專利名稱：人脂酶樣基因編碼的多肽及利用它的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三酰甘油脂酶家族的多肽，編碼該多肽的核酸，來自該核酸的反義序列和針對(duì)該多肽的抗體。本發(fā)明也涉及以重組技術(shù)制備該多肽以及該多肽用于篩選其興奮劑和/或拮抗物的用途。本發(fā)明也涉及在治療脂類和脂蛋白代謝紊亂的藥物組合物中使用這些多肽和編碼這些多肽的核酸序列用于治療，包括基因治療的方法。
背景技術(shù)：
A)脂類脂類是非水溶性的有機(jī)生物分子，它們是多種生物學(xué)功能包括能量貯藏、運(yùn)輸和代謝以及膜的結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性的基本成分。在人和動(dòng)物中，脂類有兩個(gè)來源某些脂類以飲食脂肪和油類的形式攝入，其它的脂類由人和動(dòng)物生物合成。哺乳動(dòng)物中至少10％的體重是脂類，其大部分以三酰甘油的形式存在。
三酰甘油也稱為甘油三酯和三酰甘油酯，是由與甘油酯化的三個(gè)脂肪酸組成的。飲食中的三酰甘油酯貯藏于脂肪組織中作為能量來源或由三酰甘油脂酶在消化道內(nèi)水解，最重要的三酰甘油脂酶是胰脂肪酶。三酰甘油以脂蛋白的形式在組織間運(yùn)輸。
在血漿中發(fā)現(xiàn)的脂蛋白是微團(tuán)樣集群，包含各種比例的不同類型的脂類和蛋白(稱為脫輔基蛋白質(zhì))。有五種主要的血漿脂蛋白種類，其主要功能是脂類運(yùn)輸。按密度增加的順序，這些種類依次是乳糜微粒，極低密度脂蛋(VLDL)，中密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。盡管發(fā)現(xiàn)每種脂蛋白與多種類型的脂類相關(guān)，但是每種主要運(yùn)輸一種類型的脂類上述的三酰甘油在乳糜微粒，VLDL和IDL中運(yùn)輸；而磷酯和膽固醇酯分別在HDL和LDL中運(yùn)輸。
磷脂是磷酸甘油的二脂肪酸酯，也包含一個(gè)與磷酸偶聯(lián)的極性基團(tuán)。磷脂是細(xì)胞膜重要的結(jié)構(gòu)成分。磷脂被磷脂酶水解。磷脂酰膽堿是典型的磷脂，它是大多數(shù)真核細(xì)胞膜的主要成分。
膽固醇是類固醇激素和膽汁酸的代謝前體，也是細(xì)胞膜的基本組成成分。在人和其它動(dòng)物中，膽固醇可通過飲食攝入，也可由肝臟和其它組織合成。膽固醇可在LDL和其它脂蛋白中以膽固醇酯的形式在組織間運(yùn)輸。
膜包圍著每一個(gè)活細(xì)胞，并作為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外區(qū)室間的屏障。膜也包圍著真核細(xì)胞核，構(gòu)成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并在例如圍繞軸突的髓鞘中行使特殊功能。典型的膜包含約40％脂類和60％蛋白質(zhì)，但也有很大差異。主要的脂類組分是磷脂，特別是磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺和膽固醇。膜的生理化學(xué)特征如流動(dòng)性可通過調(diào)整磷脂中脂肪酸組成或膽固醇含量來改變。調(diào)節(jié)膜脂類的成分和組成也可調(diào)節(jié)膜依賴性的細(xì)胞功能如受體活性、內(nèi)吞作用及膽固醇流出。
B)酶三酰甘油脂酶是在體內(nèi)脂代謝中發(fā)揮幾種關(guān)鍵作用的酶家族。已有人三酰甘油脂酶家族的三個(gè)成員得到描述胰脂肪酶、脂蛋白脂酶和肝脂肪酶(Goldberg，I.J.，Le，N.，Ginsberg，H.N.，Krauss，R.M.和Lindgren，F(xiàn).T.(1988)臨床研究雜志，81，561-568；Goldberg，I.J.，Le，N.，Paterniti J.R.，Ginsberg，H.N.，Lindgren，F(xiàn).T.和Brown，W.V.(1982)臨床研究雜志，70，1184-1192；Hide，W.A.，Chan，L.和Li，W.-H.(1992)脂類研究雜志33，167-178)。胰脂肪酶主要負(fù)責(zé)飲食中脂類的水解。已有多種胰脂肪酶得到描述，但還未確定其生理作用(Giller，T.，Buchwald，P.，Blum-Kaelin，D.和Hunziker，W.(1992)生物化學(xué)雜志，267，16509-16516)。脂蛋白脂酶是負(fù)責(zé)體內(nèi)三酰甘油分布和利用的主要酶。脂蛋白脂酶水解乳糜微粒和VLDL中的三酰甘油酯。肝脂肪酶水解IDL和HDL中的三酰甘油酯并負(fù)責(zé)脂蛋白重建。肝脂肪酶也作用為磷脂酶并水解HDL中的磷脂。
磷脂酶在脂蛋白的磷脂成分和膜磷脂的分解代謝和重建中起重要作用。磷脂酶在花生四烯酸的釋放及隨后的前列腺素、白三烯及參與多種炎癥過程的其它脂類的形成中起作用。
由這些脂酶基因編碼的脂酶多肽長(zhǎng)約450個(gè)氨基酸并有促進(jìn)分泌的前導(dǎo)信號(hào)肽。脂酶由兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成(Winkler，K.，D’Arcy，A.和Hunziker，W.(1990)自然，343，771-774)。氨基末端結(jié)構(gòu)域含催化位點(diǎn)而羧基結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為負(fù)責(zé)底物結(jié)合、輔因子結(jié)合及與細(xì)胞受體相互作用(Wong，H.，Davis，R.C.，Nikazy，J.，Seebart，K.E.和Schotz，M.C.(1991)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88，11290-11294；vanTilbeurgh，H.，Roussel，A.，Lalouel，J.-M.和Cambillau，C.(1994)生物化學(xué)雜志269，4626-4633；Wong，H.，Davis，R.C.，Thuren，T.，Goers，J.W.，Nikazy，J.，Waite，M.和schotz，M.C.(1994)生物化學(xué)雜志269，10319-10323；Chappell，D.A.，Inoue，I.，F(xiàn)ry，G.L.，Pladet，M.W.，Bowen，S.L.，Iverius，P.-H.，Lalouel，J.-M.和Strickland，D.K.(1994)生物化學(xué)雜志，269，18001-18006).家族成員間氨基酸同源性的整體水平為22-65％，并具有與酶功能相關(guān)并與結(jié)構(gòu)同源性一致的高同源性的部分區(qū)域。
天然存在的脂蛋白脂酶蛋白是糖基化的，而且糖基化是LPL酶活性必需的(Semenkovich，C.F.，Luo，C.-C.，Nakanishi，M.K.，Chen，S.-H.，Smith，L.C.和Chan L.(1990)生物化學(xué)雜志，265，5429-5433).在肝脂肪酶和脂蛋白脂酶中有兩個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)，在胰脂肪酶中有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。另外，四對(duì)半胱氨酸形成的二硫鍵對(duì)于維持酶活性的結(jié)構(gòu)完整性是必需的(Lo，J.-Y.，Smith，L.C.，和Chan，L.(1995)生物物理和生物化學(xué)通訊206，266-271；Brady，L.，Brzozowski，A.M.，Derewenda，Z.S.，Dodson，E.，Dodson G.，Tolley，S.，Turkenburg，J.P.，Christiansen，L.，Huge-JensenB.，Norskov，L.，Thim，L.和Menge，U.(1990)自然343，767-770)。
三酰甘油酯酶家族的成員有許多共同的保守結(jié)構(gòu)特征。其這樣的特征之一是“GXSXG”基序，其中處于中心的絲氨酸殘基是組成“催化三聯(lián)體”的三個(gè)殘基之一(Winkler，K.，D’Arcy，A.和Hunziker，W.(1990)自然343，771-774；Faustinella，F(xiàn).，Smith，L.C.和Chan，L(1992)生物化學(xué)31，7219-7223)。保守的天冬氨酸和組氨酸殘基構(gòu)成催化三聯(lián)體的平衡。19-23個(gè)氨基酸的一小段(“蓋區(qū)”)形成兩親性螺旋結(jié)構(gòu)并覆蓋酶的催化口袋(Winkler，K.，D’Arcy，A.和Hunziker，W.(1990)自然343，771-774)。這一區(qū)域在家族成員之間不同，并且最近確定這一段賦予酶底物特異性(Dugi，K.A.，Dichek H.L.和Santamarina-Fojo，S.(1995)生物化學(xué)雜志270，25396-25401)。肝脂肪酶和脂蛋白脂酶間的比較已表明三酰甘油脂酶的不同，并且酶的磷脂酶活性由此蓋區(qū)部分調(diào)節(jié)(Dugi，K.A.，Dichek H.L.和Santamarina-Fojo，S.(1995)生物化學(xué)雜志270，25396-25401)。
三酰甘油脂酶有不同程度的肝素結(jié)合活性。脂蛋白脂酶具最高的肝素親和性并且此結(jié)合活性已定位于氨基末端結(jié)構(gòu)域帶正電荷的區(qū)域(Ma，Y.，Henderson，H.E.，Liu，M.-S.，Zhang，H.，F(xiàn)orsythe，I.J.，Clarke-Lewis，I.，Hayden，M.R.和Brunzell，J.D.脂類研究雜志35，2049-2059)。脂蛋白脂酶在內(nèi)皮細(xì)胞表面的定位(Cheng，C.F.，Oosta，G.M.，Bensadoun，A.和Rosenberg，R.D.(1981)生物化學(xué)雜志256，12893-12896)主要通過與表面蛋白聚糖的結(jié)合來介導(dǎo)(Shimada K.，Gill，P.J.，Silbert，J.E.，Douglas，W.H.J.和Fanburg，B.L.，(1981)臨床研究雜志，68，995-1002；Saxena，U.，Klein，M.G.和Goldberg，I.J.(1991)生物化學(xué)雜志266，17516-17521；Eisenberg，S.，Sehayek，E.，Olivecrona，T.和Vlodavsky，I.(1992)臨床研究雜志90，2013-2021)。此結(jié)合活性可作為L(zhǎng)DL和細(xì)胞表面間的橋梁加速LDL攝入(Mulder，M.，Lombardi，P.，Jansen，H.，van Berkel T.J.，F(xiàn)rantsR.R.和Havekes，L.M.(1992)生物物理和生物化學(xué)通訊185，582-587；Rutledge，J.C.和Goldberg，I.J.(1994)脂類研究雜志35，1152-1160；Tsuchiya，S.，Yamabe，M.，Yamaguchi，T.，Kobayashi，Y.，Konno，T.和Tada，K.(1980)國(guó)際腫瘤雜志26，171-176)。
已知脂蛋白脂酶和肝脂肪酶與輔激活物蛋白結(jié)合作用對(duì)于脂蛋白脂酶，是載脂蛋白CII；而對(duì)于胰脂肪酶，是輔脂肪酶。
已有報(bào)道編碼人胰脂肪酶、肝脂肪酶和脂蛋白脂酶的基因序列(基因庫(kù)登記號(hào)分別為#M93285，#J03540和#M15856)。人肝脂肪酶和胰脂肪酶的信使RNA分別為約1.7和1.8kb。從人脂蛋白脂酶基因合成3.6和3.2kb的兩個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄物。這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物使用交替的多聚腺苷酸化信號(hào)，它們的翻譯效率不同(Ranganathan，G.，Ong，J.M.，Yukht，A.，Saghizadeh，M.，Simsolo，R.B.，Pauer，A.和Kem，P.A.(1995)生物化學(xué)雜志，270，7149-7155)。
C)生理過程脂類代謝涉及脂類脫輔基蛋白、脂蛋白和酶的相互作用。
肝脂肪酶和脂蛋白脂酶是多功能蛋白，它們介導(dǎo)脂蛋白和磷脂的結(jié)合、攝入、分解代謝和重建。脂蛋白脂酶和肝脂肪酶分別在與外周組織和肝臟內(nèi)皮細(xì)胞的腔面結(jié)合時(shí)起作用。兩種酶都參與膽固醇的反向運(yùn)輸，即膽固醇從外周組織到肝臟的運(yùn)動(dòng)以從體內(nèi)排泄或再循環(huán)。已知肝脂肪酶和脂蛋白脂酶的遺傳缺陷是家族性脂蛋白代謝紊亂的原因。脂蛋白代謝的缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝紊亂包括高膽固醇血癥、高脂血癥和粥樣硬化。
動(dòng)脈粥樣硬化是復(fù)雜的多基因疾病，組織學(xué)上定義為脂類和其它血液衍生物在血管壁特別是大動(dòng)脈(主動(dòng)脈，冠狀動(dòng)脈，頸動(dòng)脈)上的沉積(脂類或纖維脂類斑塊)。根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化過程進(jìn)行的程度，或多或少鈣化的這些斑塊可能與損害有關(guān)并與主要由膽固醇脂組成的脂肪沉積在血管內(nèi)的積累相關(guān)。這些斑塊伴隨有血管壁變厚、平滑肌肥大、泡沫細(xì)胞的出現(xiàn)(聚集的巨噬細(xì)胞無限制攝入膽固醇產(chǎn)生的充滿脂類的細(xì)胞)和纖維組織的積累。動(dòng)脈粥樣化斑塊明顯地從血管壁上突出，證明它導(dǎo)致了狹窄，應(yīng)對(duì)發(fā)生于最易感的那些病人中的動(dòng)脈粥樣化、血栓形成或栓塞引起的血管阻塞負(fù)責(zé)，這些損害可導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管病變?nèi)绻Ｈ?、猝死、心閉鎖不全和中風(fēng)。
三酰甘油脂酶在諸如動(dòng)脈粥樣硬化的血管病變中的作用一直是集中研究的領(lǐng)域(由Olivecrona，G.和Olivecrona，T.(1995)在現(xiàn)代脂類評(píng)論6，291-305中綜述)?？偟膩碚f，據(jù)認(rèn)為三酰甘油脂酶的作用是抗動(dòng)脈粥樣化，因?yàn)檫@些酶降低了血清三酰甘油水平并促進(jìn)HDL形成。表達(dá)人脂蛋白脂酶或肝脂肪酶的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具降低的血漿三酰甘油和升高的高密度脂蛋白(HDL)水平(Shimada，M.，Shimano，H.，Gotoda，T.，Yamamoto，K.，Kawamura，M.，Inaba，T.，Yazaki，T.和Yamada，N.(1993)生物化學(xué)雜志268，17924-17929；Liu，M.-S.，Jirik，F(xiàn).R.，LeBoeuf，R.C.，Henderson，H.，Castellani，L.W.，Lusis，A.J.，ma，Y.，F(xiàn)orsythe，I.J.，Zhang，H.，Kirk，E.，Brunzell，J.D.和Hayden，M.R.(1994)生物化學(xué)雜志269，11417-11424)。已發(fā)現(xiàn)有導(dǎo)致脂蛋白脂酶活性水平下降的遺傳缺陷的人患高三酰甘油血癥從而患冠心病的危險(xiǎn)性沒有增加。據(jù)報(bào)道這是由于缺少中等大小的；可在亞內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)域內(nèi)積累的致動(dòng)脈粥樣化的脂蛋白(Zilversmit，D.B.(1972)循環(huán)研究，33，633-638)。
然而，據(jù)推測(cè)，在動(dòng)脈粥樣硬化的分布區(qū)中，脂酶活性水平的升高加速致動(dòng)脈粥樣化進(jìn)程(Zilversmit，D.B.(1995)臨床化學(xué)41，153-158；Zambon，A.，Torres，A.，Bijvoet，S.，Gagne，C.，Moojani，S.，Lupien，P.J.，Hayden M.R.和brunzell，J.D.(1993)Lancet341，1119-1121)。這可能是由于脂酶介導(dǎo)的血管組織結(jié)合和攝入的脂蛋白增加(Eisenberg，S.，Sehayek，E.，Olivecrona，T.Vlodavsky，I.(1992)臨床研究雜志90，2013-2021；Tabas，I.，Li，I.，Brocia R.W.，Xu，S.W.，Swenson T.L.和Williams，K.J.(1993)生物化學(xué)雜志(268，20419-20432；Nordestgaard，B.G.和Nielsen，A.G.(1994)現(xiàn)代脂類評(píng)論5，252-257；Williams，K.J.和Tabas，I.(1995)Art.Thromb.and Vasc.Biol.15，551-561)。另外，局部高水平的脂酶活性可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化損傷前體中合成細(xì)胞毒性水平的脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿。
盡管對(duì)脂酶活性在脂類內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的作用的理解有所發(fā)展，但是本領(lǐng)域內(nèi)仍有鑒定其它編碼調(diào)節(jié)脂類代謝蛋白的基因的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及脂酶樣基因(LLG)的發(fā)現(xiàn)、其表達(dá)的多肽產(chǎn)品及利用它的組合物和方法。LLG多肽與肝素結(jié)合，與人脂蛋白脂酶和肝脂肪酶有同源性并含有三酰甘油脂酶家族39kD的催化結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，此多肽具有磷脂酶A活性。
本發(fā)明提供包含序列SEQ ID NO10的分離的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含序列SEQ ID NO8并在10％SDS-PAGE凝膠上表現(xiàn)分子量為約55kD或68kD的分離的多肽。
本發(fā)明也提供包含序烈SEQ ID NO6并在10％SDS-PAGE凝膠上表現(xiàn)分子量為約40kD的分離的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供LLG多肽的抗原性片段。
本發(fā)明的另一方面是編碼具有前述序列多肽的分離的核酸。
本發(fā)明的另一方面是包含前述與調(diào)控區(qū)域如啟動(dòng)子可調(diào)控地相連的編碼所述多肽的核酸的載體。
本發(fā)明的另一方面是包含上述載體的重組細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面是制備多肽的方法，包括在允許所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有編碼該多肽的核酸的重組細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面是能特異地結(jié)合根據(jù)本發(fā)明所述的多肽和/或中和根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的生物學(xué)活性的抗體。確實(shí)，本發(fā)明多肽的進(jìn)一步特征是特異組合本發(fā)明的抗體，即對(duì)LLG多肽特異的抗體。
本發(fā)明的另一方面是包含根據(jù)本發(fā)明所述的多肽、核酸、載體、反義核酸或抗體和藥物學(xué)可接受的載體的組合物。
本發(fā)明的另一方面是篩選本發(fā)明多肽表現(xiàn)的酶活性的興奮劑和拮抗物的方法，包括使可能的興奮劑或拮抗物與該多肽及其底物接觸并測(cè)量可能的興奮劑或拮抗物增強(qiáng)或抑制活性的能力。
本發(fā)明的另一方面是磷脂酰膽堿酯的酶促水解方法，包括使該磷脂酰膽堿酯與本發(fā)明的多肽接觸。
本發(fā)明的另一方面是改善具有不合乎要求的脂類分布型的人或其它動(dòng)物的血清脂類分布型的治療方法，包括給其施用有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的組合物。
本發(fā)明的另一方面是在人或其它動(dòng)物中治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法，包括給其施用有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的組合物。
本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)在附圖及其下文優(yōu)選的實(shí)施方案詳述中得到進(jìn)一步描述。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示在作為例證的PCR擴(kuò)增中所用的引物序列(SEQ ID No17-31)。
