本發(fā)明的形式和方法適合于抵抗葡萄球菌，如金黃色葡萄球菌。在預防和治療對如萬古霉素糖肽敏感性降低的葡萄球菌造成的感染，該形式和方法尤其有用。具體在本發(fā)明中，葡萄球菌也是耐甲氧西林的。本發(fā)明中具體首選的組合物和方法用于預防和治療MRSA感染。
具體實施方法以下用非限制性實例說明本發(fā)明用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的噬菌體療法由能烈解于活體中分離的典型MRSA株的噬菌體而建立。該噬菌體經(jīng)鑒定，能殺滅多數(shù)臨床分離的金黃色葡萄球菌。
方法和材料噬菌體制備噬菌體按以下方式分離并命名為phi006。自市政污水廠收集未經(jīng)處理的污水，加入1mol/L NaCl，攪拌使其溶解，冰浴1小時。于4℃以8000g離心20分鐘，將上清液傾入一干凈燒瓶內。加入固體聚乙二醇(PEG6000)至終濃度為10％w/v。于室溫用磁力攪拌器輕輕攪拌使其溶解。冰浴過夜。于4℃以8000g離心20分鐘。棄上清液，將離心管傾斜放置5分鐘，用吸管吸去殘存液體。用一裝有橡皮球的吸管輕輕將噬菌體沉淀重懸于SM溶液中(NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g，1mol/L Tris·Cl(pH7.5)50ml，2％明膠溶液5ml，加水至1L)。加入等體積氯仿，振蕩30秒鐘。于4℃以3000g離心15秒鐘分離有機相和水相?；厥蘸删w顆粒的水相。將該抽提液300μl與200μl過夜培養(yǎng)的SY006混合，于35℃孵育20分鐘，再混合2.5ml于50℃保溫的融化頂層的LB瓊脂(0.5％)，立即倒入1.5％LB瓊脂(LB瓊脂含0.3％葡萄糖，0.075mmol/L CaCl2，0.004mmol/L FeCl3，2mmol/L MgSO2，簡稱LBGCFM)90mm平板上，于35℃培養(yǎng)過夜。收獲該平板噬斑，用該法單斑純化三次。
噬菌體phi006，于SY006宿主菌高滴度增殖，挑取平板上SY006單菌落于1ml LBGCFM液體培養(yǎng)基內，35℃，培養(yǎng)8小時。取該菌0.1ml和0.1ml phi006(2×105PFU/ml)混合于2.8ml 50℃保溫的0.5％LBGCFM瓊脂內，立即倒入1.5％LBGCFM瓊脂平板上，于35℃培養(yǎng)過夜。每平板內加入5ml噬菌體稀釋液(SM)，收取該噬菌體洗脫液，并加入1％氯仿，于35℃，1小時。并于4000g，4℃，離心10分鐘。于上清液中加入聚乙二醇(平均分子量6000)和氯化鈉成終濃度分別為10％和0.5mmol/L，于4℃過夜。8000g，4℃離心20分鐘，將含噬菌體顆粒沉淀物懸浮于10mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，5mmol/L MgCl2，5mmol/L CaCl2緩沖液內。并加入20μg/ml DNase I和10μg/ml RNase A，37℃，30分鐘。噬菌體懸液置于氯化銫密度梯度(ρ＝1.3，1.5，和1.7)內，10,000g，4℃，離心1小時。收集噬菌體帶，并以10mmol/L NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.2)，20mmol/L MgCl2，20mmol/l CaCl2透析該噬菌體兩次，每次1小時。使用前以0.22-μm濾器過濾該高滴度噬菌體制備物，過濾后的噬菌體4℃保存。
金黃色葡萄球菌分離和鑒定本研究所用金黃色葡萄球菌自中山大學第三附屬醫(yī)院外科門診局部感染患者創(chuàng)面處收集并分離鑒定。血瓊脂平板上，周圍呈透明的β-溶血環(huán)之菌落，其血漿凝固酶陽性和甘露醇發(fā)酵陽性之菌株進而測定其抗生素敏感性。接種1.5×108CFU/ml的待測菌于Mueller-Hinton瓊脂平板(每升培養(yǎng)基牛肉浸汁粉2g，水解酪蛋白17.5g，淀粉1.5g，瓊脂13g，氯化鈉40g，加H2O至1L，pH7.4，于115℃滅菌10分鐘，冷卻至45-50℃時傾倒平板，20ml/90mm板)，于35℃培養(yǎng)24小時。同時接種苯唑西林敏感的SAATCC 29213株，和苯唑西林耐藥的SAATCC 43300株為對照。采用美國臨床微生物標準化委員會(NCCLS)推薦分組和判斷標準。藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司，包括苯唑西林，青霉素G，紅霉素，萬古霉素，甲氧芐啶/磺胺甲噁唑，環(huán)丙沙星，氯霉素，呋喃妥因。相關金黃色葡萄球菌菌株凍干保藏于廣州虎克噬菌體有限公司噬菌體實驗室。見表1。
表1.92株金黃色葡萄球菌抗生素敏感試驗模式

