專利名稱：一種天然脫落酸的提取方法
一、所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及天然物質(zhì)的提取分離領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脫落酸是五大植物激素之一，是植物重要生長調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)果實類、谷類、豆類等的成熟發(fā)育，能大幅度提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，又能大大增強(qiáng)其耐寒、抗旱和抗鹽堿能力，因而其有廣闊的應(yīng)用前景。
存在于植物體內(nèi)的天然脫落酸光學(xué)構(gòu)型為(s)-(+)-脫落酸，其結(jié)構(gòu)式為 2-順式-(+)-脫落酸現(xiàn)已經(jīng)建立了將植物細(xì)胞磨碎，用有機(jī)溶劑抽提，碳酸氫鈉水溶液萃取，提取液濃縮，再進(jìn)行柱層析，直接從植物中分離和精制天然脫落酸的方法。由于每1kg干植物僅含1-0.5mg天然脫落酸，其植物中的天然脫落酸含量很低，該方法難以得到大量的天然脫落酸。
而據(jù)報道人工合成脫落酸得到的是外消旋體，生物活性較低。
為了解決和滿足脫落酸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。近二十年來，微生物學(xué)專家一直在研究利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然脫落酸，現(xiàn)已有通過用微生物進(jìn)行液體發(fā)酵和固體發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的報道，主要采用了固體發(fā)酵、液體批次發(fā)酵和連續(xù)流加補(bǔ)料出料工藝等多種發(fā)酵方法，但這些方法中天然脫落酸的發(fā)酵產(chǎn)量一直比較低，成本高，如微生物發(fā)酵15天然脫落酸的濃度為63mg/升發(fā)酵液(JP-A-3-6139)；最高的產(chǎn)量達(dá)300mg/升發(fā)酵液(如J P-A-6-247927、J P-A-6-197775)；J P-A-63-296697公開的固體培養(yǎng)法的含量為82mg/100g培養(yǎng)基。由于迄今為止所報道天然脫落酸的發(fā)酵水平離工業(yè)化都還有一定的距離，因此，有關(guān)從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中分離提取天然脫落酸的工作開展較少，尤其從微生物發(fā)酵液中提取天然脫落酸的方法報道更少，而且收得率都比較低。例如，JP-A-60-6629公開的用大量溶劑萃取天然脫落酸，其產(chǎn)品收率約54％。JP-A-3-6139公開的產(chǎn)品收率為73％，都不適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
針對現(xiàn)有微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸方法中存在的發(fā)酵產(chǎn)率低，收率低，生產(chǎn)成本高等不足，本發(fā)明人通過研究，首先突破了發(fā)酵技術(shù)這一關(guān)(見CN1182798)，天然脫落酸的最高產(chǎn)量達(dá)到1.2克/升發(fā)酵液，該發(fā)酵水平已接近或達(dá)到了工業(yè)化開發(fā)的要求，并實現(xiàn)了20噸規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)品收率為80％。
雖然通過發(fā)明人的努力，微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的產(chǎn)量和規(guī)模在原有基礎(chǔ)上都取得了顯著的進(jìn)步，但是，如何盡可能多的將發(fā)酵液中的天然脫落酸提取出來是急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上問題，發(fā)明人對微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的發(fā)酵產(chǎn)物的提取進(jìn)行了深入的研究，得到了一種工藝簡單，成本低，產(chǎn)品收率高的從微生物發(fā)酵液中提取天然脫落酸新方法，使天然脫落酸通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)成為了可能，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明公開了一種從微生物發(fā)酵液中分離提取天然脫落酸的方法。
本發(fā)明所述的天然脫落酸提取方法指的就是從液體發(fā)酵液中將天然脫落酸分離、濃縮、純化的過程。
本發(fā)明可以通過以下方式得以實現(xiàn)取能發(fā)酵產(chǎn)生天然脫落酸的微生物定向培養(yǎng)得到的發(fā)酵液酸化后過濾，濾液用大孔吸附樹脂吸附后用有機(jī)溶劑洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮后進(jìn)行萃取，萃取液濃縮得到結(jié)晶粗品；結(jié)晶粗品在乙酸乙酯中溶解后，用硅膠吸附雜質(zhì)，加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑，減壓濃縮，冷卻結(jié)晶，洗滌、真空干燥，制得95％以上天然脫落酸結(jié)晶體。