圖2表示包含脂酶樣基因cDNA的差異顯示RT-PCR產(chǎn)物的核酸序列(SEQ ID NO1)和推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增中所用的兩個(gè)引物的序列下劃線。在終止密碼子和聚腺苷酸化信號(hào)上加框。GAATCC基序和側(cè)翼序列來自其中克隆了產(chǎn)物的pCRII載體。
圖3表示LLG cDNA的5’RACE延伸的核酸序列(SEQ ID NO3)和推測(cè)的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。在對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增中所用的兩個(gè)引物的序列下劃線。GAATCC基序和側(cè)翼序列來自其中克隆了產(chǎn)物的pCRII載體。
圖4表示含有脂酶樣基因LLGXL完整開放閱讀框架的cDNA序列(SEQ ID NO7)。在起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)上加框。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)所用的DraI位點(diǎn)(TTTAAA)和SrfI位點(diǎn)(GCCCGGGC)下劃線。
圖5表示LLGXL蛋白的推測(cè)氨基酸序列(SEQ ID NO8)。在預(yù)測(cè)的信號(hào)序列下劃線。
圖6表示三酰甘油脂酶基因家族成員的蛋白序列匹配(SEQID No13-15)。陰影部分的殘基與LLGXL蛋白相同(SEQ ID NO8)。使用CLUSTAL程序時(shí)在序列中引入缺口以使匹配值達(dá)到最大。
圖7表示THP-1細(xì)胞中LLG mRNA的Northern分析。以PMA或以PMA和氧化的LDL(PMA+oxLDL)刺激細(xì)胞。左邊的數(shù)字表示RNA標(biāo)準(zhǔn)的位置(按千堿基)。
圖8表示以LLG、脂蛋白脂酶(LPL)和人β肌動(dòng)蛋白cDNA作探針對(duì)來自多種人組織的mRNA進(jìn)行的Northern分析。在LLG和LPL組的左側(cè)表示了4.4kb RNA標(biāo)準(zhǔn)的位置。
圖9表示在培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中LLG和LPL表達(dá)的Northern分析。細(xì)胞或者是未經(jīng)刺激的(不與PMA接觸)，或者是經(jīng)PMA刺激的。
圖10表示免疫肽的序列(SEQ ID NO16)及其與LLGXL蛋白序列的關(guān)系。肽在陰影框中表示。引入末端半胱氨酸以有助于此肽與載體蛋白偶聯(lián)。
圖11表示對(duì)來自培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的肝素-Sepharose濃縮蛋白進(jìn)行的Western分析。印跡以抗LLG抗血清為探針。左邊的數(shù)字代表以千道爾頓為單位的蛋白標(biāo)準(zhǔn)的位置。
圖12表示對(duì)來自用含LLGN或LLGXL的cDNA或不含DNA(模擬實(shí)驗(yàn))的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的肝素-Sepharose結(jié)合蛋白進(jìn)行的Western分析。包括來自經(jīng)PMA刺激的內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC+PMA)的蛋白作為大小參照。左邊的數(shù)字代表通過與蛋白標(biāo)準(zhǔn)相比確定的主要免疫反應(yīng)蛋白的表現(xiàn)分子量。
圖13表示兔LLG PCR產(chǎn)物的序列(RLLG.SEQ，SEQ ID NO12)及兔LLG PCR產(chǎn)物和相應(yīng)的人cDNA序列(LLG7742A)之間的序列對(duì)比。相同的核苷酸以陰影表示。
圖14表示以磷脂酰膽堿為底物，人LPL、LLGN和LLGXL的磷脂酶A的活性。
圖15表示以三油酸甘油酯為底物，人LPL、LLGN和LLGXL的三酰甘油脂酶活性。
圖16表示LLG和LPL探針與不同物種的基因組DNA的雜交。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及脂酶樣基因(LLG)的發(fā)現(xiàn)及其表達(dá)的多肽產(chǎn)物。這些多肽產(chǎn)物是三酰甘油脂酶家族的成員，包含三酰甘油脂酶家族約39kD的催化區(qū)域，例如具有序列SEQ ID NO10。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是有354個(gè)氨基酸的LLGN多肽。本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案是有500個(gè)氨基酸、與人脂蛋脂酶有43％相似性并與人肝脂肪酶有37％相似性的LLGXL多肽。LLGXL多肽有磷脂酶A活性。
本發(fā)明人從與佛波酯和氧化的LDL接觸的THP-1細(xì)胞的mRNA分離部分cDNA。經(jīng)此部分cDNA的5’RACE延伸后，分離到更小的交替剪接cDNA。從人胎盤cDNA文庫(kù)中分離到第二個(gè)更大的cDNA。
Northern分析表明LLG基因在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。針對(duì)從cDNA的開放閱讀框架推測(cè)的多肽產(chǎn)生的抗血清在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到具有LLGN和LLGXL預(yù)測(cè)大小的蛋白。用佛波酯對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的處理導(dǎo)致LLG mRNA和蛋白水平的升高。這是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的三酰甘油脂酶家族成員。
A)定義下面定義的術(shù)語在本說明書使用，應(yīng)有助于理解本發(fā)明的范圍和實(shí)施。
“多肽”是包含共價(jià)連接的氨基酸的高分子化合物。氨基酸具有下列通用結(jié)構(gòu) 根據(jù)側(cè)鏈R，將氨基酸分成七類(1)脂族側(cè)鏈，(2)含有羥基(OH)的側(cè)鏈，(3)含有硫原子的側(cè)鏈，(4)含有酸性或酰胺基因的側(cè)鏈，(5)含有堿性基因的側(cè)鏈，(6)含有芳香環(huán)的側(cè)鏈，以及(7)脯氨酸，其中側(cè)鏈與氨基結(jié)合。
“蛋白質(zhì)”指在活細(xì)胞中起結(jié)構(gòu)或功能作用的多肽。
本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)可以糖基化或非糖基化。
“同源性”是指反映共同進(jìn)化來源的序列間的相似性。如果多肽或蛋白中相當(dāng)數(shù)量的氨基酸是(1)相同的或(2)具有化學(xué)上相似的R側(cè)鏈，則說它們具同源性或相似性。如果核酸中相當(dāng)數(shù)量的核苷酸是相同的，則說它們具同源性。
“分離的多肽”或“分離的蛋白質(zhì)”是指基本上與在其天然狀態(tài)下通常與其結(jié)合的化合物(如其它蛋白或多肽，核酸，碳水化合物，脂類)分離的多肽或蛋白。“分離的”并不排除與其它化合物的人工的或合成的混合物；或存在不影響生物學(xué)活性的雜質(zhì)，雜質(zhì)的存在可能由于例如不完全純化、穩(wěn)定劑的加入或復(fù)合成藥學(xué)上可接受的制品。
如果一個(gè)分子能特異地與免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別分子如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體相互作用，則其是“抗原性的”?？乖远嚯暮兄辽偌s5個(gè)，優(yōu)選地約10個(gè)氨基酸。分子的抗原性部分可以是對(duì)抗體或T細(xì)胞受體識(shí)別免疫顯性的部分，或通過將抗原性部分與載體分子偶聯(lián)用于產(chǎn)生針對(duì)此分子的抗體的部分?？乖苑肿颖旧聿灰欢ň呙庖咴裕礇]有載體時(shí)能引發(fā)免疫反應(yīng)。
“LLGN多肽”和“LLGN蛋白”指包含序列SEQ ID NO6的多肽，該多肽是糖基化或非糖基化的。
“LLGXL多肽”和“LLGXL蛋白”指包含序列SEQ ID NO8的多肽，該多肽是糖基化或非糖基化的。
“LLG多肽”通常描述LLGN多肽和LLGXL多肽。
本發(fā)明的LLG多肽或蛋白包括來自LLG多肽并保留LLG多肽的至少一種生物學(xué)特性的類似物、片段、衍生物或突變體。自然界存在LLG多肽的各種變體。這些變體可以是以編碼這個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列差異為特征的等位變異或可以涉及差異剪接或翻譯后修飾。熟練的技術(shù)人員能夠制備具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、刪除、添加或替代的變體。這些變體可包括，特別是(a)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用保守或非保守氨基酸置換的變體，(b)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加入LLG多肽的變體，(c)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸包含取代基的變體，和(d)其中LLG多肽與另一個(gè)多肽如血清白蛋白融合的變體。本發(fā)明的其它LLG多肽包括一個(gè)種的保守或非保守位置的氨基酸殘基被另一個(gè)種的相應(yīng)殘基置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，非保守位置的氨基酸殘基用保守或非保守殘基置換。得到這些變體的技術(shù)包括遺傳的(抑制，刪除，突變等)、化學(xué)的和酶學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。
如果這樣的等位變異、類似物、片段、衍生物、突變體和修飾物，包括mRNA剪接形式和翻譯后修飾形式產(chǎn)生保留LLG多肽任一生物學(xué)特性的LLG多肽衍生物，它們都包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
核酸是包含共價(jià)連接的稱為核苷酸的亞單位的高分子化合物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)和多聚脫氧核糖核酸(DNA)，它們可以是單鏈或雙鏈的。DNA包括cDNA、基因組DNA、合成DNA和半合成DNA。編碼蛋白的核苷酸序列稱為有義序列。
“反義核酸”是與有義序列互補(bǔ)的核苷酸序列。反義核酸可用于負(fù)調(diào)節(jié)或阻斷由有義鏈編碼的多肽的表達(dá)。
“分離的核酸”是指基本上不含有在其天然狀態(tài)下通常與其結(jié)合的化合物的核酸?！胺蛛x的”并不排除與其它化合物的人工的或合成的混合物，或存在不影響生物學(xué)活性的雜質(zhì)，雜質(zhì)的存在可能由于例如不完全純化、穩(wěn)定劑的加入或復(fù)合成藥學(xué)上可接受的制品。
短語“在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸”指雜交的核酸能夠抵抗高嚴(yán)謹(jǐn)條件下的洗滌。DNA-DNA雜交的高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件的例子之一是68℃時(shí)0.1×SSC，0.5％SDS。其它的高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。
“調(diào)控區(qū)域”指調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的核酸序列。調(diào)控區(qū)域可包括天然負(fù)責(zé)表達(dá)特定核酸(同源區(qū)域)的序列或包括不同復(fù)制起點(diǎn)(負(fù)責(zé)表達(dá)不同蛋白或甚至合成蛋白)的序列。具體地，此序列可以是真核或病毒基因序列或衍生序列，它們可以特異的或非特異的方式和可誘導(dǎo)或不可誘導(dǎo)的方式刺激或抑制基因表達(dá)。調(diào)控區(qū)域包括復(fù)制起點(diǎn)，RNA剪接位點(diǎn)，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止序列，引導(dǎo)多肽進(jìn)入靶細(xì)胞中的分泌途徑的信號(hào)序列以及啟動(dòng)子。
“異源”調(diào)控區(qū)域是天然不與要表達(dá)的核酸相關(guān)的調(diào)控區(qū)域。異源調(diào)控區(qū)域包括來自不同種的調(diào)控區(qū)域，來自不同基因的調(diào)控區(qū)域，雜合調(diào)控序列，以及天然不存在的由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員設(shè)計(jì)的調(diào)控序列。
“載體”是將根據(jù)本發(fā)明所述的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何方法。術(shù)語“載體”包括體外、離體或體內(nèi)將核酸導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞的病毒和非病毒方法。非病毒載體包括質(zhì)粒，脂質(zhì)體，帶電脂類(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)，DNA-蛋白復(fù)合物和生物多聚體。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺伴隨病毒，痘病毒，桿狀病毒，牛痘，單純皰疹，Epstein-Barr病毒和腺病毒載體。除了根據(jù)本發(fā)明所述的核酸，載體也可包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控區(qū)域和/或用于選擇、測(cè)定和監(jiān)測(cè)核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移到哪個(gè)組織，表達(dá)時(shí)間等)的選擇標(biāo)記。
“重組細(xì)胞”是含有天然不存在于細(xì)胞內(nèi)的核酸的細(xì)胞?！爸亟M細(xì)胞”包括高等真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，低等真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，原核細(xì)胞和古細(xì)菌細(xì)胞。
“藥物上可接受的載體”包括藥物上可接受的給藥方法中的稀釋液和填料，它們是無菌的，可以是用合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑制成的液體或油質(zhì)懸浮劑。特定的藥物上可接受的載體和活性化合物與載體的比例由組合物的溶解性和化學(xué)特征、給藥的特定方式和標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐決定。
“脂酶”是可以酶切脂類底物的蛋白。
“磷脂酶”是可以酶切磷脂底物的蛋白。
“三酰甘油脂酶”是可以酶切三酰甘油脂底物的蛋白。
“磷脂酰膽堿”是具有下列結(jié)構(gòu)的甘油磷脂
R和R’是脂肪酸的烴側(cè)鏈。磷脂酰膽堿也稱為卵磷脂。
“脂類分布型”是指在人類或其它動(dòng)物體內(nèi)膽固醇，三酰甘油脂，脂蛋白膽固醇及其它脂類的濃度情況。
“不合乎要求的脂類分布型”是指其中膽固醇、三酰甘油脂或脂蛋白膽固醇的濃度超出了年齡和性別調(diào)節(jié)的參照范圍的情況。通常，總膽固醇濃度＞200mg/dl，血漿三酰甘油酯濃度＞200mg/dl，LDL膽固醇濃度＞130mg/dl，HDL膽固醇濃度＞39mg/dl，或總膽固醇與HDL膽固醇的比率＞4.0時(shí)，認(rèn)為是不合乎要求的脂類分布型。不合乎要求的脂類分布型與多種病理學(xué)情況包括高脂血癥、糖尿病高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和其它形式的冠狀動(dòng)脈疾病相關(guān)。
B)多肽本發(fā)明提供三酰甘油脂酶家族成員多肽，它包含三酰甘油脂酶家族39kD的催化結(jié)構(gòu)域，如具有序列SEQ ID NO10的多肽。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是含序列SEQ ID NO6并且在10％SDS-PAGE凝膠上表現(xiàn)分子量為約40kD的分離的LLG多肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含序列SEQ ID NO8并且在10％SDS-PAGE凝膠上表現(xiàn)分子量為約55kD或68kD的分離的LLG多肽。
本發(fā)明的多肽和蛋白可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，并且可來源于人、兔或其它動(dòng)物。這些多肽的特征在于可重復(fù)的單一分子量和/或多套分子量、層析反應(yīng)和洗脫分布型、氨基酸組成和序列以及生物學(xué)活性。
本發(fā)明的多肽可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的純化方法從天然來源如胎盤提取物、人血漿或培養(yǎng)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基分離。
選擇性地，本發(fā)明的多肽可用重組DNA技術(shù)制備，包括將編碼此多肽的核酸重組進(jìn)合適的載體，將產(chǎn)生的載體插入合適的宿主細(xì)胞，回收產(chǎn)生的宿主細(xì)胞合成的多肽并純化回收的多肽。
C)核酸本發(fā)明提供編碼LLG多肽的分離的核酸。
本發(fā)明也提供可用于體外、離體或體內(nèi)負(fù)調(diào)控或阻斷LLG多肽表達(dá)的反義核酸。
重組DNA技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知?？寺『捅硎局亟M分子的通用技術(shù)在Maniatis(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1982)和Ausubel現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，Wiley and Sons，1987)進(jìn)行了描述，在此引用作為參考。
本發(fā)明的核酸可與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控區(qū)域相連。合適調(diào)控區(qū)域或其它區(qū)域的選擇是常規(guī)方法，在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平之內(nèi)。調(diào)控區(qū)域包括啟動(dòng)子，也可包括增強(qiáng)子、抑制子等。
可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子和可調(diào)控的(可誘導(dǎo)的)啟動(dòng)子。根據(jù)宿主，啟動(dòng)子可以是原核或真核的。用于實(shí)施本發(fā)明的原核(包括噬菌體)啟動(dòng)子是lacI，lacZ，T3，T7，λPr，PI和Trp啟動(dòng)子。用于實(shí)施本發(fā)明的真核(包括病毒)的啟動(dòng)子是普遍存在的啟動(dòng)子(如HPRT，波形蛋白，肌動(dòng)蛋白，微管蛋白)，中間纖維啟動(dòng)子(如橋粒蛋白，神經(jīng)絲，角蛋白，GFAP)，治療性基因啟動(dòng)子(如MDR型，CFTR，因子VIII)，組織特異性啟動(dòng)子(如平滑肌細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，或內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有活性的Flt和Flk啟動(dòng)子)，分裂細(xì)胞中優(yōu)先活化的啟動(dòng)子，對(duì)刺激反應(yīng)的啟動(dòng)子(如甾類激素受體，視黃酸受體)，四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，細(xì)胞肥大病毒立即早期、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR、金屬硫蛋白、SV-40、Ela和MLP啟動(dòng)子。四環(huán)素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子和CMV啟動(dòng)子在WO96/01313，美國(guó)5,168,062和5,385,839中有所描述，其內(nèi)容在此引用作為參考。
