專利名稱：一種添加羥胺提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種添加羥胺提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法，涉及吸水鏈霉菌發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Microbial transglutaminase，簡稱MTG)，催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)的交聯(lián)、分子間的交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺酰胺基的水解，從而進(jìn)一步改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，生產(chǎn)出滿足人們需求的新型蛋白食品?，F(xiàn)在谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用在許多方面在肉制品加工中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的交聯(lián)作用將一些低價值的碎肉進(jìn)行重組，從而改善其外觀、結(jié)構(gòu)、風(fēng)味，以提高其營養(yǎng)價值和市場價值；在食品加工過程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可以保護(hù)食品蛋白質(zhì)中的賴氨酸避免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而保護(hù)限制性氨基酸；在乳制品加工中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)性；在醫(yī)藥工業(yè)中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶包埋脂類或脂溶性物質(zhì)，形成耐熱耐水性的膜；在非肉類的豆類食品中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶提高食品的彈性和持水能力；在紡織行業(yè)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶還被用來提高蠶絲織物的品質(zhì)。
現(xiàn)在生產(chǎn)MTG的方法主要是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，目前商業(yè)化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)品主要由日本味之素等公司生產(chǎn)。國內(nèi)用微生物生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶尚停留在研究階段，菌種主要是茂原鏈霉菌，生產(chǎn)水平很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種添加羥胺提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案菌種吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13，CCTCC NO203062(中國專利03152956.9 2003年.)，由江南大學(xué)生物工程學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)研究室保藏和提供。
培養(yǎng)基麥汁斜面培養(yǎng)基(g/L)麥汁50，葡萄糖20，酵母膏20，瓊脂20，pH7.0。
種子培養(yǎng)基(g/L)甘油20，葡萄糖20，酵母膏5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)淀粉15，葡萄糖15，蛋白胨25，酵母膏5，碳酸鈣5，NaH2PO45，Na2HPO45，MgSO45，pH7.0。
培養(yǎng)方法將成熟的孢子接種到麥汁斜面上，32℃下培養(yǎng)7-8d。待孢子成熟后，刮取斜面上的孢子，用無菌水制成孢子懸液接種于種子培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長后期。吸取種子培養(yǎng)液，按2-4％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃搖床培養(yǎng)48h。
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力的測定方法發(fā)酵液經(jīng)離心后的清液稀釋5倍后用于活力的測定。
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活力采用分光光度法在37℃下測定。吸取0.4ml稀釋樣品于試管中，加入1ml試劑A，37℃水浴保溫10min，加入0.4ml試劑B，終止反應(yīng)，525nm比色。試劑A將100mg底物CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)完全溶解于2ml 0.2N的NaOH中，并加入4ml a，2mlb，2ml c，調(diào)pH為6.0。(a0.2M三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液，pH6.0；b1M羥胺；c0.01M GSH(還原型谷光甘肽))。試劑B3N HCl，12％TCA(三氯乙酸)，5％FeCl3·6H2O(溶于0.1N HCl中)按1∶1∶1混合配制。一個單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶活定義(u/mL)37℃時每分鐘催化形成1μmol L-谷氨酸-γ-單羥胺酸的酶量。
提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方式谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的測定原理是羥胺與底物Nα-CBZ-GLN-GLY反應(yīng)生成L-谷氨酸-γ-單異羥肟酸，與鐵離子結(jié)合形成絡(luò)合物顯色，用比色法測定。因此認(rèn)為羥胺是極有可能是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶合成的誘導(dǎo)物。系統(tǒng)中誘導(dǎo)物的存在能夠使酶提前處于工作狀態(tài)，使其產(chǎn)酶也處于誘導(dǎo)狀態(tài)從而促進(jìn)產(chǎn)酶。
在發(fā)酵過程中，適時添加適量的羥胺可以促進(jìn)產(chǎn)酶。通過在發(fā)酵過程中添加羥胺在發(fā)酵至36-40h添加0.3-0.7mmol/L羥胺，促進(jìn)了系統(tǒng)產(chǎn)酶，發(fā)酵終了時發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的酶活水平為5.1U/mL。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明選用的吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)WSH03-13合成的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶為胞外酶，并且是迄今為止已報道過的熱、堿穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)交聯(lián)特性最好的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，用于食品加工以及紡織行業(yè)具有很大的潛力。所用的羥胺價格低廉，用量少，顯著提高了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量，搖瓶培養(yǎng)的實驗水平達(dá)國內(nèi)領(lǐng)先水平。
具體實施例方式
實施例1在發(fā)酵的38h添加0.5mmol/L的羥胺，發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量為5.3U/mL，比不加羥胺的對照例提高了32.5％。不添加羥胺的發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量為4.0U/mL。
實施例2在發(fā)酵的36h添加0.3mmol/L的羥胺，發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量為4.6U/mL。
實施例3在發(fā)酵的40h添加0.7mmol/L的羥胺，發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量為5.1U/mL。
權(quán)利要求
1.一種提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法，其特征是采用吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13作為出發(fā)菌株，經(jīng)液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，通過在發(fā)酵過程中添加羥胺，實現(xiàn)了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的高表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在發(fā)酵過程中添加羥胺，發(fā)酵至36-40h在發(fā)酵液中添加0.3-0.7mmol/L的羥胺。
全文摘要
一種添加羥胺提高發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶產(chǎn)量的方法，涉及吸水鏈霉菌發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。本發(fā)明采用吸水鏈霉菌為發(fā)酵菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)液體發(fā)酵制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，通過在發(fā)酵過程中添加羥胺，實現(xiàn)了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的高表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點是所用羥胺價格低廉，用量少，可顯著提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的產(chǎn)量，在其它培養(yǎng)條件相同的情況下，本發(fā)明比不添加羥胺的對照例產(chǎn)量提高約30％，達(dá)到發(fā)酵法制備谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的先進(jìn)水平。
文檔編號C12P21/02GK1597928SQ20041004169
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月12日
發(fā)明者陳堅, 張程杰, 堵國成, 李寅 申請人:江南大學(xué)