本發(fā)明中的發(fā)酵液是用能生產(chǎn)天然脫落酸的微生物(如，葡萄飽霉屬、尾飽霉屬等)通過液體發(fā)酵得到的。
發(fā)酵液的酸化是加入硫酸或鹽酸處理0-10小時，最優(yōu)處理時間范圍為0.5-5小時，控制發(fā)酵液的Ph值范圍在1.5-5.0。
發(fā)酵液酸化后過濾除去雜質(zhì)，利用101大孔陽離子交換吸附樹脂吸附發(fā)酵液中的天然脫落酸組分，再用有機(jī)溶媒如40-85％的甲醇或50-95％的乙醇水溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫。
洗脫液在真空度小于0.08Mpa下，經(jīng)減壓濃縮得到含天然脫落酸的濃縮液，以乙酸乙酯為溶劑多次萃取，減壓濃縮，冷卻結(jié)晶，制得結(jié)晶粗品。
在結(jié)晶粗品中加入乙酸丁酯或乙酸乙酯類低級乙酸酯溶劑，以適量的硅膠吸附雜質(zhì)，加入己烷、苯、石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑，減壓濃縮，冷卻結(jié)晶，洗滌、真空干燥，制得95％以上天然脫落酸結(jié)晶體。
由于天然脫落酸是光敏化合物，整個操作過程都在避光條件下進(jìn)行，減少或避免天然脫落酸的異構(gòu)及分解，提高天然脫落酸的回收率。
新方法與現(xiàn)有報道的提取方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、工藝方法簡單合理、可行、投資??；
2、新方法采用的101大孔陽離子吸附樹脂是對以前提取方法的一個重要改進(jìn)，新選擇的101大孔陽離子吸附樹脂對天然脫落酸具有非常強(qiáng)的富集能力，該步方法能富集發(fā)酵液中99％以上的天然脫落酸。而報道(JP-A-7-165702)的溶媒法多次萃取，該步工藝萃取率只有90％左右；3、新方法第一步是提取結(jié)晶粗品，改變了現(xiàn)有直接提取脫落酸精品的方法，使產(chǎn)品收得率達(dá)到90％以上，比現(xiàn)有的提取方法提高10個百分點以上；4、本發(fā)明方法的三廢排放量比溶媒法低得多。
四

下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明方法發(fā)酵液經(jīng)酸化后過濾，濾液用大孔吸附樹脂吸附后用有機(jī)溶劑如甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮后以乙酸乙酯為溶劑進(jìn)行萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮后結(jié)晶得到結(jié)晶粗品；結(jié)晶粗品用低級乙酸酯類溶劑溶解后，用硅膠吸附雜質(zhì)，過濾，再加入己烷、苯、石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑，減壓濃縮，冷卻結(jié)晶，過濾、洗滌、真空干燥，制得95％以上天然脫落酸結(jié)晶體。
五具體實施例方式
實施例16000mL發(fā)酵培養(yǎng)基成分糊精5.0％，麥麩0.3％，乙二醇0.02％，葡萄糖2.0％，蔗糖3.0％，豆餅粉1.0％，，磷酸氫二鉀0.01％，硫酸鎂0.05％，將以上培養(yǎng)基分裝20個1000mL三角瓶，每瓶裝300mL，于120℃滅菌30分鐘，冷卻后接種活化后的脫落酸高產(chǎn)菌株灰葡萄孢TBI-9孢子懸液，于23-29℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。振蕩速度150rpm，振幅20cm。發(fā)酵時間8-9天，天然脫落酸濃度達(dá)到0.12％。
取5000克發(fā)酵液(天然脫落酸含量為6.025克)，加入3N硫酸溶液調(diào)節(jié)Ph至1.5-5.0，進(jìn)行酸化處理30分鐘。在室溫下濾紙過濾，濾除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)后，利用1000克101大孔陽離子交換樹脂接觸富集酸化液體中的天然脫落酸1小時后，再用2500mL 40-85％甲醇洗樹脂30分鐘，收集含天然脫落酸的甲醇液，甲醇液的天然脫落酸含量是5.905克。
洗脫甲醇液在Buchi R-3000型旋轉(zhuǎn)蒸餾裝置上減壓蒸餾，真空度保持在小于0.08Mpa，水浴溫度40-60℃，蒸餾速度控制在12mL/min，濃縮成原體積五分之一左右的水溶液，用與濃縮液等體積的乙酸乙酯分三次進(jìn)行萃取，當(dāng)水相中的天然脫落酸濃度低于0.05克/升時停止操作。合并酯相，在旋轉(zhuǎn)蒸餾裝置上減壓蒸餾，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴溫度40-50℃，冷卻結(jié)晶得結(jié)晶粗品。本步操作收率達(dá)95％。
在結(jié)晶粗品中加入100mL乙酸丁酯或乙酸乙酯溶劑，以及20克硅膠吸附雜質(zhì)，過濾。在濾液中加入10-100mL四氯化碳或石油醚結(jié)晶助劑，減壓濃縮，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴溫度40-50℃，冷卻結(jié)晶，過濾、洗滌、真空干燥，即制得5.590克純度為98.3％的天然脫落酸產(chǎn)品，產(chǎn)品收率為91.2％。