優(yōu)選地，用于基因治療的病毒載體是復(fù)制缺陷型的，也就是說，它們不能在靶細(xì)胞中自主復(fù)制。通常，在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的復(fù)制缺陷型病毒載體的基因組缺少至少一個(gè)對(duì)于病毒在侵染細(xì)胞中復(fù)制必需的區(qū)域。這些區(qū)域可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)(全部或部分)除去，使之沒有功能。這些技術(shù)包括全部去除，置換(用其它序列，特別是通過插入核酸)，部分刪除或在必需區(qū)域內(nèi)(對(duì)于復(fù)制)添加一個(gè)或多個(gè)堿基。這樣的技術(shù)可在體外(在分離的DNA上)或原位通過遺傳操作技術(shù)或通過誘突變劑處理實(shí)施。
優(yōu)選地，復(fù)制缺陷型病毒保留其對(duì)于病毒顆粒殼體化必需的基因組序列。
逆轉(zhuǎn)錄病毒是侵染分裂細(xì)胞的整合病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒包括兩個(gè)LTR，殼體化序列和三個(gè)編碼區(qū)(gag，pol和env)。已有描述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建特別見EP453242，EP178220，Bernstein等，基因工程7(1985)235；McCormick，生物技術(shù)3(1985)689等。在重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，gag、pol和env基因通常被全部或部分刪除并以異源的目的核酸序列取代。這些載體可從不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒如MoMuLV(“鼠類莫洛尼白血病毒”)；MSV(“鼠類莫洛尼肉瘤病毒”)，HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾臟壞死病毒”)；RSV(“勞氏肉瘤病毒”)和弗羅德病毒構(gòu)建。
通常，為了構(gòu)建含有編碼根據(jù)發(fā)明所述的LLG的序列的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，構(gòu)建含有LTR、殼體化序列和編碼序列的質(zhì)粒。將此構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，此細(xì)胞系能反式提供質(zhì)粒缺乏的逆轉(zhuǎn)錄病毒功能。通常，包裝細(xì)胞系能表達(dá)gag，pol和env基因。這樣的包裝細(xì)胞系，特別是細(xì)胞系PA317(美國(guó)4,861,719)；PsiCRIP細(xì)胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12細(xì)胞系(WO89/07150)在現(xiàn)有技術(shù)中有描述。另外，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可在LTR處修飾以抑制轉(zhuǎn)錄活性和大量的殼體化序列，其中殼體化序列可能包含gag基因的一部分(Bender等，病素學(xué)雜志61(1987)1639)。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化。
腺伴隨病毒(AAV)是相當(dāng)小的DNA病毒，它可以穩(wěn)定和位點(diǎn)特異的方式整合到它們所侵染的細(xì)胞基因組中。它們?cè)诓徽T導(dǎo)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)或分化的任何影響的情況下，能侵染廣譜細(xì)胞，沒有發(fā)現(xiàn)它們參與人的病理學(xué)。AAV基因組已被克隆，測(cè)序和鑒定。它包含約4700堿基并在每一末端含作為病毒復(fù)制起點(diǎn)的145個(gè)堿基的末端反向重復(fù)(ITR)區(qū)域，?；蚪M的剩余部分分為兩個(gè)帶有殼體化功能的基本區(qū)域基因組的左邊部分，包含參與病毒復(fù)制和病毒基因表達(dá)的rep基因；基因組的右邊部分，包含編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
已有描述使用來自AAV的載體體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因(見WO91/18088；WO93/09239；美國(guó)4,797,368，美國(guó)5,139,941，EP488,528)。這些公開文獻(xiàn)描述了其中rep和/或cap基因被刪除并被目的基因取代的各種AAV衍生的構(gòu)建體及這些構(gòu)建體用于體外(轉(zhuǎn)入培養(yǎng)細(xì)胞)或體內(nèi)(直接轉(zhuǎn)入生物體)轉(zhuǎn)移目的基因的用途。通過將含有兩側(cè)與兩個(gè)AAV末端反向重復(fù)(ITR)區(qū)域相連的目的基因的質(zhì)粒和帶有AAV殼體化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入用人輔助病毒(如腺病毒)侵染的細(xì)胞系中可以制備根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)制缺陷重組AAV。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化制備的AAV重組體。因此，本發(fā)明也涉及其基因組包含兩側(cè)與AAV ITR相連的編碼LLG多肽的序列的AAV衍生的重組病毒。本發(fā)明也涉及包含兩側(cè)與來自AAV的兩個(gè)ITR相連的編碼LLG多肽的序列的質(zhì)粒。這樣的質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)移LLG序列，如果合適，此質(zhì)?？蓳饺胫|(zhì)體載體(假病毒)中。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，載體是腺病毒載體。
腺病毒是真核DNA病毒，經(jīng)修飾后有效地將本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移入多種細(xì)胞類型中。
存在腺病毒的各種血清型。在這些血清型中，在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)先使用2型或5型(Ad2或Ad5)人或動(dòng)物來源的腺病毒(見WO94/26914)。在本發(fā)明范圍內(nèi)，可以使用的動(dòng)物包括犬、牛、鼠(例如MavI，Beard等，病毒學(xué)75(1990)81)、羊、豬、鳥和猴(例如SAV)來源的腺病毒。優(yōu)選地，動(dòng)物來源的腺病毒是犬腺病毒，更優(yōu)選地，是CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-80))。
優(yōu)選地，本發(fā)明的復(fù)制缺陷腺病毒載體包含ITR，殼體化序列和目的核酸。更優(yōu)選地，至少腺病毒載體的E1區(qū)是無功能的。E1區(qū)的刪除優(yōu)選地從Ad5腺病毒序列的455位核苷酸延伸至3329位核苷酸。其它區(qū)域也可修飾，特別是E3區(qū)(WO95/02697)、E2區(qū)(WO94/28938)、E4區(qū)(WO94/28152，WO94/12649和WO95/02697)或在晚期基因L1-L5中的任一基因內(nèi)。缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在WO95/02697中公開。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1和E4區(qū)有缺失。在另一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)有缺失，其中插入了E4區(qū)域和編碼LLG的序列(見FR94 13355)。
根據(jù)本發(fā)明所述的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體可以用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備(Levrero等，基因101(1991)195，EP185573；Graham EMBO J.3(1984)2917)。特別地，它們可通過腺病毒和尤其是攜帶目的DNA序列的質(zhì)粒間的同源重組制備。將該腺病毒和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞系中后，實(shí)現(xiàn)同源重組。優(yōu)選地，所采用的細(xì)胞系應(yīng)該(i)可被所述元件轉(zhuǎn)化的，并且(ii)優(yōu)選地以整合形式包含能夠補(bǔ)充復(fù)制缺陷型腺病毒基因組部分的序列以避免重組的危險(xiǎn)?？蛇x用的細(xì)胞系的例子是包含整合到其基因組內(nèi)的Ad5腺病毒基因組左側(cè)部分(12％)的人胚腎細(xì)胞系293(Graham等，普通病毒學(xué)雜志36(1977)59)以及如申請(qǐng)WO94/26914和WO95/02697中所述的能補(bǔ)充E1和E4功能的細(xì)胞系。用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可回收并純化重組腺病毒。
使用反義核酸對(duì)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控可在翻譯或轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明優(yōu)選的反義核酸是能特異地與編碼LLG的核酸或相應(yīng)的信使RNA的全部或部分雜交的核酸片段。這些反義核酸可以是選擇性修飾以改進(jìn)其穩(wěn)定性和選擇性的合成寡核苷酸。它們也可以是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生與LLG mRNA的全部或部分互補(bǔ)的RNA的DNA序列。如EP140308中所述的，可通過反向表達(dá)選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO7或SEQ ID NO11的序列的全部或部分來制備反義核酸。只要能負(fù)調(diào)節(jié)或阻斷LLG的表達(dá)，反義序列的任何長(zhǎng)度對(duì)本發(fā)明的實(shí)施都是適合的。優(yōu)選地，此反義序列至少長(zhǎng)20個(gè)核苷酸。反義核酸的制備和應(yīng)用，編碼反義RNA的DNA以及寡和遺傳反義的應(yīng)用公布于WO92/15680，其內(nèi)容在此引用作為參考。
D)抗體本發(fā)明提供針對(duì)LLG多肽的抗體。這些抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明包括嵌合的、單鏈的和人源化的抗體以及Fab片段和Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。
如實(shí)施例4A所述，可以針對(duì)LLG多肽的抗原性片段制備多克隆抗體。也可針對(duì)完整LLG蛋白或多肽，或針對(duì)此蛋白或多肽片段、衍生物或表位制備抗體。用本領(lǐng)域已知的技術(shù)和方法給動(dòng)物施用此蛋白、多肽、片段、衍生物或表位后可得到抗體。
用Mishell，B.B等，細(xì)胞免疫學(xué)精選方法(W.H.Freeman編輯)San Francisco(1980)描述的方法，可制備單克隆抗體。簡(jiǎn)而言之，用本發(fā)明的多肽免疫Balb/C小鼠脾細(xì)胞。使免疫后的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。通過在殺死兩種親本細(xì)胞但允許融合產(chǎn)物存活和生長(zhǎng)的HAT培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)篩選含脾和骨髓瘤細(xì)胞特征的融合細(xì)胞。
本發(fā)明的單克隆抗體可以是“人源化的”以防止宿主產(chǎn)生對(duì)抗體的免疫反應(yīng)?！叭嗽椿贵w”是其中補(bǔ)體決定區(qū)(CDR)和/或輕鏈和/或重鏈可變區(qū)構(gòu)架的其它部分源自非人免疫球蛋白而分子的剩余部分則來自一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白的抗體。人源化抗體也包括特征為人源化重鏈與供體或受體未經(jīng)修飾的輕鏈或嵌合輕鏈結(jié)合的抗體，反過來亦可?？贵w的人源化可用本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)(見如G.E.Mark和E.A.Padlan，“第4章單克隆抗體的人源化”，實(shí)驗(yàn)藥學(xué)手冊(cè)，第113卷，Springer-Verlag，New York，1994)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用于表達(dá)人源化抗體。
可以調(diào)整本領(lǐng)域熟知的用于制備單鏈抗體的技術(shù)以制備針對(duì)本發(fā)明的免疫原性多肽和蛋白的單鏈抗體。
抗LLG抗體在檢測(cè)或定量分析LLG水平的實(shí)驗(yàn)中有用。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些實(shí)驗(yàn)提供各種疾病狀況中LLG臨床診斷和評(píng)估及監(jiān)測(cè)治療效率的方法。
E)篩選興奮劑或拮抗物的方法本發(fā)明提供從小分子文庫(kù)或天然產(chǎn)物來源篩選LLGXL活性的興奮劑(增強(qiáng)子或輔激活物，包括蛋白性輔激活物)或拮抗物(抑制劑)的方法。使可能的興奮劑或拮抗物與LLGXL蛋白和LLGXL的底物接觸，測(cè)定可能的興奮劑或拮抗物增強(qiáng)或抑制LLGXL活性的能力。
在此方法中使用的LLGXL蛋白可在各種宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如實(shí)施例7中所示)、桿狀病毒侵柒的昆蟲細(xì)胞、酵母和細(xì)菌中得到制備。LLG在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的表達(dá)可通過細(xì)胞的氨甲喋呤擴(kuò)增得到優(yōu)化。LLGXL蛋白也可從天然來源如人血漿，胎盤提取物或培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞、THP-1細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中純化得到。
實(shí)驗(yàn)參數(shù)包括pH、離子濃度、溫度、底物濃度和乳化條件的最優(yōu)化由本領(lǐng)域具有普通技術(shù)的人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定。
底物的脂肪酸取代基在鏈長(zhǎng)、不飽和的程度和位置方面可以不同。這些底物可在幾個(gè)位置的任何一個(gè)放射性標(biāo)記。磷脂底物如磷脂酰膽堿可在例如Sn-1或Sn-2脂肪酸位置或在甘油、磷酸或極性頭部基因(磷脂酰膽堿中的膽堿)放射性標(biāo)記。
作為放射性標(biāo)記底物的替代方法，其它種類的標(biāo)記底物如熒光底物或含硫底物也可用于篩選方法。
熒光底物在篩選實(shí)驗(yàn)中特別有效，因?yàn)槊复呋饔每稍诓粚a(chǎn)物與底物物理分開(提取)時(shí)通過測(cè)量熒光強(qiáng)度來連續(xù)測(cè)定。熒光磷脂酰膽堿底物的一個(gè)例子是C6NBD-PC{1-?；?2-[6-(硝基-2，1，3-苯并二唑-2-酰)氨基]己酰基磷脂酰膽堿}。
含硫底物包括1，2-二(己酰硫代)-1，2-雙脫氧-sn-甘油-3-磷酸膽堿(L.J.Reynolds，W.N.Washburm，R.A.Deems和E.A.Dennis，1991，酶學(xué)方法，1973-23；L.Yu和E.A.Dennis，1991，酶學(xué)方法19765-75；L.A.Wittenauer，K.Shirai，R.L.Jackson和J.D.Johnson，1984，生物化學(xué)和生物物理研究通訊118894-901)。
F)磷脂酰膽堿酯的水解本發(fā)明提供例如用于工業(yè)或食物加工或洗衣去污劑的酶促水解磷脂酰膽堿酯的方法。本發(fā)明的多肽可用于水解溶液中的磷脂酰膽堿酯；或?qū)⒋嗣附Y(jié)合在固體支持物上，然后使之與底物接觸。此方法可用于制備溶血磷脂和自由脂肪酸。
G)組合物本發(fā)明提供生物學(xué)上相容的(生物相容的)溶液中的包含本發(fā)明的多肽、核酸、載體和抗體的組合物。生物學(xué)上相容的溶液是本發(fā)明的多肽、核酸、載體或抗體在其中保持活性形式，例如以能夠?qū)崿F(xiàn)生物學(xué)活性的形式的溶液。例如，本發(fā)明的多肽將具磷脂酶活性，核酸將能夠復(fù)制，翻譯信息或與互補(bǔ)核酸雜交；載體將能轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞；抗體將與本發(fā)明的多肽結(jié)合。通常，這樣的生物學(xué)上相容的溶液通常是包含鹽離子的水性緩沖液如Tris、磷酸或HEPES緩沖液。通常鹽離子的濃度與生理學(xué)水平相似。在具體實(shí)施方案中，生物相容溶液是藥學(xué)上可接受的組合物。生物學(xué)上相容的液體可包括穩(wěn)定劑和防腐劑。
可配制這樣的組合物以通過體表、口腔、非腸道、鼻內(nèi)、皮下和眼內(nèi)途徑給藥。非腸道給藥包括靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注射或灌注技術(shù)。組合物可以包含標(biāo)準(zhǔn)的眾所周知無毒的生理上可接受的載體、佐劑和介質(zhì)的劑量單位制劑通過非腸道途徑用藥。
優(yōu)選的無菌注射性制劑可以是無毒的非腸道途徑可接受的溶劑或稀釋液中的溶液或懸浮液。藥學(xué)上可接受的載體的例子是鹽水，緩沖鹽水，等滲鹽水(如磷酸一鈉或二鈉，氯化鈉，氯化鉀，氯化鈣或氯化鎂；或這些鹽的混合物)，林格溶液，葡萄糖，水，無菌水，甘油，乙醇及它們的組合。1，3-丁二醇和無菌的穩(wěn)定的油是使用方便的溶劑或懸浮介質(zhì)。包括合成的單或二甘油酯在內(nèi)的任何穩(wěn)定的油都可使用。諸如油酸的脂肪酸也可用于制備可注射的制劑。
組合物介質(zhì)可以是從任何生物相容的或無細(xì)胞毒性的(同源或異源)多聚體制備而來的水凝膠，如可作為藥物吸收海綿的親水性聚丙烯酸多聚體。例如，這樣的多聚體在申請(qǐng)WO93/08845中得以描述，其全部?jī)?nèi)容在此引用作為參考。它們中的某一些，例如特別是從乙烯和/或氧化丙烯得到的那些可從商品途徑得到。水凝膠可直接例如在手術(shù)干預(yù)時(shí)置于受治療組織的表面。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案涉及包含復(fù)制缺陷型重組病毒和聚羥亞烴的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明涉及包含含有編碼LLG多肽的核酸的復(fù)制缺陷型重組病毒和聚羥亞烴的組合物。優(yōu)選的聚羥亞烴是聚羥亞烴407，它可商業(yè)購(gòu)買(BASF，Parsippany，NJ)并且是無毒的生物相容的多元醇，是最優(yōu)選的。浸漬了重組病毒的聚羥亞烴可直接例如在手術(shù)干預(yù)時(shí)放在受治療組織的表面。盡管粘性較低，聚羥亞烴基本上具有與水凝膠相同的優(yōu)點(diǎn)。
H)治療方法本發(fā)明提供治療方法，包括給人或其它動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的組合物。
有效量隨年齡、要治療病情的類型和嚴(yán)重性、體重、治療的時(shí)間長(zhǎng)短、給藥方法和其它參數(shù)變動(dòng)。有效量由內(nèi)科醫(yī)生或其它有資格的醫(yī)務(wù)專家決定。
根據(jù)本發(fā)明所述的多肽通常以每天每千克體重約0.01mg至約100mg，優(yōu)選地約0.1mg至約50mg，更優(yōu)選地約1mg至約10mg的劑量用藥。
根據(jù)本發(fā)明所述的重組病毒通常以約104至約1014pfu的劑量配制并給藥。就AAV和腺病毒而言，優(yōu)選采用約106至約1011pfu的劑量。術(shù)語pfu(“噬斑形成單位”)對(duì)應(yīng)于病毒體懸浮液的侵染力，通過感染適當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物并測(cè)定噬斑形成的數(shù)目來測(cè)定?，F(xiàn)有技術(shù)中記錄了測(cè)定病毒溶液pfu滴度的技術(shù)。