注OXA苯唑西林，PEN青霉素G，E紅霉素，VA萬古霉素，SXT甲氧芐啶/磺胺甲噁唑，CIP環(huán)丙沙星，C氯霉素，F(xiàn)T呋喃妥因噬菌體phi006對金黃色葡萄球菌敏感試驗分別挑取上述92株金黃色葡萄球菌單菌落于1ml LBGCFM液體培養(yǎng)基內，35℃，培養(yǎng)8小時。以接種環(huán)挑取一滿環(huán)菌液，于平板涂布直徑約1cm。待接種菌液干躁后滴加噬菌體phi006一滴(約0.01ml)于接種處，置35℃培養(yǎng)8-12小時觀察結果。見表2。
表2.92株金黃色葡萄球菌噬菌體phi006烈解試驗

噬菌體phi006實驗治療小鼠腹腔感染金黃色葡萄球菌一個月齡NIH雌性小鼠(每組5只，2002A022，廣東省科學技術委員會；26-2003A001，廣東省醫(yī)學實驗動物管委會)用于感染實驗。按以下方式建立感染，金黃色葡萄球菌SY050株(耐藥模式為OXARPRERSXTR)35℃生長于LBGCFM液體培養(yǎng)基內，培養(yǎng)18小時，收集菌苔于滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，1,000rpm/分，10分鐘，除去上清，連續(xù)三次PBS洗滌。該PBS菌液連續(xù)稀釋用于測定最小致死劑量(minimum lethal dose，MLD)，注射300μl該稀釋菌液于NIH小鼠一側腹腔，準確記錄小鼠死亡時間，觀察100小時以上。本試驗測得4×109CFU(SY050)為NIH小鼠的MLD，所有接受注射MLD劑量的小鼠于300余分鐘內死亡。見表3。
表3.金黃色葡萄球菌致死性MLD劑量感染NIH小鼠存活時間(分鐘)

腹腔注射MLD劑量細菌后，立即對側腹腔單劑量注射噬菌體phi006。連續(xù)24小時觀察記錄感染動物存活時間的劑量效應。噬菌體高感染復數(shù)0.2和2.0組，100％動物存活。當噬菌體劑量降低，結果低感染復數(shù)0.02組的動物存活時間為600余分鐘。見表4。
噬菌體phi006實驗治療新西蘭兔皮膚感染金黃色葡萄球菌
新西蘭家兔(雌性，2kg，每組3只。2002A025，廣東省科學技術委員會；26-2003A004，廣東省醫(yī)學實驗動物管委會)，按以下方式制備皮膚感染模型。于兔背部前1/3處兩側脫被毛約直徑4cm，以碘伏消毒，皮下接種金黃色葡萄球菌SY050株(100μl，4×109CFU/ml)。接種后7天形成直徑約1-1.5cm潰瘍，并于30天自愈。于不同時間不同劑量給予噬菌體phi006治療，于雙側感染局部皮下或潰瘍部位多點給藥，500μl/次，2次/天，連續(xù)給藥4天。而對照組于接種后7天以10mmol/L NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.2)，20mmol/L MgCl2，20mmol/l CaCl2代替噬菌體phi006。觀察并記錄紅腫消退，潰瘍形成時間，及治愈時間。見表5。
表4.噬菌體phi006挽救小鼠致死性金黃色葡萄球菌菌血癥劑量效應(分鐘)

表5.噬菌體phi006治療新西蘭兔皮膚感染金黃色葡萄球菌(愈合時間天a)

注a自接種細菌后計算；b自接種后無潰瘍形成，紅腫消退的時間；c自接種后潰瘍形成，潰瘍愈合的時間。
生物材料的保藏噬菌體phi006株，已于2004年4月26日按照布達佩斯條約在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏。編號為CGMCC 1139。
權利要求
1.一種分離并純化的金黃色葡萄球菌噬菌體用于治療或預防細菌感染。
2.一種含有金黃色葡萄球菌噬菌體的藥劑。
3.一種如權利要求2所要求的藥劑，其中的噬菌體是phi006，或phi006的修飾株。
4.一種治療細菌感染性疾病的方法，以一種動物組合給藥給予動物噬菌體進行治療，該噬菌體如權利要求1所要求的。
5.一種如權利要求4中所要求的方法，所指細菌感染性疾病是由金黃色葡萄球菌引起。
6.一種降低細菌毒力的方法，以一種受試動物組合給藥給予動物有效劑量的如權利要求1所要求的噬菌體。
7.一種如權利要求6所要求的方法，所指細菌是金黃色葡萄球菌，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。
8.一種如權利要求1所要求的噬菌體，以有效噬菌體劑量殺滅或抑制細菌生長的方法。
9.一種如權利要求8所要求的方法，所指細菌是金黃色葡萄球菌，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。
10.一種如權利要求8所要求的方法，所指方法用于處理食品，制造食品的原料，動物飼料，醫(yī)療器械，皮膚，外科導管，或金屬器，塑料器，搪瓷器，瓷器和玻璃表面。
11.一種如權利要求8所要求的殺菌劑，含有分離并純化的噬菌體phi006。
全文摘要
本發(fā)明涉及篩選出的金黃色葡萄球菌噬菌體，用作活性治療物質殺滅細菌或抑制細菌生長，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)。
文檔編號C12N7/01GK1690194SQ20041003760
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月26日 優(yōu)先權日2004年4月26日
發(fā)明者何儉 申請人:何儉