以上操作過程都在避光條件下進(jìn)行。
實施例2發(fā)酵液的制備方法同實施例1，取5000克發(fā)酵液(天然脫落酸含量為6.010克)，加入4.5升水，使液體中天然脫落酸的濃度為0.012％，用此溶液代替原始發(fā)酵液進(jìn)行提取分離。加入3N鹽酸溶液調(diào)節(jié)Ph至1.5-5.0，在室溫下9000rpm離心10分鐘，收集上清液。離心后的上清液與1000克101大孔陽離子交換樹脂接觸1小時后，再用2500mL 40-85％甲醇洗樹脂30分鐘，收集含天然脫落酸的甲醇液，甲醇液的天然脫落酸含量是5.920克。
洗脫甲醇液在Buchi R-3000型旋轉(zhuǎn)蒸餾裝置上減壓蒸餾，真空度保持在小于0.08Mpa，水浴溫度40-60℃，蒸餾速度控制在12mL/min，濃縮成原體積五分之一左右的水溶液，用與濃縮液等體積的乙酸乙酯分三次進(jìn)行萃取，當(dāng)水相中的天然脫落酸濃度低于0.05克/升時停止操作。合并酯相，在旋轉(zhuǎn)蒸餾裝置上減壓蒸餾，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴溫度40-50℃，冷卻結(jié)晶得結(jié)晶粗品。本步操作收率達(dá)95％。
在結(jié)晶粗品中加入100ml醋酸丁酯或醋酸乙酯溶劑，以及20克硅膠吸附雜質(zhì)，過濾。在濾液中加入10-100mL四氯化碳或石油醚結(jié)晶助劑，減壓濃縮，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴溫度40-50℃，冷卻結(jié)晶，過濾、洗滌、真空干燥，制得5.621克純度為98.5％的天然脫落酸產(chǎn)品，產(chǎn)品收率為92.1％。
以上操作過程都在避光條件下進(jìn)行。
實施例3發(fā)酵液的制備方法同實施例1，取5000克發(fā)酵液(天然脫落酸含量為6.110克)。提取分離操作中除了101大孔陽離子交換樹脂接觸富集酸化液體中的天然脫落酸后，用乙醇代替甲醇作為洗脫劑對樹脂吸附的天然脫落酸進(jìn)行洗脫外，其它操作基本同實施例1。最后制得5.589克純度為98.5％的天然脫落酸產(chǎn)品，產(chǎn)品收率為90.1％。
權(quán)利要求
1.一種天然脫落酸的提取方法，包括以下步驟取能發(fā)酵產(chǎn)生天然脫落酸的微生物定向培養(yǎng)得到的發(fā)酵液酸化后過濾，濾液用大孔吸附樹脂吸附后用有機(jī)溶劑洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮后進(jìn)行萃取，萃取液濃縮得到結(jié)晶粗品；結(jié)晶粗品溶解后，用硅膠吸附雜質(zhì)，加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑，減壓濃縮，冷卻結(jié)晶，洗滌、真空干燥，制得95％以上天然脫落酸結(jié)晶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法，其特征是發(fā)酵液的酸化是加入硫酸或鹽酸處理0-10小時，最優(yōu)處理時間范圍為0.5-5小時，控制發(fā)酵液的Ph值范圍在1.5-5.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法，其特征是吸附用大孔樹脂優(yōu)選為101大孔陽離子交換吸附樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法，其特征是洗脫用的有機(jī)溶媒優(yōu)選為40-85％的甲醇或50-95％的乙醇水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法，其特征是整個操作過程都在避光條件下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的天然脫落酸的提取方法，其特征是粗品溶解采用乙酸乙酯作為溶劑，加入的結(jié)晶助劑與乙酸乙酯的體積比例為0.1-1.0比1.0。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。針對目前天然脫落酸提取率和純度不高的問題，本發(fā)明公開了一種天然脫落酸的提取方法，通過發(fā)酵液酸化后過濾，大孔吸附樹脂吸附后洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮后進(jìn)行萃取，萃取液濃縮得到結(jié)晶粗品；結(jié)晶粗品溶解后，用硅膠吸附雜質(zhì)，加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳結(jié)晶助劑，減壓濃縮，冷卻結(jié)晶，洗滌、真空干燥，制得95％以上天然脫落酸結(jié)晶體，本方法具有提取率高、提取得到脫落酸純度高等優(yōu)點。
文檔編號C12P7/40GK1749401SQ20041004068
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者周金燕, 譚紅, 楊杰, 李志東 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所