本發(fā)明提供治療由LLG多肽活性過量、異?；虿怀浞直磉_(dá)導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療具有由LLG多肽活性異常高表達(dá)或不充分表達(dá)導(dǎo)致的不合乎要求的脂類分布型的人或其它動(dòng)物的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療由LIG多肽活性異常高表達(dá)或未充分表達(dá)導(dǎo)致的糖尿病、高脂血癥、肝內(nèi)膽汁郁積或其它代謝紊亂的方法。
1)與LLG多肽表達(dá)升高相關(guān)的不合乎要求的脂類分布型的治療降低LLG多肽的表達(dá)以糾正其中LLG多肽活性起作用的與不合乎要求的脂類分布型相關(guān)的疾病或紊亂的病情的方法包括并不限于施用包含反義核酸的組合物，施用包含諸如抗體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白的組合物，施用包含LLGN多肽或LLG其它片段的組合物和施用包含編碼LLGN多肽或LLG其它片段的核酸的組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包含反義核酸的組合物用于負(fù)調(diào)節(jié)或阻斷LLG的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此核酸編碼反義RNA分子。在此實(shí)施方案中，此核酸與使此核酸序列表達(dá)的信號(hào)可調(diào)控地連接并優(yōu)選地利用重組載體構(gòu)建體將其入細(xì)胞，載體一旦導(dǎo)入細(xì)胞，將表達(dá)反義核酸。合適的載體包括質(zhì)粒，腺病毒，腺伴隨病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒。優(yōu)選地，此載體是腺病毒。最優(yōu)選地，此載體是包含病毒E1和/或E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒。
在另一實(shí)施方案中，編碼能選擇性與LLG相互作用的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白的核酸序列的表達(dá)使LLG的表達(dá)受到負(fù)調(diào)控或阻斷。WO94/29446和WO94/02610公開了用編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白的基因進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，其內(nèi)容在此引用作為參考。細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白包括任何能在其表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)選擇性地與LLG相互作用或結(jié)合并中和被結(jié)合的LLG功能的蛋白。優(yōu)選地，此細(xì)胞結(jié)合蛋白是抗體或抗體的片段。更優(yōu)選地，此細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白是單鏈抗體。
WO94/02610公開了抗體的制備和編碼特定抗體的核酸的鑒定。通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的技術(shù)，用LLG或其片段制備特異的單克隆抗體。制備隨后包含編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白或其部分的核酸并能在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體以用于本發(fā)明的方法。
選擇性地，通過將中和抗體施用于循環(huán)系統(tǒng)可以阻斷LLG活性。此中和抗體可直接以蛋白施用或由載體表達(dá)(帶有分泌信號(hào))。
在另一實(shí)施方案中，通過施用包含LLGN多肽或LLG其它片段的組合物來抑制LLGXL活性。此組合物可以方便的方式施用，如通過口腔，體表，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑。此組合物可直接施用或包入膠囊(如在脂類系統(tǒng)內(nèi)，在氨基酸序列微球體內(nèi)或在球狀dendrimer內(nèi))。在某些情況下，多肽可以結(jié)合到另一多聚體如血清白蛋白或聚乙烯吡咯烷酮上。
在另一實(shí)施方案中，通過使用小分子量化合物來抑制LLGXL活性，此小分子量化合物阻礙其酶學(xué)特性或阻止其細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的正確識(shí)別。
在另一實(shí)施方案中，通過基因治療的應(yīng)用，也就是說，通過施用含有編碼和指導(dǎo)LLGN多肽或LLG另一片段表達(dá)的核酸的組合物來抑制LLGXL活性。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的LLG基因也對(duì)肝素有親和性。LLG多肽與血管腔內(nèi)的胞外肝素結(jié)合使LLG與LDL結(jié)合并作用為L(zhǎng)DL和胞外肝素的橋梁加速LDL的攝入。據(jù)推測(cè)在動(dòng)脈粥樣硬化損害的局部區(qū)域，脂酶活性水平的升高加速致動(dòng)脈粥樣化進(jìn)程(Zilversmit，D.B.(1995)臨床化學(xué)41，153-158；Zambon，A.，Torres，A.，Bijvoet，S.，Gagne，C.，Moojani，S.，Lupien，P.J.，Hayden M.R.和Brunzell，J.D.(1993)Lancet 341，1119-1121)。這可能是由于脂酶介導(dǎo)的血管組織對(duì)脂蛋白的結(jié)合和攝入增加(Eisenberg，S.，Sehayek，E.，Olivecrona，T.Vlodavsky，I.(1992)臨床研究雜志90，2013-2021；Tabas，I.，Li，I.，BrociaR.W.，Xu，S.W.，WwensonT.L，Williams K.J.(1993)生物化學(xué)雜志268，20419-20432；Nordestgaard，B.G.和Nielsen，A.G.(1994)現(xiàn)代脂類評(píng)論5，252-257；Williams，K.J.和Tabas，I.(1995)Art.Thromb.and Vasc，Biol.15，551-561。另外，脂酶活性水平的局部升高可導(dǎo)致在動(dòng)脈粥樣硬化損害前體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞毒性水平的脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿。這種特定的LLG活性可能在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的發(fā)展中起作用，特別是在由于飲食或遺傳因素受治療者體內(nèi)脂類水平過量的情況下。因此，本發(fā)明可通過抑制LLG多肽的表達(dá)或與脂蛋白(如LDL)的結(jié)合抑制脂蛋白的積累。
2)與LLG多肽不足相關(guān)的不合乎要求的脂類分布型的治療提高LLG的表達(dá)以糾正其中LLG多肽活性起作用的與不合乎要求的脂類分布型相關(guān)的疾病或紊亂的病情的方法包括但不限于施用包含LLGXL多肽的組合物和施用包含編碼LLGXL多肽的核酸的組合物。
在另一實(shí)施方案中，通過施用包含LLGXL多肽的組合物以提高LLGXL活性水平。此組合物可以方便的方式施用，如通過口腔，體表，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑。此組合物可直接使用或包入膠囊(如在脂類系統(tǒng)內(nèi)，在氨基酸微球體內(nèi)或在球狀dendrimer中)。在某些情況下，多肽可以結(jié)合到另一多聚體，如血清白蛋白或聚乙烯吡咯烷酮上。
在另一實(shí)施方案中，通過使用小分子量化合物來提高LLGXL的水平，此小分子量化合物能夠在轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后水平正調(diào)控LLGXL表達(dá)。
在另一實(shí)施方案中，通過基因治療的應(yīng)用，也就是說，通過施用含有編碼和指導(dǎo)LLGXL多肽表達(dá)的核酸的組合物來提高LLGXL的水平。
肝內(nèi)膽汁郁積的特征可以是血清膽固醇和磷脂水平的升高。最近有所描述，毒傘素藥物誘導(dǎo)的大鼠肝內(nèi)膽汁郁積模型表現(xiàn)血清膽固醇和磷脂水平的明顯升高(Ishizaki，K.，Kinbara，S.，Miyazawa，N.，Takeuchi，Y.，Hirabayash，N.，Kasai，H.和Araki，T.(1997)，Toxicol.Letters 90，29-34)。本發(fā)明的產(chǎn)物可用以治療具有增加的血清膽固醇和/或磷脂的肝內(nèi)膽汁郁積病人。另外，此大鼠模型也表現(xiàn)膽汁膽固醇分泌率的嚴(yán)重降低。
肝內(nèi)膽汁郁積也以膽汁從肝臟流出的削弱為特征。最近，漸進(jìn)性家族性肝內(nèi)膽汁郁積(PFIC或Byler病)和良性復(fù)發(fā)性肝內(nèi)膽汁郁積(BRIC)的基因座定位于18q21-q22(分別是Carlton，V.E.H.，Knisely，A.S.和Freimer，N.B.(1995)人分子遺傳學(xué)，4，1049-1053和Houwen，R.H.，Baharloo，S.，Blankenship，K.，Raymaeker，P.，Juyn，J.，Sandkuijl，L.A.和Freimer，N.B.(1994)，自然遺傳學(xué)8，380-386)。因?yàn)長(zhǎng)LG基因定位于染色體區(qū)18q21，本發(fā)明的LLG基因或產(chǎn)物可用于治療患由PFIC/BRIC病基因的突變或缺陷型表達(dá)引起的肝內(nèi)膽汁郁積的病人。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的LLG基因或多肽產(chǎn)物可用于治療患不是由18q21-q22處的PFIC/BRIC病基因的缺陷引起的肝內(nèi)膽汁郁積的病人。最近研究表明另外一個(gè)位于18q21-q22區(qū)之外基因座也可產(chǎn)生PFIC表型(Strantnieks，S.S.，Kagalwalla，A.F.，Tanner，M.S.，Gardiner，R.M.和Thompson，R.J.(1996)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志33，833-836)。然而，直接或通過基因治療施用LLG多肽可緩和這種形式的病情。
在基因治療中，將編碼多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸及控制其表達(dá)的調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)移至人或其它動(dòng)物的靶細(xì)胞中。此轉(zhuǎn)移離體進(jìn)行，方法是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將核酸轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，然后將修飾后的細(xì)胞施用于人或其它動(dòng)物的方法；或在體內(nèi)進(jìn)行，方法是將核酸直接轉(zhuǎn)移到人或其它動(dòng)物內(nèi)的細(xì)胞中。核酸轉(zhuǎn)移可用上述的病毒或非病毒載體實(shí)現(xiàn)。
可用本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)移非病毒載體，包括磷酸鈣共沉淀、脂轉(zhuǎn)染(合成的陰離子和陽(yáng)離子脂質(zhì)體)、受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，裸DNA注射，電穿孔和生物彈或顆粒加速作用。
實(shí)施例下文的實(shí)施例解釋了本發(fā)明。這些實(shí)施例只是解釋性的，不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1差異表達(dá)cDNA的鑒定A)RNA制備將人單核THP-1細(xì)胞(Smith，P.K.，Krohn，R.I.，Hermanson，G.T.，Mallia，A.K.，Gartner，F(xiàn).H.Provenzano，M.D.，F(xiàn)ujimoto，E.K，Goeke，N.M.，Olson，B.J.和Klenk，D.C.(1985)生物化學(xué)年鑒150，76-85)培養(yǎng)于含25mM HEPES，10％胎牛血清，100單位/ml青霉素G鈉鹽和100單位/ml硫酸鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)中。將細(xì)胞以1.5×107細(xì)胞/平板接種于15cm組織培養(yǎng)皿上并以40ng/ml的12-豆蔻酸13-乙酸佛波脂(sigma)處理48小時(shí)以誘導(dǎo)細(xì)胞分化。人低密度脂蛋白(LDL)購(gòu)自Calbiochem并于4℃對(duì)著PBS徹底透析。然后將LDL稀釋至500μg/ml并于37℃對(duì)著含5μM CuSO4的PBS透析16小時(shí)。為終止氧化作用，將LDL對(duì)著150mM NaCl，0.3mMEDTA徹底透析，然后過濾除菌。蛋白濃度用BCA方法測(cè)定(Schuh，J.Fairclough，G.F.，和Haschemeyer，R.H.(1978)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)75，3173-317)(Pierce)。氧化程序通過TBARS測(cè)定(chomczynski，P.(1993)生物技術(shù)15，532-537)為25-30hmol MDA當(dāng)量/mg蛋白。使分化的THP-1細(xì)胞與含10％脂蛋白缺失的胎牛血清(sigma)的RPMI培養(yǎng)基中的50μg/ml氧化的LDL或NaCl-EDTA緩沖液接觸24小時(shí)。為收獲RNA，用10ml PBS洗平板，然后向每個(gè)平板加14ml TRIZOL(Liang，P.和Pardee，A.B.(1992)科學(xué)257，967-971)(GIBCO)。吹打溶液幾次以混勻，然后將樣品收集至離心管中，并向每個(gè)平板加3ml氯仿并混勻。將此離心管于12000xg離心15分鐘。離心后將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，每平板加7.5ml異丙醇并混勻。將此離心管于12000xg離心20分鐘，以冰冷的70％乙醇洗滌沉淀并室溫干燥。將沉淀懸于500μl TE(Tris-EDTA)中并以200單位的無RNase的DNAseI和200單位RNA酶抑制劑胎盤RNase抑制劑(Promega)于37℃處理30分鐘。通過依次以酚、酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)和氯仿/異戊醇(24∶1)抽提RNA，然后用乙醇沉淀來純化RNA。
B)cDNA合成用差異顯示試劑盒，版本1.0(DisplaySystems Biotechnology，Inc)的方法進(jìn)行cDNA合成和PCR擴(kuò)增。此系統(tǒng)基于由Liang和Pardee(Mead，D.A.，Pey，N.K，，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.和Smith，L.M.(1991)生物/技術(shù)9，657-663)最初描述的技術(shù)。產(chǎn)生包含脂酶樣基因最初信息的cDNA片段的引物對(duì)是下游引物7和上游引物15。使用來自與緩沖液或氧化的LDL接觸的PMA處理的THP-1細(xì)胞的RNA，按下述方法合成用于擴(kuò)增的cDNA將3μl 25μM的下游引物7和7.5μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水加到300ng(3.0μl)來自任一THP-1 RNA樣品的RNA中。70℃加熱10分鐘然后在冰上冷卻。向管中加入3μl 5×PCR緩沖液(250mM Tris-HCl pH8.3，375mMKCl(GIBCO)，3μl 25mM MgCl2，3μl 0.1M DTT，1.2μl 500μM dNTPs，0.7μl RNasin和5.6μl DEPC處理的水。將此管在室溫下溫育2分鐘，然后加入1.5μl(300單位)SuperscriptII RNase H反轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO)。此管依次在室溫下溫育2分鐘，37℃溫育60分鐘，95℃溫度5分鐘，然后在冰上冷卻。使用含有117μl 10×PCR緩沖液(500mMKCl，100mM Tris-HCl pH8.3，15mM MgCl2和0.01％(重量/體積)白明膠)，70.2μl 25mM MgCl2，5.9μl α-32P dATP(10mCi/ml；DuPontNEN)，4.7μl 500μM dNTP混合物，11μl Ampli Taq DNA聚合酶(5單位/μl，Perkin-Elmer)和493.3μl DEPC處理水的母混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)每一反應(yīng)，將12μl母混合物加入到2μl下游引物#7，1μl cDNA和5μl上游引物#15中。反應(yīng)混合物于94℃加熱1分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)94℃變性15秒，40℃退火1分鐘，72℃延伸30秒的熱循環(huán)。40個(gè)循環(huán)后，將反應(yīng)于72℃溫育5分鐘并保存于10℃。PCR反應(yīng)在Perkin-Elmer GeneAmp System 9600熱循環(huán)儀中進(jìn)行。
將4μl擴(kuò)增反應(yīng)物與等體積的加樣緩沖液(0.2％溴酚藍(lán)，0.2％二甲苯腈藍(lán)，10mM EDTA pH8.0和20％甘油)混和。使4μl混合物于1200伏(恒壓)在6％非變性丙烯酰胺測(cè)序凝膠上電泳3個(gè)小時(shí)。凝膠于80℃干燥1.5小時(shí)并對(duì)Kodak XAR膜曝光。只有在含有來自與氧化LDL接觸的THP-1細(xì)胞的cDNA的反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物并將它從凝膠上下。將100μl DEPC處理的水加入含切下的凝膠片段的離心管中，室溫溫育30分鐘，然后95℃溫育15分鐘。
為了再擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，將26.5μl洗脫DNA用于含5μl 10×PCR緩沖液，3μl 25mM MgCl2，5μl 500μM dNTPs，5μl 2μM下游引物7，7.5μl上游引物15和0.5μl Amplitaq聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)液中。PCR循環(huán)參數(shù)和儀器如上所述。擴(kuò)增后，在瓊脂糖凝膠上分析20μl再擴(kuò)增產(chǎn)物，取4μl用于以TA克隆系統(tǒng)將PGR產(chǎn)物亞克隆入載體pCRII(Frohmar，M.A.，Dush，M.K.和Martin，G.R.(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)85，8998-9002)(Invitrogen)。14℃連接過夜后，連接產(chǎn)物用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑選得到的轉(zhuǎn)化子，3ml過夜培養(yǎng)物用于質(zhì)粒的小量制備。用EcoRI消化質(zhì)粒鑒定插入大小，用熒光染料終止試劑(Prism，Applied Biosystems)和Applied System，Biosystems373DNA測(cè)序儀對(duì)含有合適大小原初PCR產(chǎn)物插入片段的克隆進(jìn)行測(cè)序。PCR產(chǎn)物的序列示于圖2。在擴(kuò)增引物序列下劃線。
C)5’RACE反應(yīng)用5’RACE系統(tǒng)通過RF-PCR實(shí)現(xiàn)鑒定的cDNA的延伸(Loh，E.Y.，Eliot，J.F.，Cwirla，S.，Lanier，L.L.和Davis，M.M.(1989)科學(xué)243，217-219；Simms，D.，Guan，N.和Sitaraman，K.(1991)焦點(diǎn)13，997)(GIBCO)。最初用于差異顯示反應(yīng)的1mg THP-1RNA(經(jīng)氧化的LDL處理的)用于5’RACE方法。
1μl(1μg)RNA與3μl(3pmol)引物2a和11μl DEPC水混合并于70℃加熱10分鐘，然后在冰上放置1分鐘。加入2.5μl 10×反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl pH8.4，500mM KCl)，3μl 25mM MgCl2，1μl 10mM dNTP混合物和2.5μl 0.1M DTT。將混合物于42℃溫育2分鐘，然后加入1μl Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)物繼續(xù)在42℃再溫育30分鐘，70℃溫育15分鐘，冰上放1分鐘。加入1μl RnaseH(2單位)，混合物于55℃溫育10分鐘。用試劑盒中的GlassMax柱純化cDNA(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，Plainview，NY)。以50μl dH2O從柱中洗脫cDNA，冷凍干燥并重新懸浮于21μldH2O中。按下列反應(yīng)進(jìn)行cDNA加尾將7.5μl dH2O，2.5μl反應(yīng)緩沖液(200mM Tris-HCl pH8.4，500mM KCl)，1.5μl 25mM Mgcl2，2.5μl 2mM dCTP和10μl cDNA在94℃溫育3分鐘，然后冰浴1分鐘。加入1μl(10單位)末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶并將混合物于37℃溫育10分鐘。70℃溫育10分鐘熱滅活酶。cDNA的PCR擴(kuò)增按下列步驟進(jìn)行將5μl加尾的cDNA加入含有5μl 10×PCR緩沖液(500mM KCl，100mMTris-KCl pH8.3，15mM MgCl2和0.01％(重量/體積)白明膠)，1μl10mM dNTP混合物，2μl(10pmol)錨定引物，1μl(20pmol)引物3a和35μl dH2O的反應(yīng)液中。反應(yīng)液于95℃加熱1分鐘，然后加入0.9μl(4.5單位)Ampoitaq聚合酶。反應(yīng)按下列條件循環(huán)40次94℃5秒，50℃20秒，72℃30秒。將1μl此反應(yīng)物用于巢式再擴(kuò)增以提高特異產(chǎn)物的水平，便于隨后分離。再擴(kuò)增反應(yīng)包括1μl最初擴(kuò)增物，5μl 10×PCR緩沖液，1μl 10mM dNTP混合物，2μl(20pmol)通用擴(kuò)增引物，2μl(20pmol)引物4a和38μl dH2O。將反應(yīng)物于95℃加熱1分鐘，然后加入0.7μl(3.5單位)Amplitaq聚合酶。反應(yīng)按下列條件循環(huán)40次94℃5秒，50℃20秒，72℃30秒。用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測(cè)到約1.2kb的主要產(chǎn)物。將2μl反應(yīng)產(chǎn)物克隆入TA克隆盒中的PCRII載體中并于14℃溫育過夜。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。EcoRI消化以確定所得轉(zhuǎn)化子中插入片段的大小。用熒光染料終止試劑(Prism，Applied Biosystems)和AppliedSystem Biosystems 373 DNA測(cè)序儀對(duì)含有適當(dāng)大小PCR產(chǎn)物插入片段的克隆進(jìn)行測(cè)序。包含來自TA載體的EcoRI位點(diǎn)的RACE產(chǎn)物的序列示于圖3。在擴(kuò)增引物(通用引物和與5’RACE引物4a互補(bǔ)的)序列下劃線。
實(shí)施例2 LLGXL基因的克隆和染色體定位A)cDNA文庫(kù)篩選人胎盤cDNA文庫(kù)(寡脫氧胸苷酸和隨機(jī)引物的，目錄號(hào)#5014b，目錄號(hào)#52033)來自Clontech(Palo，Alto，CA)。通過切割上述的含5’RACE反應(yīng)PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒的插入片段產(chǎn)生放射性標(biāo)記的探針。用隨機(jī)引物技術(shù)對(duì)探針進(jìn)行放射性標(biāo)記DNA片段(50-100ng)與1ng隨機(jī)六聚體(Gibco)于95℃溫育10分鐘，然后冰上作用1分鐘。室溫下加入3μl 10×Klenow緩沖液(100mM Tris-HCl pH7.5，50mM MgCl2，57mM二硫蘇糖醇；New England Biolabs)，3μl 0.5mM dATP，dGT，dTTP，100μCiα-32P dCTP(3000Ci/mmol，New England Nuclear)和1μl DNA聚合酶I的Klenow片段(5單位，Gibco)。反應(yīng)物于室溫溫育2-3小時(shí)，通過用TE(pH8.0)將體積增加至100μl并加入終濃度為1mM的EDTA來終止反應(yīng)。將反應(yīng)體積增加至100μl并使其通過G-50離心柱(Boehringer Mannheim)來除去未摻入的核苷酸。所得探針的比活大于5×108cpm/ugDNA。
用已建立的方法探測(cè)文庫(kù)(Walter，P.，Gilmore，R.和Blobel，G.(1984)細(xì)胞38，5-8)。簡(jiǎn)而言之，濾膜在4.8×SSPE(20×SSPE＝3.6M NaCl，0.2M NaH2PO4，0.02M EDTA，pH7.7)，20mM Tris-HClpH7.6，1×Denhardt’s溶液(100×＝2％ ficoll 400，2％聚丙烯吡咯烷酮，2％BSA)，10％葡聚糖硫酸，0.1％SDS，100μg/ml鮭精DNA和1×106cpm/ml放射性探針中于65℃雜交24小時(shí)。然后在室溫下以2×SSC(1×SSC＝150mM NaCl，15mM檸蒙酸pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)洗膜3次，每次15分鐘，然后以0.5×SSC，0.1％SDS于65℃洗3次，每次15分鐘。與探針雜交的噬菌體被分離和擴(kuò)增。用LambdaSorb試劑(Promega)根據(jù)廠商說明從擴(kuò)增的噬菌體純化DNA。用EeoRI消化以從噬菌體DNA切下插入片段。將插入片段亞克隆入質(zhì)粒載體(Bluescript.II SK，Strotagene)的EcoRI位點(diǎn)。按上述的自動(dòng)測(cè)序測(cè)定cDNA的2.6kb EcoRI片段內(nèi)所含的開放閱讀框架序列。序列示于圖4。推測(cè)的由此開放閱讀框架編碼的蛋白的氨基酸序列示于圖5并命名為L(zhǎng)LGXL。據(jù)推測(cè)，第一個(gè)蛋氨酸由252-254位核苷酸對(duì)編碼。推測(cè)的蛋白長(zhǎng)500個(gè)氨基酸。前18個(gè)氨基酸形成分泌信號(hào)肽特有的序列(Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1988)基因73，237-244)。據(jù)預(yù)測(cè)，前肽的分子量為56,800道爾頓。假定信號(hào)肽的切割在第18位，未經(jīng)修飾的成熟多肽的分子量為54,724道爾頓。
這個(gè)蛋白和其它已知的三酰甘油脂酶家族成員的總相似性列于圖6和表1.在圖6所示的序列匹配中，LLG是由實(shí)施例1所述的cDNA(SEQID NO5)編碼的多肽(SEQ ID NO6)，此后稱為L(zhǎng)LGN。此蛋白與LLGXL蛋白的氨基端345個(gè)殘基相同。9個(gè)特有殘基后是終止密碼子，產(chǎn)生39.3kD的前肽和37.3kD的成熟蛋白。對(duì)LLGN和LLGXL共同的序列是核酸序列SEQ ID NO9和氨基酸序列SEQ ID NO10。
有趣地是，從其它脂酶結(jié)構(gòu)區(qū)域得知，LLGN和LLGXL蛋白不同的位置在蛋白的氨基端結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域。所以，LLGN蛋白看來只由三酰甘油脂酶兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之一組成。此序列在167-171位包含特征性“GXSXG”脂酶基序并包含Ser169，Asp193和His274位催化三聯(lián)體殘基的保守性。在其它脂酶中參與二硫鍵的半胱氨酸殘基(位置64，77，252，272，297，308，311，316，463和483)的保守性表明LLGXL與其它酶有結(jié)構(gòu)相似性。有5個(gè)推測(cè)的N糖基化位點(diǎn)在氨基酸位置80，136，393，469和491處。用于比較的蛋白序列是人脂蛋白脂酶(LPL；Genbank登記號(hào)#M 15856，SEQ ID NO13)，人肝脂肪酶(HL；Genbank登記號(hào)#J03540，SEQ ID NO14)，人胰脂肪酶(PL；Genbank，登記號(hào)#M93285，SEQ ID NO15)，人胰脂肪酶相關(guān)蛋白-1(PLRP-1；Genbank登記號(hào)#M93283)和人胰脂肪酶相關(guān)蛋白-2(PLRP-2；Genbank登記號(hào)#M93284)。
表1三酰甘油脂酶基因家族的相似性
用Lasergene Biocemputing Software Suite(Dnastar)的Megalign程序中的Clustal算法根據(jù)兩兩序列對(duì)比計(jì)算相似性百分?jǐn)?shù)(Camps，L.，Reina，M.，Llobera，M.，Vilaro.，S.和Olivecrona，T.(1990)美國(guó)生理學(xué)雜志258，C673-C681)。
B)染色體定位來自含有基因組LLG DNA的P1克隆的DNA通過缺口翻譯用地高辛UTP標(biāo)記(Sternberg，N.，Ruether，J.和DeRiel，K.新生物學(xué)家2151-62，1990)。標(biāo)記的探針與剪切的人DNA混合并在含50％甲酰胺，10％葡聚糖硫酸和2×SSC的溶液中與來自雄性供體的經(jīng)PHA刺激的外周血淋巴細(xì)胞雜交。通過在熒光素化的抗地高辛抗體中培養(yǎng)雜交細(xì)胞，然后用DAPI復(fù)染后來檢測(cè)特異雜交信號(hào)。最初的實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致E群染色體的特異性標(biāo)記，根據(jù)DAPI染色認(rèn)為是18號(hào)染色體。
進(jìn)行第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中生物素標(biāo)記的18號(hào)染色體著絲粒特異的探針與LLG探針共雜交。這個(gè)實(shí)驗(yàn)使18號(hào)染色體著絲粒的特異標(biāo)記成紅色而18號(hào)染色體長(zhǎng)臂成綠色。測(cè)量11個(gè)特異標(biāo)記的雜交的18號(hào)染色體表明LLG的Flter為0.67(Fankle測(cè)量為0.38)，對(duì)應(yīng)于帶18q21。幾種遺傳性疾病包括肝內(nèi)膽汁郁積，視椎營(yíng)養(yǎng)不良(cone roddystrophy)和家族性擴(kuò)張性骨質(zhì)溶解被認(rèn)為涉及此染色體區(qū)域的缺陷。
實(shí)施例3LLG RNA分析A)LLG RNA在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)通過THP-1 RNA的Northern分析進(jìn)行cDNA來源的mRNA的分析。按上述方法制備了這些細(xì)胞的RNA。通過利用多聚脫氧胸苷酸磁珠系統(tǒng)，從總RNA純化mRNA(polyattract system，Promega)。3mg含多聚腺苷酸化mRNA在1％瓊脂糖-甲醛凝膠上電泳。凝膠在dH2O中洗30分鐘。用堿性轉(zhuǎn)移緩沖液(3M NaCl，8mM NaOH，2mM肌氨酰)將RNA真空轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。轉(zhuǎn)移后，印跡在200mM磷酸緩沖液pH6.8中溫育5分鐘中和。用紫外交聯(lián)儀(Stratagene)使RNA與膜交聯(lián)。
通過從上述包含5’RACE反應(yīng)PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒中切下插入片段制備探針。按實(shí)施例2中所述用隨機(jī)引物技術(shù)放射性標(biāo)記探針。
濾膜在QuikHyb快速雜交溶液(Stratagene)中于65℃預(yù)雜交30分鐘。在加到QuikHyb中的濾膜之前，放射性標(biāo)記的探針(1-2×106cpm/ml)和超聲處理的鮭精DNA(終濃度100μg/ml)在95℃加熱10分鐘變性并在冰上迅速冷卻。雜交于65℃進(jìn)行3小時(shí)。室溫下用2×SSC，0.1％十二烷基磺酸鈉洗膜兩次各15分鐘，然后在62℃用0.1×SSC，0.1％SDS洗兩次15分鐘以除去未雜交的探針。洗滌后，使膜簡(jiǎn)單干燥，然后用增感屏于-80℃對(duì)Kodak XAR-2膠片曝光。結(jié)果示于圖7，表示約4.5kb的主要mRNA。也存在少量4.3kb和1.6kb的片段。LLGNcDNA的預(yù)期大小為1.6kb。此LLGXL序列可能是由主要mRNA編碼。
B)LLG RNA在各種人組織中的表達(dá)商品化制備好的包含3μg每種來自人組織(心臟，腦，胎盤，肺，肝，骨骼肌，腎和胰臟)的mRNA的濾膜購(gòu)自Clontech(目錄號(hào)#7760-1)。按上述方法探測(cè)和處理濾膜。以放射性標(biāo)記的LLG片段探測(cè)和放射自顯影后，通過在6 5℃溫箱內(nèi)在煮沸的0.1×SSC，0.1％SDS洗2次中15分鐘以除去探針。然后用編碼人脂蛋白脂酶的1.4kb DNA片段探測(cè)此膜。此片段通過用圖1描述的5’LPL和3’LPL引物對(duì)THP-1 RNA(PMA和oxLDL處理過的)進(jìn)行RT-PCR得到RT-PCR條件如上所述。放射自顯影后，再次選膜并用人β肌動(dòng)蛋白cDNA的放射性標(biāo)記的片段再次探測(cè)以使RNA含量標(biāo)準(zhǔn)化。這些分析的結(jié)果示于圖8。在胎盤RNA中探測(cè)到最高水平的LLG信息，來自肺、肝臟和腎組織的RNA中發(fā)現(xiàn)的水平較低。與其他人過去的研究(Verhoeven，A.J.M.，Jansen，H.(1994)Biochem.Biophys.Acta 1211，121-124)一致，脂蛋白脂酶信息在多種組織中發(fā)現(xiàn)，心臟和骨骼肌組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)的水平最高。分析的結(jié)果表明LLG表達(dá)的組織分布與LPL有很大不同。如其他人所報(bào)道的(Wang，C.S.和Hartsuck；J.A.(1993)Biochem.Biophys Acta.1166，1-19；Semenkovich；C.F.，Chen，S.-W.，Wims，M.，Luo C.-C.，Li，W.-H.和Chan，L.(1989)脂類研究雜志30，423-431；Adams，M.D.，Kerlavage，A.R.，F(xiàn)ields，C.和Venter，C.(1993)自然遺傳學(xué)4，256-265)，LLG表達(dá)模式與肝脂肪酶或胰脂肪酶不同。
為測(cè)定其它人組織中的表達(dá)模式，用LLGXL cDNA探測(cè)另一商品化的膜。此點(diǎn)印跡(人RNA Master Blot，Clontech目錄號(hào)#7770-1)包含50個(gè)不同組織的100-500ng mRNA并且已用相當(dāng)?shù)墓芗一虮磉_(dá)標(biāo)準(zhǔn)化(chen，L.和Morin，R.(1971)Biochim.Biophys.Acta231，194-197)。根據(jù)廠商說明，用隨機(jī)寡核苷酸引物系統(tǒng)(Prime ItII，Stratagene)將LLGXL cDNA的1.6kb DraI-SrfI片段用32PdCTP標(biāo)記。在65℃預(yù)雜交30分鐘后，將探針以1.3×106cpm/ml加入QuikHyb雜交液。雜交于65℃進(jìn)行2小時(shí)。通過室溫下用2×SSC，0.1％十二烷基磺酸鈉洗膜兩次各15分鐘，然后在62℃用0.1×SSC，0.1％SDS洗兩次各15分鐘以除去未雜交的探針。洗滌后，使膜簡(jiǎn)單干燥，然后在-80℃用增感屏對(duì)Kodak XAR-2膠片曝光不同時(shí)間。用光密度測(cè)定法對(duì)所得圖象定量。結(jié)果示于表2。多種組織Northern和多種組織點(diǎn)印跡代表的組織相對(duì)表達(dá)水平相似，胎盤內(nèi)最高，肺、肝臟和腎臟中更低。胎的肝、腎和肺與成年組織的表達(dá)水平大致相同。令人驚奇地是，甲狀腺組織表達(dá)水平是所有表示的組織中最高的，其表達(dá)是胎盤組織中的122％。盡管胎盤中脂酶表達(dá)有優(yōu)先(Rothwell，J.E.，Elphick，M.C.(1982)發(fā)育生理學(xué)雜志4，153-159；Verhoeren，A.J.M.，Carling D.和Jansen H.(1994)脂類研究雜志35 966-975；Burton，B.K.Mueller，H.W.(1980)Biochim.Biophys Acta 618，449-460)，但以前不知道甲狀腺表達(dá)任何脂酶。結(jié)果表明LLG的表達(dá)可能參與胎盤的維持，其中LLG可能起從諸如磷脂的底物釋放自由脂肪酸作為能源的作用。胸腺中表達(dá)LLG可能為該腺體合成生物活性分子提供前體。
表2.LLG mRNA在各種人組織中的表達(dá)
給出的數(shù)值是表達(dá)百分?jǐn)?shù)，任意地將胎盤組織的水平定為100％。數(shù)值是兩個(gè)放射自顯影片密度測(cè)定的平均值。ND＝未檢測(cè)到。
C)LLGRNA在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)來自Clonetics。HUVEC在加有3mg/ml牛腦提取物的商品化制備好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM，Clonetics)中繁殖(Maciag，T.，Cerundolo，J.，Iisley，S.，Kelley，P.R.和Forand，R.(1979)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)76，5674-5678)，而HCAEC則在加有3mg/ml牛腦提取物和3％胎牛血清(終濃度5％)的EGM中繁殖。細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿，將培養(yǎng)基換成不含牛腦提取物的培養(yǎng)基。通過加入100ng/ml佛波酯豆蔻酸(sigma)刺激培養(yǎng)物。溫育24小時(shí)后，用前述的Trizol法提取細(xì)胞的RNA。將20mg總RNA電泳分離并轉(zhuǎn)至膜上用于分析。按前述方法用LLG和LPL探測(cè)膜。結(jié)果示于圖9。來自用PMA刺激的THP-1細(xì)胞的20mg總RNA在印跡上泳動(dòng)用于比較。在未經(jīng)刺激和PMA刺激的HUVEC細(xì)胞中檢測(cè)到與LLG探針雜交的RNA。相反，只有在經(jīng)PMA刺激后的HCAEC培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)水平的LLG mRNA。與他人過去的研究一致，在任何內(nèi)皮RNA中都沒有檢測(cè)到可檢測(cè)水平的脂蛋白脂酶mRNA(Verhoeven，A.J.M.，Jansen，H.(1994) Biochem. Biophys Acta 121，121-124)。
實(shí)施例4LLG蛋白分析A)抗體制備針對(duì)具有相當(dāng)于推測(cè)的LLG cDNA開放讀碼框架編碼的蛋白區(qū)域的序列的肽制備抗血清。選擇此肽是因?yàn)槠漕A(yù)測(cè)的抗原性指數(shù)高(Jameson B.A.和Wolf，H.(1988)生物科學(xué)中的計(jì)算機(jī)應(yīng)用4，181-186)。免疫肽的序列未在基因庫(kù)數(shù)據(jù)中的任何蛋白或翻譯的DNA序列中發(fā)現(xiàn)。其在LLG蛋白中的對(duì)應(yīng)位置在圖10中表示。此肽羧基端的半胱氨酸不與LLG推測(cè)蛋白的殘基一致，它的引入是為了有助于與載體蛋白偶聯(lián)。此肽在Applied Biosystems Model433A肽合成儀上合成。按照Imject Activated Immunogen Conjugation試劑盒(Piercechemical)中所包含的方法，將2mg肽偶聯(lián)到2mg順丁烯二酰亞胺活化的匙孔血藍(lán)蛋白上。脫鹽后，偶聯(lián)物的一半與等體積的完全弗氏佐劑(Pierce)乳化。將此乳化物注射入新西蘭白兔。首次接種后4周，用精確按前述但使用不完全弗氏佐劑(Pierce)制備的乳化物加強(qiáng)接種。加強(qiáng)接種后2周，制備待測(cè)血樣并用固定肽通過ELISA測(cè)定特異性抗體的滴度。首次加強(qiáng)后1個(gè)月進(jìn)行再次加強(qiáng)免疫。
B)對(duì)來自內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的Western分析按照實(shí)施例3C所述培養(yǎng)并用PMA刺激HCEAC細(xì)胞，但用PMA刺激細(xì)胞48小時(shí)。條件培養(yǎng)基(9ml)樣品與500μl磷酸緩沖鹽水(PBS，150mM氯化鈉，100mM磷酸鈉，pH7.2)中的50％肝素-Sepharose CL-6B懸浮液一起溫育。因?yàn)橐谚b定LLGXL序列中殘基的保守性對(duì)LPL肝素結(jié)合活性至關(guān)重要，所以選用肝素-Sepharose部分純化和濃縮LLG蛋白(Ma，Y.，Henderson，H.E.，Liu，M.-S.，Zhang，H.Forsythe，I.J.Clarke-Lewis，I.，Hayden，M.R.和Brunzell，J.D.脂類研究雜志35，2049-2059；圖6)。在4℃搖動(dòng)1小時(shí)后，將樣品在150×g離心5分鐘。吸去培養(yǎng)基并用14ml PBS洗Sepharose。離心并吸去上清后，將沉淀的肝素-Sepharose懸浮于200μl 2×SDS加樣緩沖液(4％SDS，20％甘油，2％β-琉基乙醇，0.002％溴酚藍(lán)和120mM Tris pH6.8)中。樣品于95℃加熱5分鐘，其中40μl加樣于10％Tris-甘氨酸SDS凝膠上。以140V電泳約90分鐘后，通過Novex電印跡儀(210V，1小時(shí))將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在封閉液(5％脫脂干奶粉，0.1％Tween 20，150mM氯化鈉，25mM Tris pH7.2)中封閉膜30分鐘?？闺目寡搴驼Ｍ醚逵梅忾]液1∶5000稀釋并與膜一起在4℃輕微搖動(dòng)溫育過夜。然后用TBST(0.1％Tween20，150mM氯化鈉，25mM Tris pH7.2)洗膜4次，每次15分鐘。羊抗兔過氧化物酶偶聯(lián)的抗體用封閉液1∶5000稀釋并與膜一起搖動(dòng)溫育1小時(shí)。如上所述洗膜，并使膜與Renaissance化學(xué)發(fā)光試劑(DuPont，NEN)反應(yīng)并對(duì)Kodak XAR-2膠片曝光。結(jié)果示于圖11。未經(jīng)刺激的HUVEC和HCAEC細(xì)胞樣品中存在兩種免疫反應(yīng)蛋白。未經(jīng)刺激的HCAEC樣品中免疫反應(yīng)蛋白的水平比相應(yīng)的HUVEC樣品低得多。一旦用PMA刺激，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物分泌三種免疫反應(yīng)蛋白。PMA處理大大提高HCAEC培養(yǎng)物產(chǎn)生的LLG蛋白的水平。PMA誘導(dǎo)LLG蛋白在HUVEC培養(yǎng)物中沒有這么明顯。
實(shí)施例5重組LLG蛋白的產(chǎn)生A)LLG表達(dá)構(gòu)建體將編碼LLGN和LLGXL蛋白的cDNA克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCDNA3(Invitrogen)。此載體可通過使用巨細(xì)胞病毒主要晚期啟動(dòng)子在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因。將LLGN 5’RACE產(chǎn)物克隆入pCDNA3的EcoRI位點(diǎn)。用DraI和SrfI消化LLGXL cDNA以產(chǎn)生1.55kbcDNA(見圖4)。載體以限制酶EcoRV消化，并用快速連接試劑盒(Boehringer Mannheim)中的T4DNA連接酶和試劑根據(jù)廠商說明連接載體和插入片段。將此連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。通過限制性分析和測(cè)序檢測(cè)表達(dá)載體中插入片段的存在和方向以篩選所得克隆。
B)LLG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞用Lipofectamine陽(yáng)離子脂試劑(GIBCO)將LLG表達(dá)載體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將COS-7細(xì)胞以2×105細(xì)胞/平板的密度接種于60mm組織培養(yǎng)平板上。細(xì)胞在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；GIBCO)中繁殖。將1mg質(zhì)粒DNA加入300μl Optimem I無血清培養(yǎng)基(Gibco)中。將10μl Lipofectamine試劑稀釋到300μl OptimemI培養(yǎng)基中并與DNA溶液混合，使之在室溫下靜置30分鐘。移去平板中的培養(yǎng)基并用2ml Optimem培養(yǎng)基洗細(xì)胞。DNA-Lipofectamine溶液與2.7ml Optimem培養(yǎng)基一起加入平板并將平板于37℃溫育5小時(shí)。溫育后，除去無血清培養(yǎng)基并換上補(bǔ)加2％FBS和抗生素的DMEM。轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，某些培養(yǎng)物用0.25mM PefablocSC(Boehringer Mannheim)、蛋白酶抑制劑或10U/ml肝素處理。收獲前30分鐘，再用40U/ml肝素處理已用肝素處理過的樣品。轉(zhuǎn)染后60小時(shí)從細(xì)胞移去培養(yǎng)基。將肝素-Sepharose CL-4B(200μl PBS中的50％懸浮液，pH7.2)加到1ml培養(yǎng)基中并于4℃混合1小時(shí)。Sepharose通過低速離心沉淀并用1ml冷PBS洗3次。沉淀Sepharose并將其懸浮于100μl 2×加樣緩沖液中。將樣品于95℃加熱5分鐘。將40μl樣品加樣到10％SDS-PAGE凝膠上。按上述方法進(jìn)行電泳及使用抗LLG抗血清的Western分析。結(jié)果示于圖12。包含來自HCAEC條件培養(yǎng)基的蛋白作為大小參照。LLGN遷移在約40kD位置，與HCAEC最低條帶一致。來自用LLGXL cDNA轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)基中包含68kD和40kD兩種帶。當(dāng)用肝素處理這些細(xì)胞時(shí)，從培養(yǎng)基回收的68kD和40kD蛋白的量明顯增加。當(dāng)用蛋白酶抑制劑Pefabloc處理細(xì)胞時(shí)，相對(duì)于40kD蛋白，68kD蛋白的量有所增加。這表明這些細(xì)胞產(chǎn)生的低分子量蛋白是較大的68kD形式的水解產(chǎn)物。經(jīng)差異顯示鑒定的編碼短的40kD蛋白的mRNA的作用未知。然而，已有報(bào)道明顯地以組織特異方式表達(dá)并會(huì)產(chǎn)生截短的蛋白的肝脂肪酶的交替剪接形式。
實(shí)施例6動(dòng)物物種中的LLGA)LLG兔同源物的克隆將商業(yè)購(gòu)買的兔肺組織的λcDNA文庫(kù)(clontech，目錄號(hào)#TL1010b)用于分離LLG基因兔同源物的片段。將5μl原文庫(kù)加到45μl水中并于95℃加熱10分鐘。將下列物質(zhì)加到終體積100μl∶200μM dNTPs，20mM Tris-HCl pH8.4，50mM KCl，1.5mM MgCl2，引物DLIP774和LLGgen2a各100μM和2.5U Taq聚合酶(GIBCO)。反應(yīng)按以下參數(shù)熱循環(huán)35次94℃15秒，50℃20秒，72℃30秒。通過瓊脂糖凝膠電泳分析10μl反應(yīng)物。檢測(cè)到約300堿基對(duì)的產(chǎn)物。用TA克隆系統(tǒng)將4μl反應(yīng)混合物用于克隆產(chǎn)物。對(duì)所得克隆的插入片段進(jìn)行測(cè)序(SEQ ID NO11)。推測(cè)的兔氨基酸序列(SEQ ID NO12)和相應(yīng)的人cDNA序列之間的對(duì)比在圖14中表示。非兩個(gè)擴(kuò)增引物部分的核苷酸中，兔和人LLG序列有85.8％的相同性。推測(cè)的兔cDNA編碼的蛋白與人的這個(gè)蛋白有94.6％的相同性，大多數(shù)的核苷酸替換在密碼子的第三位或“搖擺”位置。值得注意的是，此區(qū)域跨越推測(cè)的LLG蛋白的“蓋”序列并且是脂酶基因家族的可變區(qū)。這也是這個(gè)基因在種之間有高度保守性的證據(jù)。
B)其它種中的LLG為證明其它種存在LLG基因，用EcoRI限制性消化各種物種的基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離并印跡到硝酸纖維素膜上。
在含有6×SSC，10％葡聚糖硫酸，5×Dendardt溶液，1％SDS和5μg/ml鮭精DNA的雜交液中，用2.5×106cpm/ml隨機(jī)引物標(biāo)記的32P-LLG或32P-LPL(脂蛋白脂酶)探針與膜在65℃雜交過夜。用0.1×SSC，0.5％SDS在室溫下洗膜10分鐘，然后依次在40℃，50℃和55℃洗10分鐘。印跡的放射自顯影示于圖16。
圖16表明LLG和LPL基因存在于受檢的所有種中，只有LLG探針對(duì)大鼠DNA中沒有觀察到雜交。大鼠中的例外結(jié)果可能是由含有LLG序列的反常大小的限制性片段人為引起的。這些的片段可能在瓊脂糖凝膠電泳的分離范圍之外或者可能是無效轉(zhuǎn)印。由兩種探針檢測(cè)到的不同條帶表明LPL和LLG是分開的進(jìn)化上保守的基因。
實(shí)施例7LLGXL的酶活性A)磷脂酶活性分析瞬時(shí)表達(dá)人脂蛋白脂酶(LPL)、LLGN或LLGXL的COS-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的磷脂酶活性。含10％FBS的MEM(MEM)用作空白，而反義LLGXL質(zhì)粒(AS)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照。
磷脂酰膽堿(PC)乳濁液是用10μl磷脂酰膽堿(10mM)，40μl在sn1和2位標(biāo)記的14C-磷脂酰膽堿、二棕櫚酰(2μCi)和100μl Tris-TCNB[100mM Tris，1％Triton，5mM CaCl2，200mM NaCl，0.1％BSA)配制的。使此乳濁液蒸發(fā)10分鐘，使其在Tris-TCNB中的終體積為1ml。
反應(yīng)物以雙份進(jìn)行，包含50μl PC乳濁液和950μl培養(yǎng)基。樣品在搖動(dòng)的37℃水浴中溫育2-4小時(shí)。加入1ml 1N HCl終止反應(yīng)，然后用4ml2-丙醇∶己烷(1∶1)抽提。使上部1.8ml己烷層通過硅凝膠柱，對(duì)含于流過組分中的釋放出的無14C的脂肪酸在閃爍計(jì)數(shù)器內(nèi)進(jìn)行定量。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖14中表示。
B)三酰甘油脂酶活性分析瞬時(shí)表達(dá)人脂蛋白脂酶(LPL)、LLGN或LLGXL的COS-7的條件培養(yǎng)基的三酰甘油脂酶活性。含10％FBS的MEM用作空白，而反義LLGXL質(zhì)粒(AS)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照。
將濃縮的底物制成無水的含標(biāo)記的[9，10-3H(N)]三酰甘油脂和未標(biāo)記三酰甘油脂的乳劑(最終總?cè)８视椭?50mg，6.25×108cpm)，通過加入100％甘油中的9mg卵磷脂使之穩(wěn)定。將0.56ml3H-三油酸甘油酯(0.28mCi)與0.17ml未標(biāo)記的三油酸甘油酯和90μl卵磷脂(9mg)混和。此混合物在氮流下?lián)]發(fā)。干燥的脂類混合物通過超聲在2.5ml 100％甘油中乳化(30秒脈沖水平2然后2秒冷卻循環(huán)進(jìn)行5分鐘)。
通過將1體積濃縮底物用4體積含3％(重量/體積)無脂肪酸牛血清白蛋白的0.2M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)稀釋制備實(shí)驗(yàn)底物。將稀釋的底物劇烈振蕩5秒。
反應(yīng)以雙份進(jìn)行，在總體積0.2ml中含0.1ml實(shí)驗(yàn)底物和0.1ml所述的條件培養(yǎng)基。反應(yīng)物于37℃溫育90分鐘。通過加3.25ml甲醇-氯仿-己烷(1.41∶1.25∶1，體積/體積/體積)后再加1.05ml 0.1M碳酸-硼酸鉀緩沖液(pH10.5)終止反應(yīng)。劇烈振蕩15秒后，樣品在1000rpm離心5分鐘。在閃爍計(jì)數(shù)儀中對(duì)1.0ml上面水相的樣品計(jì)數(shù)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖15。
實(shí)施例8使用LLG多肽篩選興奮劑或拮抗物重組LLG在桿狀病毒侵染的昆蟲細(xì)胞中合成。在肝素-Sepharose上層析，然后在陽(yáng)性離子交換樹脂上層析從含血清或無血清培養(yǎng)基純化重組LLG。如果需要，在純化LLG中使用第三個(gè)層析步驟如分子篩。在純化過程中，用抗肽抗體監(jiān)測(cè)LLG蛋白，磷脂酶實(shí)驗(yàn)用于跟蹤LLG活性。
在熒光實(shí)驗(yàn)中，最終實(shí)驗(yàn)條件為約10mM Tris-HCl(pH7.4)，100mM KCl，2mM CaCl2；5μM C6NBD-PC{1-?；?2-(硝基-2，1，3，-苯并二唑-4-酰)氨基]己?；字Ｄ憠A}和LLG蛋白(約1-100ng)。反應(yīng)物用于470nm處熒光激發(fā)，通過540nm處熒光發(fā)射的測(cè)定連續(xù)監(jiān)測(cè)酶活性。以二甲基亞砜中10-200mM溶液的形式，加入刺激和/或抑制LLG活性的待測(cè)化合物和/或底物。刺激或抑制LLG活性的化合物以540nm處熒光發(fā)射的增強(qiáng)或降低來鑒定。
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，最終實(shí)驗(yàn)條件是約25mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，100mM CaCl2，4.24mM Triton X-100，0.5mM 1，2，-雙(己酰硫代)-1，2-雙脫氧-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿，5mM 4，4’-二硫吡啶(來自乙醇中的50mM貯存液)和1-100mg重組LLG。通過測(cè)定342nm處吸收值的升高確定磷脂酶活性。以二甲基亞砜中10-200mM溶液的形式加入刺激和/或抑制LLG活性的待測(cè)化合物和/或底物。刺激或抑制LLG活性的化合物以342nm處吸收的升高或降低來鑒定。
實(shí)施例9表達(dá)人LLG的轉(zhuǎn)基因小鼠為進(jìn)一步研究LLG的生理作用，制備了表達(dá)人LLG的轉(zhuǎn)基因小鼠。
將編碼LLGXL的1.53kb DraI/SrfI限制性片段(見圖4)克隆入質(zhì)粒載體(pHMG)普遍表達(dá)的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG CoA)還原酶基因啟動(dòng)子的下游。用標(biāo)準(zhǔn)方法制備表達(dá)不同水平的人LLGXL的轉(zhuǎn)基因小鼠(見如G.L.Tromp等，基因1565199-205，1995)。使用轉(zhuǎn)基因小鼠測(cè)定LLGXL過量表達(dá)對(duì)脂類分布型、血管病理學(xué)、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的速度和嚴(yán)重性及其它生理學(xué)參數(shù)的影響。
實(shí)施例10LLG在動(dòng)脈粥樣硬化組織中的表達(dá)通過用從4個(gè)患動(dòng)脈粥樣硬化病人的血管活組織檢查材料分離的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來檢測(cè)動(dòng)粥樣硬化中LLGXL的表達(dá)。組織樣品來自主動(dòng)脈壁(1個(gè)樣品)，髂動(dòng)脈(2個(gè)樣品)和頸動(dòng)脈(1個(gè)樣品)。
動(dòng)脈粥樣硬化活組織檢查材料來自Gloucestershire Royal醫(yī)院，英國(guó)，制備多聚腺苷酸化mRNA并以0.5μg/μl mRNA濃度重新懸浮于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中。根據(jù)GibcoBRL用于第一鏈cDNA合成的Superscript Preamplification System方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)。簡(jiǎn)而言之，cDNA的合成如下進(jìn)行將2μl每一種mRNA加入1μlOligo(dT)12-18引物和9μl DEPC水中。此管在70℃溫育10分鐘并在冰上放置1分鐘。向每一管中加入下列成分2μl 10×PCR緩沖液，2μl 25mM MgCl2，1μl 10mM dNTP混合物和2μl 0.1M DTT。42℃5分鐘后，加入1μl(200單位)SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶。溫和地混合反應(yīng)物，然后于42℃溫育50分鐘。通過于70℃溫育15分鐘終止反應(yīng)，然后置于冰上。向每管中加入1μl RHase H并在37℃溫育20分鐘以破壞殘存的mRNA。
用2μl cDNA反應(yīng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。向每一管中加入下列物質(zhì)5μl 10×PCR緩沖液，5μl 2mM dNTPs，1μl hllg-gspl引物(20pmol/ml，見圖1)，1μl hllg-gsp2a引物(20pmol/ml，見圖1)，1.5μl 50mM MgCl2，0.5μl Taq聚合酶(5U/ml)和34μl水。反應(yīng)物在95℃放置2分鐘后，按下列條件進(jìn)行PCR的30個(gè)循環(huán)94℃15秒，52℃20秒，72℃30秒。在用瓊脂糖凝膠電泳分析前，將完成的反應(yīng)物在72℃放置10分鐘。hllp-gsp引物是LLG特異的并產(chǎn)生300bp的預(yù)期產(chǎn)物。在平行PCR中，使用對(duì)管家基因G3PDH(人甘油醛3-磷酸脫氫酶)特異的引物(每種1μl，20pmol/ml)以表明cDNA合成反應(yīng)是成功的。
G3PDH引物(見圖1)在4個(gè)血管活組織檢查材料中產(chǎn)生了983堿基對(duì)的預(yù)期產(chǎn)物。在4個(gè)樣品中的3個(gè)中檢測(cè)到了LLG表達(dá)，頸動(dòng)脈樣品中未檢測(cè)到表達(dá)。
此處討論的所有參考文獻(xiàn)引用作為參考。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解，本發(fā)明很好地適合于實(shí)現(xiàn)目的并取得所述的和其中固有的結(jié)果和益處。此處所述的肽、多聚核苷酸、方法、過程和技術(shù)是作為優(yōu)選實(shí)施方案的代表提出的，預(yù)期作為例證而不是作為本發(fā)明范圍的限制。其中的變化及其它應(yīng)用會(huì)被本領(lǐng)域技術(shù)人員想到，它們包含在本發(fā)明的精神或由本發(fā)明附加的權(quán)利要求書限定的范圍之內(nèi)。
序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人Jaye，Michel C.
Doan，Kim-Anh TKrawiec，John A.
Lynch，Kevin J.
South，Victoria J.
(ii)發(fā)明名稱人脂酶樣基因編碼的多肽及利用它的組合物和方法(iii)序列數(shù)31(iv)聯(lián)系地址(A)名稱Rhone-Poulenc Rorer Inc.
(B)街道500 Arcola Rd.3C43(C)城市Collegeville(D)州名PA(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編號(hào)19426(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)目前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(B)遞交日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)名稱Fehlner Ph.D.，Paul F.
(B)登記號(hào)35,135(C)參考/著錄號(hào)A2582-WO(ix)電信信息(A)電話(610)454-3839(B)傳真(610)454-3808(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度367個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置22..180(xi)序列描述SEQ ID NO1GAATTCGGCT TGATCAATCG C TTC AAA AAG GGG ATC TGT CTG AGC TGC CGC 51Phe Lys Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg1 5 10AAG AAC CGT TGT AAT AGC ATT GGC TAC AAT GCC AAG AAA ATG AGG AAC 99Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn15 20 25AAG AGG AAC AGC AAA ATG TAC CTA AAA ACC CGG GCA GGC ATG CCT TTC 147Lys Arg Asn Ser Lys Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe30 35 40AGA GGT AAC CTT CAG TCC CTG GAG TGT CCC TGA GGAAGGCCCT TAATACCTCC200Arg Gly Asn Leu Gln Ser Leu Glu Cys Pro *45 50TTCTTAATAC CATGCTGCAG AGCAGGGCAC ATCCTAGCCC AGGAGAAGTG GCCAGCACAA260TCCAATCAAA TCGTTGCAAA TCAGATTACA CTGTGCATGT CCTAGGAAAG GGAATCTTTA320CAAAATAAAC AGTGTGGACC CCTCAAAAAA AAAAAAAAGC CGAATTC 367(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度53個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Phe Lys Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser1 5 10 15Ile Gly Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys Met20 25 30Tyr Leu Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg Gly Asn Leu Gln Ser35 40 45Leu Glu Cys Pro *50(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1382個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置312..1370(xi)序列描述SEQ ID NO3GAATTCGGCT TCTACTACTA CTAGGCCACG CGTCGCCTAG TACGGGGGGG GGGGGGGGGG 60TCAGCGAGTC CTTGCCTCCC GGCGGCTCAG GACGAGGGCA GATCTCGTTC TGGGGCAAGC120CGTTGACACT CGCTCCCTGC CACCGCCCGG GCTCCGTGCC GCCAAGTTTT CATTTTCCAC180CTTCTCTGCC TCCAGTCCCC CAGCCCCTGG CCGAGAGAAG GGTCTTACCG GCCGGGATTG240CTGGAAACAC CAAGAGGTGG TTTTTGTTTT TTAAA CTTC TGTTTCTTGG GAGGGGGTGT300GGCGGGGCAG G ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC 350Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu55 60 65
TGC TAT TGC TTT GCT GCG GGG AGC CCC GTA CCT TTT GGT CCA GAG GGA 398Cys Tyr Cys Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly70 75 80CGG CTG GAA GAT AAG CTC CAC AAA CCC AAA GCT ACA CAG ACT GAG GTC 446Arg Leu Glu Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gln Thr Glu Val85 90 95AAA CCA TCT GTG AGG TTT AAC CTC CGC ACC TCC AAG GAC CCA GAG CAT 494Lys Pro Ser Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His100 105 110GAA GGA TGC TAC CTC TCC GTC GGC CAC AGC CAG CCC TTA GAA GAC TGC 542Glu Gly Cys Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gln Pro Leu Glu Asp Cys115 120 125 130AGT TTC AAC ATG ACA GCT AAA ACC TTT TTC ATC ATT CAC GGA TGG ACG 590Ser Phe Asn Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr135 140 145ATG AGC GGT ATC TTT GAA AAC TGG CTG CAC AAA CTC GTG TCA GCC CTG 638Met Ser Gly Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu150 155 160CAC ACA AGA GAG AAA GAC GCC AAT GTA GTT GTG GTT GAC TGG CTC CCC 686His Thr Arg Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro165 170 175CTG GCC CAC CAG CTT TAC ACG GAT GCG GTC AAT AAT ACC AGG GTG GTG 734Leu Ala His Gln Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val180 185 190GGA CAC AGC ATT GCC AGG ATG CTC GAC TGG CTG CAG GAG AAG GAC GAT 782Gly His Ser Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gln Glu Lys Asp Asp195 200 205 210TTT TCT CTC GGG AAT GTC CAC TTG ATC GGC TAC AGC CTC GGA GCG CAC 830Phe Ser Leu Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His215 220 225GTG GCC GGG TAT GCA GGC AAC TTC GTG AAA GGA ACG GTG GGC CGA ATC 878Val Ala Gly Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile230 235 240ACA GGT TTG GAT CCT GCC GGG CCC ATG TTT GAA GGG GCC GAC ATC CAC 926Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His245 250 255AAG AGG CTC TCT CCG GAC GAT GCA GAT TTT GTG GAT GTC CTC CAC ACC 974Lys Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr260 265 270TAC ACG CGT TCC TTC GGC TTG AGC ATT GGT ATT CAG ATG CCT GTG GGC 1022Tyr Thr Arg Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gln Met Pro Val Gly275 280 285 290
CAC ATT GAC ATC TAC CCC AAT GGG GGT GAC TTC CAG CCA GGC TGT GGA 1070His Ile Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gln Pro Gly Cys Gly295 300 305CTC AAC GAT GTC TTG GGA TCA ATT GCA TAT GGA ACA ATC ACA GAG GTG 1118Leu Asn Asp Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val310 315 320GTA AAA TGT GAG CAT GAG CGA GCC GTC CAC CTC TTT GTT GAC TCT CTG 1166Val Lys Cys Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu325 330 335GTG AAT CAG GAC AAG CCG AGT TTT GCC TTC CAG TGC ACT GAC TCC AAT 1214Val Asn Gln Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn340 345 350CGC TTC AAA AAG GGG ATC TGT CTG AGC TGC CGC AAG AAC CGT TGT AAT 1262Arg Phe Lys Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn355 360 365 370AGC ATT GGC TAC AAT GCC AAG AAA ATG AGG AAC AAG AGG AAC AGC AAA 1310Ser Ile Gly Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys375 380 385ATG TAC CTA AAA ACC CGG GCA GGC ATG CCT TTC AGA GGT AAC CTT CAG 1358Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg Gly Asn Leu Gln390 395 400TCC CTG GAG TGT CAAGCCGAAT TC1382Ser Leu Glu Cys405(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度353個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4
Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys1 5 10 15Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu20 25 30Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gln Thr Glu Val Lys Pro Ser35 40 45Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys50 55 60Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gln Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn65 70 75 80Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly85 90 95Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg100 105 110Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His115 120 125Gln Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser130 135 140Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gln Glu Lys Asp Asp Phe Ser Leu145 150 155 160Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly165 170 175
Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile Thr Gly Leu180 185 190Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His Lys Arg Leu195 200 205Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg210 215 220Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gln Met Pro Val Gly His Ile Asp225 230 235 240Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gln Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp245 250 255Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys260 265 270Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gln275 280 285Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys290 295 300Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly305 310 315 320Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys Met Tyr Leu325 330 335Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg Gly Asn Leu Gln Ser Leu Glu340 345 350Cys
(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1065個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..1065(xi)序列描述SEQ ID NO5ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC TGC TAT TGC 48Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys355 360 365TTT GCT GCG GGG AGC CCC GTA CCT TTT GGT CCA GAG GGA CGG CTG GAA 96Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu370 375 380 385GAT AAG CTC CAC AAA CCC AAA GCT ACA CAG ACT GAG GTC AAA CCA TCT 144Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gln Thr Glu Val Lys Pro Ser390 395 400GTG AGG TTT AAC CTC CGC ACC TCC AAG GAC CCA GAG CAT GAA GGA TGC 192Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys405 410 415TAC CTC TCC GTC GGC CAC AGC CAG CCC TTA GAA GAC TGC AGT TTC AAC 240Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gln Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn420 425 430ATG ACA GCT AAA ACC TTT TTC ATC ATT CAC GGA TGG ACG ATG AGC GGT 288Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly435 440 445ATC TTT GAA AAC TGG CTG CAC AAA CTC GTG TCA GCC CTG CAC ACA AGA 336Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg450 455 460 465GAG AAA GAC GCC AAT GTA GTT GTG GTT GAC TGG CTC CCC CTG GCC CAC 384Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His470 475 480CAG CTT TAC ACG GAT GCG GTC AAT AAT ACC AGG GTG GTG GGA CAC AGC 432Gln Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser
485 490 495ATT GCC AGG ATG CTC GAC TGG CTG CAG GAG AAG GAC GAT TTT TCT CTC 480Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gln Glu Lys Asp Asp Phe Ser Leu500 505 510GGG AAT GTC CAC TTG ATC GGC TAC AGC CTC GGA GCG CAC GTG GCC GGG 528Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly515 520 525TAT GCA GGC AAC TTC GTG AAA GGA ACG GTG GGC CGA ATC ACA GGT TTG 576Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile Thr Gly Leu530 535 540 545GAT CCT GCC GGG CCC ATG TTT GAA GGG GCC GAC ATC CAC AAG AGG CTC 624Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His Lys Arg Leu550 555 560TCT CCG GAC GAT GCA GAT TTT GTG GAT GTC CTC CAC ACC TAC ACG CGT 672Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg565 570 575TCC TTC GGC TTG AGC ATT GGT ATT CAG ATG CCT GTG GGC CAC ATT GAC 720Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gln Met Pro Val Gly His Ile Asp580 585 590ATC TAC CCC AAT GGG GGT GAC TTC CAG CCA GGC TGT GGA CTC AAC GAT 768Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gln Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp595600 605GTC TTG GGA TCA ATT GCA TAT GGA ACA ATC ACA GAG GTG GTA AAA TGT 816Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys610 615 620 625GAG CAT GAG CGA GCC GTC CAC CTC TTT GTT GAC TCT CTG GTG AAT CAG 864Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gln630 635 640GAC AAG CCG AGT TTT GCC TTC CAG TGC ACT GAC TCC AAT CGC TTC AAA 912Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys645 650 655AAG GGG ATC TGT CTG AGC TGC CGC AAG AAC CGT TGT AAT AGC ATT GGC 960Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly660 665 670TAC AAT GCC AAG AAA ATG AGG AAC AAG AGG AAC AGC AAA ATG TAC CTA 1008Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys Met Tyr Leu675 680 685AAA ACC CGG GCA GGC ATG CCT TTC AGA GGT AAC CTT CAG TCC CTG GAG 1056Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg Gly Asn Leu Gln Ser Leu Glu
690 695 700 705TGT CCC TGA 1065Cys Pro *(2)關(guān)于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度355個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys1 5 10 15Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu20 25 30Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gln Thr Glu Val Lys Pro Ser35 40 45Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys50 55 60Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gln Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn65 70 75 80Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly85 90 95Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg100 105 110Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His115 120 125Gln Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser130 135 140Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gln Glu Lys Asp Asp Phe Ser Leu145 150 155 160Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly165 170 175Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile Thr Gly Leu
180 185 190Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His Lys Arg Leu195 200 205Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg210 215 220Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gln Met Pro Val Gly His Ile Asp225 230 235 240Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gln Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp245 250 255Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys260 265 270Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gln275 280 285Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys290 295 300Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly305 310 315 320Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys Met Tyr Leu325 330 335Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg Gly Asn Leu Gln Ser Leu Glu340 345 350Cys Pro *355(2)關(guān)于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2565個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置252..1754(xi)序列描述SEQ ID NO7
GAATTCGCGG CCGCGTCGAC GGCGGCTCAG GACGAGGGCA GATCTCGTTC TGGGGCAAGC 60CGTTGACACT CGCTCCCTGC CACCGCCCGG GCTCCGTGCC GCCAAGTTTT CATTTTCCAC120CTTCTCTGCC TCCAGTCCCC CAGCCCCTGG CCGAGAGAAG GGTCTTACCG GCCGGGATTG180CTGGAAACAC CAAGAGGTGG TTTTTGTTTT TTAAAACTTC TGTTTCTTGG GAGGGGGTGT240GGCGGGGCAG G ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC 290Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu360 365TGC TAT TGC TTT GCT GCG GGG AGC CCC GTA CCT TTT GGT CCA GAG GGA 338Cys Tyr Cys Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly370 375 380CGG CTG GAA GAT AAG CTC CAC AAA CCC AAA GCT ACA CAG ACT GAG GTC 386Arg Leu Glu Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gln Thr Glu Val385 390 395 400AAA CCA TCT GTG AGG TTT AAC CTC CGC ACC TCC AAG GAC CCA GAG CAT 434Lys Pro Ser Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His405 410 415GAA GGA TGC TAC CTC TCC GTC GGC CAC AGC CAG CCC TTA GAA GAC TGC 482Glu Gly Cys Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gln Pro Leu Glu Asp Cys420 425 430AGT TTC AAC ATG ACA GCT AAA ACC TTT TTC ATC ATT CAC GGA TGG ACG 530Ser Phe Asn Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr435 440 445ATG AGC GGT ATC TTT GAA AAC TGG CTGCAC AAA CTC GTG TCA GCC CTG 578Met Ser Gly Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu450 455 460CAC ACA AGA GAG AAA GAC GCC AAT GTA GTT GTG GTT GAC TGG CTC CCC 626His Thr Arg Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro465 470 475 480CTG GCC CAC CAG CTT TAC ACG GAT GCG GTC AAT AAT ACC AGG GTG GTG 674Leu Ala His Gln Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val485 490 495GGA CAC AGC ATT GCC AGG ATG CTC GAC TGG CTG CAG GAG AAG GAC GAT 722Gly His Ser Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gln Glu Lys Asp Asp500 505 510TTT TCT CTC GGG AAT GTC CAC TTG ATC GGC TAC AGC CTC GGA GCG CAC 770Phe Ser Leu Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His515 520 525
GTG GCC GGG TAT GCA GGC AAC TTC GTG AAA GGA ACG GTG GGC CGA ATC 818Val Ala Gly Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile530 535 540ACA GGT TTG GAT CCT GCC GGG CCC ATG TTT GAA GGG GCC GAC ATC CAC 866Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His545 550 555 560AAG AGG CTC TCT CCG GAC GAT GCA GAT TTT GTG GAT GTC CTC CAC ACC 914Lys Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr565 570 575TAC ACG CGT TCC TTC GGC TTG AGC ATT GGT ATT CAG ATG CCT GTG GGC 962Tyr Thr Arg Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gln Met Pro Val Gly580 585 590CAC ATT GAC ATC TAC CCC AAT GGG GGT GAC TTC CAG CCA GGC TGT GGA 1010His Ile Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gln Pro Gly Cys Gly595 600 605CTC AAC GAT GTC TTG GGA TCA ATT GCA TAT GGA ACA ATC ACA GAG GTG 1058Leu Asn Asp Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val610 615 620GTA AAA TGT GAG CAT GAG CGA GCC GTC CAC CTC TTT GTT GAC TCT CTG 1106Val Lys Cys Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu625 630 635 640GTG AAT CAG GAC AAG CCG AGT TTT GCC TTC CAG TGC ACT GAC TCC AAT 1154Val Asn Gln Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn645 650 655CGC TTC AAA AAG GGG ATC TGT CTG AGC TGC CGC AAG AAC CGT TGT AAT 1202Arg Phe Lys Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn660 665 670AGC ATT GGC TAC AAT GCC AAG AAA ATG AGG AAC AAG AGG AAC AGC AAA 1250Ser Ile Gly Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys675 680 685ATG TAC CTA AAA ACC CGG GCA GGC ATG CCT TTC AGA GTT TAC CAT TAT 1298Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg Val Tyr His Tyr690 695 700CAG ATG AAA ATC CAT GTC TTC AGT TAC AAG AAC ATG GGA GAA ATT GAG 1346Gln Met Lys Ile His Val Phe Ser Tyr Lys Asn Met Gly Glu Ile Glu705 710 715 720CCC ACC TTT TAC GTC ACC CTT TAT GGC ACT AAT GCA GAT TCC CAG ACT 1394Pro Thr Phe Tyr Val Thr Leu Tyr Gly Thr Asn Ala Asp Ser Gln Thr725 730 735
CTG CCA CTG GAA ATA GTG GAG CGG ATC GAG CAG AAT GCC ACC AAC ACC 1442Leu Pro Leu Glu Ile Val Glu Arg Ile Glu Gln Asn Ala Thr Asn Thr740 745 750TTC CTG GTC TAC ACC GAG GAG GAC TTG GGA GAC CTC TTG AAG ATC CAG 1490Phe Leu Val Tyr Thr Glu Glu Asp Leu Gly Asp Leu Leu Lys Ile Gln755 760 765CTC ACC TGG GAG GGG GCC TCT CAG TCT TGG TAC AAC CTG TGG AAG GAG 1538Leu Thr Trp Glu Gly Ala Ser Gln Ser Trp Tyr Asn Leu Trp Lys Glu770 775 780TTT CGC AGC TAC CTG TCT CAA CCC CGC AAC CCC GGA CGG GAG CTG AAT 1586Phe Arg Ser Tyr Leu Ser Gln Pro Arg Asn Pro Gly Arg Glu Leu Asn785 790 795 800ATC AGG CGC ATC CGG GTG AAG TCT GGG GAA ACC CAG CGG AAA CTG ACA 1634Ile Arg Arg Ile Arg Val Lys Ser Gly Glu Thr Gln Arg Lys Leu Thr805 810 815TTT TGT ACA GAA GAC CCT GAG AAC ACC AGC ATA TCC CCA GGC CGG GAG 1682Phe Cys Thr Glu Asp Pro Glu Asn Thr Ser Ile Ser Pro Gly Arg Glu820 825 830CTC TGG TTT CGC AAG TGT CGG GAT GGC TGG AGG ATG AAA AAC GAA ACC 1730Leu Trp Phe Arg Lys Cys Arg Asp Gly Trp Arg Met Lys Asn Glu Thr835 840 845AGT CCC ACT GTG GAG CTT CCC TGA GGGTGCCCGG GCAAGTCTTG CCAGCAAGGC 1784Ser Pro Thr Val Glu Leu Pro *850 855AGCAAGACTT CCTGCTATCC AAGCCCATGG AGGAAAGTTA CTGCTGAGGA CCCACCCAAT1844GGAAGGATTC TTCTCAGCCT TGACCCTGGA GCACTGGGAA CAACTGGTCT CCTGTGATGG1904CTGGGACTCC TCGCGGGAGG GGACTGCGCT GCTATAGCTC TTGCTGCCTC TCTTGAATAG1964CTCTAACTCC AAACCTCTGT CCACACCTCC AGAGCACCAA GTCCAGATTT GTGTGTAAGC2024AGCTGGGTGC CTGGGGCCTC TCGTGCACAC TGGATTGGTT TCTCAGTTGC TGGGCGAGCC2084TGTACTCTGC CTGACGAGGA ACGCTGGCTC CGAAGAGGCC CTGTGTAGAA GGCTGTCAGC2144TGCTCAGCCT GCTTTGAGCC TCAGTGAGAA GTCCTTCCGA CAGGAGCTGA CTCATGTCAG2204GATGGCAGGC CTGGTATCTT GCTCGGGCCC TGGCTGTTGG GGTTCTCATG GGTTGCACTG2264ACCATACTGC TTACGTCTTA GCCATTCCGT CCTGCTCCCC AGCTCACTCT CTGAAGCACA2324CATCATTGGC TTTCCTATTT TTCTGTTCAT TTTTTAATTG AGCAAATGTC TATTGAACAC2384
TGGAGTTGGG ATTTCTAGAC CCTCTTTCTG TTTGGATGGT GTATGTGTAT ATGCATGGGG2504AAAGGCACCT GGGGCCTGGG GGAGGCTATA GGATATAAGC AGTCGACGCG GCCGCGAATT2564C2565(2)關(guān)于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度501個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys1 5 10 15Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu20 25 30Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gln Thr Glu Val Lys Pro Ser35 40 45Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys50 55 60Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gln Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn65 70 75 80Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly85 90 95Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg100 105 110Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His115 120 125Gln Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser130 135 140Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gln Glu Lys Asp Asp Phe Ser Leu145 150 155 160Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly
165 170 175Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile Thr Gly Leu180 185 190Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His Lys Arg Leu195 200 205Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg210 215 220Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gln Met Pro Val Gly His Ile Asp225 230 235 240Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gln Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp245 250 255Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys260 265 270Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gln275 280 285Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys290 295 300Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly305 310 315 320Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys Met Tyr Leu325 330 335Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg Val Tyr His Tyr Gln Met Lys340 345 350Ile His Val Phe Ser Tyr Lys Asn Met Gly Glu Ile Glu Pro Thr Phe355 360 365Tyr Val Thr Leu Tyr Gly Thr Asn Ala Asp Ser Gln Thr Leu Pro Leu370 375 380Glu Ile Val Glu Arg Ile Glu Gln Asn Ala Thr Asn Thr Phe Leu Val385 390 395 400Tyr Thr Glu Glu Asp Leu Gly Asp Leu Leu Lys Ile Gln Leu Thr Trp405 410 415Glu Gly Ala Ser Gln Ser Trp Tyr Asn Leu Trp Lys Glu Phe Arg Ser420 425 430Tyr Leu Ser Gln Pro Arg Asn Pro Gly Arg Glu Leu Asn Ile Arg Arg435 440 445
Ile Arg Val Lys Ser Gly Glu Thr Gln Arg Lys Leu Thr Phe Cys Thr450 455 460Glu Asp Pro Glu Asn Thr Ser Ile Ser Pro Gly Arg Glu Leu Trp Phe465 470 475 480Arg Lys Cys Arg Asp Gly Trp Arg Met Lys Asn Glu Thr Ser Pro Thr485 490 495Val Glu Leu Pro *500(2)關(guān)于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1035個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..1035(xi)序列描述SEQ ID NO9ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC TGC TAT TGC 48Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys505 510 515TTT GCT GCG GGG AGC CCC GTA CCT TTT GGT CCA GAG GGA CGG CTG GAA 96Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu520 525 530GAT AAG CTC CAC AAA CCC AAA GCT ACA CAG ACT GAG GTC AAA CCA TCT 144Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gln Thr Glu Val Lys Pro Ser535 540 545GTG AGG TTT AAC CTC CGC ACC TCC AAG GAC CCA GAG CAT GAA GGA TGC 192Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys550 555 560 565TAC CTC TCC GTC GGC CAC AGC CAG CCC TTA GAA GAC TGC AGT TTC AAC 240Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gln Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn570 575 580ATG ACA GCT AAA ACC TTT TTC ATC ATT CAC GGA TGG ACG ATG AGC GGT 288
Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly585 590 595ATC TTT GAA AAC TGG CTG CAC AAA CTC GTG TCA GCC CTG CAC ACA AGA 336Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg600 605 610GAG AAA GAC GCC AAT GTA GTT GTG GTT GAC TGG CTC CCC CTG GCC CAC 384Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His615 620 625CAG CTT TAC ACG GAT GCG GTC AAT AAT ACC AGG GTG GTG GGA CAC AGC 432Gln Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser630 635 640 645ATT GCC AGG ATG CTC GAC TGG CTG CAG GAG AAG GAC GAT TTT TCT CTC 480Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gln Glu Lys Asp Asp Phe Ser Leu650 655 660GGG AAT GTC CAC TTG ATC GGC TAC AGC CTC GGA GCG CAC GTG GCC GGG 528Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly665 670 675TAT GCA GGC AAC TTC GTG AAA GGA ACG GTG GGC CGA ATC ACA GGT TTG 576Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile Thr Gly Leu680 685 690GAT CCT GCC GGG CCC ATG TTT GAA GGG GCC GAC ATC CAC AAG AGG CTC 624Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His Lys Arg Leu695 700 705TCT CCG GAC GAT GCA GAT TTT GTG GAT GTC CTC CAC ACC TAC ACG CGT 672Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg710 715 720 725TCC TTC GGC TTG AGC ATT GGT ATT CAG ATG CCT GTG GGC CAC ATT GAC 720Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gln Met Pro Val Gly His Ile Asp730 735 740ATC TAC CCC AAT GGG GGT GAC TTC CAG CCA GGC TGT GGA CTC AAC GAT 768Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gln Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp745 750 755GTC TTG GGA TCA ATT GCA TAT GGA ACA ATC ACA GAG GTG GTA AAA TGT 816Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys760 765 770GAG CAT GAG CGA GCC GTC CAC CTC TTT GTT GAC TCT CTG GTG AAT CAG 864Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gln775 780 785GAC AAG CCG AGT TTT GCC TTC CAG TGC ACT GAC TCC AAT CGC TTC AAA 912
Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys790 795 800 805AAG GGG ATC TGT CTG AGC TGC CGC AAG AAC CGT TGT AAT AGC ATT GGC 960Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly810 8l5 820TAC AAT GCC AAG AAA ATG AGG AAC AAG AGG AAC AGC AAA ATG TAC CTA 1008Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys Met Tyr Leu825 830 835AAA ACC CGG GCA GGC ATG CCT TTC AGA 1035Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg840 845(2)關(guān)于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度345個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys1 5 10 15Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu20 25 30Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gln Thr Glu Val Lys Pro Ser35 40 45Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys50 55 60Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gln Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn65 70 75 80Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly85 90 95Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg100 105 110Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His115 120 125Gln Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser
130 135 140Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gln Glu Lys Asp Asp Phe Ser Leu145 150 155 160Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly165 170 175Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile Thr Gly Leu180 185 190Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His Lys Arg Leu195 200 205Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg210 215 220Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gln Met Pro Val Gly His Ile Asp225 230 235 240Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gln Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp245 250 255Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys260 265 270Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gln275 280 285Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys290 295 300Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly305 310 315 320Tyr Asn Ala Lys Lys Met Arg Asn Lys Arg Asn Ser Lys Met Tyr Leu325 330 335Lys Thr Arg Ala Gly Met Pro Phe Arg340 345(2)關(guān)于SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度225個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..225(xi)序列描述SEQ ID NO11CTG GGA TCC ATC GCC TAT GGC ACG ATC GCG GAG GTG GTG AAG TGC GAG 48Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Ala Glu Val Val Lys Cys Glu350 355 360CAT GAG CGG GCC GTG CAT CTC TTT GTG GAC TCC CTG GTG AAC CAG GAC 96His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gln Asp365 370 375AAG CCG AGC TTT GCC TTC CAG TGC ACA GAC TCC AAC CGC TTC AAA AAA 144Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys Lys380 385 390GGG ATC TGT CTC AGC TGC CGG AAG AAC CGC TGT AAC GGC ATC GGC TAC 192Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Gly Ile Gly Tyr395 400 405AAT GCT AAG AAG ACG AGG AAT AAG AGG AAC ACC 225Asn Ala Lys Lys Thr Arg Asn Lys Arg Asn Thr410 415 420(2)關(guān)于SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度75個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO12Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Ala Glu Val Val Lys Cys Glu1 5 10 15His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gln Asp20 25 30Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gln Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys Lys35 40 45Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Gly Ile Gly Tyr50 55 60Asn Ala Lys Lys Thr Arg Asn Lys Arg Asn Thr
(2)關(guān)于SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度472個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Val Leu Thr Leu Ala Val Trp Leu Gln1 5 10 15Ser Leu Thr Ala Ser Arg Gly Gly Val Ala Ala Ala Asp Gln Arg Arg20 25 30Asp Phe Ile Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu Arg Thr Pro Glu Asp35 40 45Thr Ala Glu Asp Thr Cys His Leu Ile Pro Gly Val Ala Glu Ser Val50 55 60Ala Thr Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr Phe Met Val Ile His65 70 75 80Gly Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val85 90 95Ala Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn Val Ile Val Val Asp100 105 110Trp Leu Ser Arg Ala Gln Glu His Tyr Pro Val Ser Ala Gly Tyr Thr115 120 125Lys Val Gly Gln Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu Glu130 135 140Phe Asn Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly145 150 155 160Ala His Ala Ala Gly Ile Ala Gly Ser Leu Thr Asn Lys Lys Val Asn165 170 175Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Asn Phe Glu Tyr Ala Glu180 185 190
Ala Pro Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His195 200 205Thr Phe Thr Arg Gly Ser Pro Gly Arg Ser Ile Gly Ile Gln Lys Pro210 215 220Val Gly His Val Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln Pro Gly225 230 235 240Cys Asn Ile Gly Glu Ala Ile Arg Val Ile Ala Glu Arg Gly Leu Gly245 250 255Asp Val Asp Gln Leu Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile His Leu Phe260 265 270Ile Asp Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Pro Ser Lys Ala Tyr Arg Cys275 280 285Ser Ser Lys Glu Ala Phe Glu Lys Gly Leu Cys Leu Ser Cys Arg Lys290 295 300Asn Arg Cys Asn Asn Leu Gly Tyr Glu Ile Asn Lys Val Arg Ala Lys305 310 315 320Arg Ser Ser Lys Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ser Gln Met Pro Tyr Lys325 330 335Val Phe His Tyr Gln Val Lys Ile His Phe Ser Gly Thr Glu Ser Glu340 345 350Thr His Thr Asn Gln Ala Phe Glu Ile Ser Leu Tyr Gly Thr Val Ala355 360 365Glu Ser Glu Asn Ile Pro Phe Thr Leu Pro Glu Val Ser Thr Asn Lys370 375 380Thr Tyr Ser Phe Leu Ile Tyr Thr Glu Val Asp Ile Gly Glu Leu Leu385 390 395 400Met Leu Lys Leu Lys Trp Lys Ser Asp Ser Tyr Phe Ser Trp Ser Asp405 410 415Trp Trp Ser Ser Pro Gly Phe Ala Ile Gln Lys Ile Arg Val Lys Ala420 425 430Gly Glu Thr Gln Lys Lys Val Ile Phe Cys Ser Arg Glu Lys Val Ser435 440 445His Leu Gln Lys Gly Lys Ala Pro Ala Val Phe Val Lys Cys His Asp450 455 460Lys Ser Leu Asn Lys Lys Ser Gly465 470
(2)關(guān)于SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度499個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Asp Thr Ser Pro Leu Cys Phe Ser Ile Leu Leu Val Leu Cys Ile1 5 10 15Phe Ile Gln Ser Ser Ala Leu Gly Gln Ser Leu Lys Pro Glu Pro Phe20 25 30Gly Arg Arg Ala Gln Ala Val Glu Thr Asn Lys Thr Leu His Glu Met35 40 45Lys Thr Arg Phe Leu Leu Phe Gly Glu Thr Asn Gln Gly Cys Gln Ile50 55 60Arg Ile Asn His Pro Asp Thr Leu Gln Glu Cys Gly Phe Asn Ser Ser65 70 75 80Leu Pro Leu Val Met Ile Ile His Gly Trp Ser Val Asp Gly Val Leu85 90 95Glu Asn Trp Ile Trp Gln Met Val Ala Ala Leu Lys Ser Gln Pro Ala100 105 110Gln Pro Val Asn Val Gly Leu Val Asp Trp Ile Thr Leu Ala His Asp115 120 125His Tyr Thr Ile Ala Val Arg Asn Thr Arg Leu Val Gly Lys Glu Val130 135 140Ala Ala Leu Leu Arg Trp Leu Glu Glu Ser Val Gln Leu Ser Arg Ser145 150 155 160His Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ser Gly Phe165 170 175Ala Gly Ser Ser Ile Gly Gly Thr His Lys Ile Gly Arg Ile Thr Gly
180 185 190Leu Asp Ala Ala Gly Pro Leu Phe Glu Gly Ser Ala Pro Ser Asn Arg195 200 205Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asn Phe Val Asp Ala Ile His Thr Phe Thr210 215 220Arg Glu His Met Gly Leu Ser Val Gly Ile Lys Gln Pro Ile Gly His225 230 235 240Tyr Asp Phe Tyr Pro Asn Gly Gly Ser Phe Gln Pro Gly Cys His Phe245 250 255Leu Glu Leu Tyr Arg His Ile Ala Gln His Gly Phe Asn Ala Ile Thr260 265 270Gln Thr Ile Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Val His Leu Phe Ile Asp275 280 285Ser Leu Leu His Ala Gly Thr Gln Ser Met Ala Tyr Pro Cys Gly Asp290 295 300Met Asn Ser Phe Ser Gln Gly Leu Cys Leu Ser Cys Lys Lys Gly Arg305 310 315 320Cys Asn Thr Leu Gly Tyr His Val Arg Gln Glu Pro Arg Ser Lys Ser325 330 335Lys Arg Leu Phe Leu Val Thr Arg Ala Gln Ser Pro Phe Lys Val Tyr340 345 350His Tyr Gln Leu Lys Ile Gln Phe Ile Asn Gln Thr Glu Thr Pro Ile355 360 365Gln Thr Thr Phe Thr Met Ser Leu Leu Gly Thr Lys Glu Lys Met Gln370 375 380Lys Ile Pro Ile Thr Leu Gly Lys Gly Ile Ala Ser Asn Lys Thr Tyr385 390 395 400Ser Phe Leu Ile Thr Leu Asp Val Asp Ile Gly Glu Leu Ile Met Ile405 410 415Lys Phe Lys Trp Glu Asn Ser Ala Val Trp Ala Asn Val Trp Asp Thr420 425 430Val Gln Thr Ile Ile Pro Trp Ser Thr Gly Pro Arg His Ser Gly Leu435 440 445Val Leu Lys Thr Ile Arg Val Lys Ala Gly Glu Thr Gln Gln Arg Met450 455 460
Thr Phe Cys Ser Glu Asn Thr Asp Asp Leu Leu Leu Arg Pro Thr Gln465 470 475 480Glu Lys Ile Phe Val Lys Cys Glu Ile Lys Ser Lys Thr Ser Lys Arg485 490 495Lys Ile Arg(2)關(guān)于SEQ ID NOl5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度465個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO15Met Leu Pro Leu Trp Thr Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala Val Ala Gly1 5 10 15Lys Glu Val Cys Tyr Glu Arg Leu Gly Cys Phe Ser Asp Asp Ser Pro20 25 30Trp Ser Gly Ile Thr Glu Arg Pro Leu His Ile Leu Pro Trp Ser Pro35 40 45Lys Asp Val Asn Thr Arg Phe Leu Leu Tyr Thr Asn Glu Asn Pro Asn50 55 60Asn Phe Gln Glu Val Ala Ala Asp Ser Ser Ser Ile Ser Gly Ser Asn65 70 75 80Phe Lys Thr Asn Arg Lys Thr Arg Phe Ile Ile His Gly Phe Ile Asp85 90 95Lys Gly Glu Glu Asn Trp Leu Ala Asn Val Cys Lys Asn Leu Phe Lys100 105 110Val Glu Ser Val Asn Cys Ile Cys Val Asp Trp Lys Gly Gly Ser Arg115 120 125Thr Gly Tyr Thr Gln Ala Ser Gln Asn Ile Arg Ile Val Gly Ala Glu130 135 140
Val Ala Tyr Phe Val Glu Phe Leu Gln Ser Ala Phe Gly Tyr Ser Pro145 150 155 160Ser Asn Val His Val Ile Gly His Ser Leu Gly Ala His Ala Ala Gly165 170 175Glu Ala Gly Arg Arg Thr Asn Gly Thr Ile Gly Arg Ile Thr Gly Leu180 185 190Asp Pro Ala Glu Pro Cys Phe Gln Gly Thr Pro Glu Leu Val Arg Leu195 200 205Asp Pro Ser Asp Ala Lys Phe Val Asp Val Ile His Thr Asp Gly Ala210 215 220Pro Ile Val Pro Asn Leu Gly Phe Gly Met Ser Gln Val Val Gly His225 230 235 240Leu Asp Phe Phe Pro Asn Gly Gly Val Glu Met Pro Gly Cys Lys Lys245 250 255Asn Ile Leu Ser Gln Ile Val Asp Ile Asp Gly Ile Trp Glu Gly Thr260 265 270Arg Asp Phe Ala Ala Cys Asn His Leu Arg Ser Tyr Lys Tyr Tyr Thr275 280 285Asp Ser Ile Val Asn Pro Asp Gly Phe Ala Gly Phe Pro Cys Ala Ser290 295 300Tyr Asn Val Phe Thr Ala Asn Lys Cys Phe Pro Cys Pro Ser Gly Gly305 310 315 320Cys Pro Gln Met Gly His Tyr Ala Asp Arg Tyr Pro Gly Lys Thr Asn325 330 335Asp Val Gly Gln Lys Phe Tyr Leu Asp Thr Gly Asp Ala Ser Asn Phe340 345 350Ala Arg Trp Arg Tyr Lys Val Ser Val Thr Leu Ser Gly Lys Lys Val355 360 365Thr Gly His Ile Leu Val Ser Leu Phe Gly Asn Lys Gly Asn Ser Lys370 375 380Gln Tyr Glu Ile Phe Lys Gly Thr Leu Lys Pro Asp Ser Thr His Ser385 390 395 400Asn Glu Phe Asp Ser Asp Val Asp Val Gly Asp Leu Gln Met Val Lys405 410 415Phe Ile Trp Tyr Asn Asn Val Ile Asn Pro Thr Leu Pro Arg Val Gly
420 425 430Ala Ser Lys Ile Ile Val Glu Thr Asn Val Gly Lys Gln Phe Asn Phe435 440 445Cys Ser Pro Glu Thr Val Arg Glu Glu Val Leu Leu Thr Leu Thr Pro450 455 460Cys465(2)關(guān)于SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型肽(ii)片段類型內(nèi)部的(xi)序列描述SEQ ID NO16Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr1 5 10 15Cys(2)關(guān)于SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO17TTTTTTTTTT TGA 13
(2)關(guān)于SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO18GATCAATCGC 10(2)關(guān)于SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO19TAGGACATGC ACAGTGTAAT CTG23(2)關(guān)于SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO20GATTGTGCTG GCCACTTCTC20(2)關(guān)于SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO21GACACTCCAG GGACTGAAG 19(2)關(guān)于SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度48個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵修飾的_堿基
(B)位置36(D)其它信息/修飾的_堿基＝i(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵修飾的_堿基(B)位置37(D)其它信息/修飾的_堿基＝i(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵修飾的_堿基(B)位置41(D)其它信息/修飾的_堿基＝i(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵修飾的_堿基(B)位置42(D)其它信息/修飾的_堿基＝i(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵修飾的_堿基(B)位置46(D)其它信息/修飾的_堿基＝i(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵修飾的_堿基(B)位置47(D)其它信息/修飾的_堿基＝i(xi)序列描述SEQ ID NO22CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG 48(2)關(guān)于SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO23CACACACAGG CCACGCGTCG ACTAGTAC 28(2)關(guān)于SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO24ACCACCATGG AGAGCAAAGC CCTG 24(2)關(guān)于SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”
(xi)序列描述SEQ ID NO25CCAGTTTCAG CCTGACTTCT TATTC 25(2)關(guān)于SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO26GGCTGTGGAC TCAACGATGT C 21(2)關(guān)于SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO27CCGGGTGGGT AGGTACATTT TG 22(2)關(guān)于SEQ ID NO28的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO28GGGGGTGACT TCCAGCCAGG CTGTG 25(2)關(guān)于SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO29AACTCTGAAA GGCATGCCTG CCCGG 25(2)關(guān)于SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO30TGAAGGTCGG AGTCAACGGA TTTGGT 26(2)關(guān)于SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述SEQ ID NO31CATGTGGGCC ATGAGGTCCA CCAC 2權(quán)利要求
1.一種脂酶樣基因編碼的分離的多肽，其中的多肽是兔來源的，并且(a)與肝素結(jié)合，(b)與人脂蛋白脂酶和肝脂肪酶有同源性，且(c)包含具有SEQ ID NO10的氨基酸序列之三酰甘油脂酶家族39kD的催化結(jié)構(gòu)域，其中，分離的多肽含有SEQ ID NO12的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的多肽，其中多肽具有磷脂酶A活性。
3.包含權(quán)利要求1的多肽和生物學(xué)上相容的溶液的組合物。
4.包含權(quán)利要求1的多肽和藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
5.編碼權(quán)利要求1的多肽的分離的核酸。
6.權(quán)利要求5的分離的核酸，其是cDNA。
7.權(quán)利要求6的分離的核酸，其中核苷酸序列是SEQ ID NO11。
8.包含權(quán)利要求7的核酸和藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
9.含有與調(diào)控區(qū)域可操作性連接的權(quán)利要求7的分離的核酸的載體。
10.權(quán)利要求9的載體，其中調(diào)控區(qū)是異源的。
11.權(quán)利要求9的載體，其是病毒載體。
12.權(quán)利要求11的載體，其是腺病毒載體。
13.包含權(quán)利要求12的載體的重組細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的重組細(xì)胞，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的重組細(xì)胞，其中細(xì)胞是COS-7細(xì)胞。
16.包含權(quán)利要求9的載體和生物學(xué)上相容的溶液的組合物。
17.包含權(quán)利要求9的載體和藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
18.一種制備權(quán)利要求1所述多肽的方法，包括在允許多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組細(xì)胞的步驟。
19.能夠與權(quán)利要求1的多肽特異結(jié)合的抗體。
20.能夠與權(quán)利要求2的多肽特異結(jié)合并中和此多肽的磷脂酶活性的抗體。
21.權(quán)利要求19或20的抗體，其是單克隆抗體。
22.權(quán)利要求19或20的抗體，其是多克隆抗體。
23.一種產(chǎn)生權(quán)利要求21的抗體的雜交瘤細(xì)胞。
24.包含權(quán)利要求19的抗體和生物學(xué)上相容的溶液的組合物。
25.包含權(quán)利要求19的抗體和藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
26.一種篩選LLG活性的興奮劑或拮抗物的方法，包括(a)使可能的興奮劑或拮抗物與LLG和LLG的底物接觸，并且(b)測(cè)定可能的興奮劑或拮抗物增強(qiáng)或抑制LLG活性的能力，其中LLG是權(quán)利要求1的多肽。
27.一種酶促水解磷脂酰膽堿酯的方法，包括使該磷脂酰膽堿酯與權(quán)利要求1的多肽接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開了脂蛋白脂酶樣多肽，編碼該多肽的核酸、其反義序列和針對(duì)該多肽的抗體。本發(fā)明也公開了以重組系統(tǒng)制備該多肽和將該多肽用于篩選該多肽的興奮劑和/或拮抗物的方法。本發(fā)明也公開了治療脂代謝紊亂的方法和組合物。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1539849SQ20041003840
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期1997年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月6日
發(fā)明者M·C·扎耶, K-A·T·多恩, J·A·克拉維克, K·J·林克, D·V·阿明, V·J·索斯, 多恩, M C 扎耶, 克拉維克, 林克, 索斯, 阿明 申請(qǐng)人:阿溫蒂斯藥物公司