專利名稱：提取dna的試劑及使用該試劑提取哺乳動物dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取DNA的試劑的組分及使用該試劑提取哺乳動物DNA的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動物DNA的分離通常是在有EDTA及SDS一類的去污劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現(xiàn)的。低分子量雜質(zhì)則用透析法加以去除。酚—氯仿抽提法是經(jīng)典的核酸提取方法，這種核酸提取方法具有提取效率高、純度好的優(yōu)點，但由于其常涉及到去垢劑裂解，蛋白酶處理，有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟，不但繁瑣，而且增加了標(biāo)本間相互污染的機會。目前從哺乳動物細胞和組織中分離DNA有三種方法。第一種，Blin和Stafford利用蛋白酶K、SDS和酚，需要有機溶劑抽提，該方法費力。第二種方法，包括用蛋白酶K消化，用高濃度甲酰胺使DNA—蛋白質(zhì)復(fù)合物解離，以及通過火棉膠袋除去殘存的蛋白酶等步驟，該方法費時。第三種方法用鹽酸胍裂解細胞，它所生成的DNA較小。旋轉(zhuǎn)離心柱提取DNA具有操作簡便、穩(wěn)定、儲存方便、重復(fù)可靠等特點，但是提取核酸的效率低。二氧化硅或硅藻吸附法適用于病毒及革蘭氏陰性菌的基因組核酸提取，但不能直接從革蘭氏陽性菌中提取核酸。微量全血核酸提取法中得使用氯仿等有害化合物，對操作者的健康有害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提取DNA的試劑及使用該試劑提取哺乳動物DNA的方法。提取DNA的試劑具有價格低廉，易獲得，無毒副作用的特點；使用該試劑提取哺乳動物DNA的方法具有操作簡便、快捷，適用范圍廣，提取的DNA純度高，不含有影響PCR反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，獲得的DNA片段大的特點。本發(fā)明的提取DNA的試劑由紅細胞裂解液、細胞混合液、細胞裂解液、溶液A、溶液B和溶液C成分組成，紅細胞裂解液由下列物質(zhì)按容量制成10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、10mmol/L NaCl、超純水1升，紅細胞裂解液的制作方法如下將所述的Tris-HCl、MgCl2、NaCl放入容器內(nèi)，加入超純水至1升混合均勻即可；細胞混合液由下列物質(zhì)按重量或容量制成8.0gNH4Cl、1.0g EDTA、0.1g KH2PO4，超純水＜1升，細胞混合液的制作方法如下將所述NH4Cl、EDTA、KH2PO4放入容器內(nèi)，加入超純水至1升，然后加入10mol/LNaOH調(diào)PH值為7.0，經(jīng)高壓滅菌即可。細胞混合液的終濃度為149mmol/L NH4Cl，2.6mmol/L EDTA，0.7mmol/L KH2PO4；細胞裂解液由下列物質(zhì)按容量制成50ml 2mol/L Tris，PH值為7.5，80ml 5mol/L NaCl，4ml500mmol/L EDTA、超純水＜1升，細胞裂解液的制作方法如下將所述的Tvis、NaCl、EDTA放入容器內(nèi)，再加入超純水至1升，以10mol/L NaOH調(diào)pH值為8.0(用塑料吸管加入約0.75ml)高壓滅菌即可；細胞裂解液的終濃度為100mmol/LTris-HCl，400mmol/L NaCl，2m mol/L EDTA。溶液A的制作方法如下在900ml超純水中溶解100g SDS，混合均勻，加超純水至1升混合即可。溶液B的制做方法如下在含有少量超純水(減少靜電)的容器中加入340.52g NaCl，再加超純水至1升搖晃混合均勻即可。溶液C的制做方法如下配制500ml 10∶1 TE，在容器中加入2.5ml 2mol/L TRIS-HCL，(pH值為7.5)和1ml 500mmol/L EDTA，加超純水至500ml混合均勻，高壓滅菌即可。本發(fā)明使用以上所述試劑提取哺乳動物外周紅細胞DNA的方法，其步驟如下(1)在管中加入0.5ml血和0.5ml紅細胞裂解液，上下振搖，靜止10分鐘至溶液呈透明的紅色，或者0.5ml血置于-80℃冰箱中5分鐘，(2)將管放入離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄去3/4上清，留下細胞層，(3)加入900μl細胞混和液，關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(4)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(5)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(6)加入20μl的溶液A，加入10μl的20mg/ml蛋白酶K，上下輕混15-20次，使混和充分，(7)56℃水浴2小時至溶液均勻化，稍離心，(8)加入105μl溶液B，搖晃15秒，靜置5-7分鐘，(9)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(10)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清，每管加入800μl濃度為100％乙醇，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(11)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(12)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，輕晃管五下，洗沉淀，(13)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉所有乙醇，(14)使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(15)加入50-60μl的溶液C，輕擊打管底混勻沉淀，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解，即獲得含有外周血細胞DNA的溶液。本發(fā)明使用以上所述試劑提取口腔上皮細胞DNA的方法，其步驟如下(1)在每個管中放入上皮細胞刷2個，加入900μl細胞混和液，(2)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(3)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(4)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(5)每管加入20μl的溶液A，加入10μl濃度為20mg/ml蛋白酶K，(6)上下輕混15-20次，使混和充分，(7)56℃水浴2小時～18小時至溶液均勻化，(8)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，用鑷子夾住上皮細胞刷，擠出水分，棄去上皮細胞刷，(9)每管加入105μl溶液B，(10)蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(11)靜置5-7分鐘，(12)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(13)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)將含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(15)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(16)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(17)打開蓋，勿擾沉淀，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(18)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，洗沉淀，(19)關(guān)蓋，輕晃管五下，沉淀可能浮起，(20)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(21)棄450μl乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(22)根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入50-60μl的溶液C，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有口腔上皮細胞DNA的溶液。本發(fā)明使用以上所述試劑提取哺乳動物羊水培養(yǎng)細胞DNA的方法，其步驟如下(1)取培養(yǎng)后的羊水棄大部分上清，(2)用細胞掛器掛下細胞，用塑料吸管吸入1.5ml置于離心管中，(3)離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，棄上清，留100-200μl，(4)用PBS緩沖液洗細胞沉淀兩次，每次加入1ml PBS緩沖液，渦旋混勻，14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄上清，(5)加入900μl細胞混和液，(6)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(7)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl的溶液A和10μl濃度為20mg/ml蛋白酶K，關(guān)蓋，上下輕混15-20次，使混和充分，(9)56℃水浴2小時～18小時至溶液均勻化，稍離心，(10)每管加入105μl溶液B，(11)蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(12)靜置5-7分鐘，(13)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(14)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清加入第二管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(15)棄去含蛋白沉淀的管，(16)將含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(17)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(18)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，洗沉淀，(20)關(guān)蓋，輕晃管五下，沉淀可能浮起，(21)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(22)棄450μl乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入50-60μl的溶液C，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有羊水培養(yǎng)細胞DNA的溶液。本發(fā)明使用以上所述的試劑提取哺乳動物絨毛DNA的方法，其步驟如下(1)取絨毛5mg在15ml離心管中2000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，棄上清，留1ml，(2)將細胞沉淀吸入1.5ml離心管中，離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，(3)棄上清，留100-200μl，(4)加入900μl細胞混和液，(5)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(6)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(7)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl的溶液A，10μl20mg/ml蛋白酶K，上下輕混15-20次，使混和充分，(9)56℃水浴2～18小時至溶液均勻化，稍離心，(10)每管加入105μl溶液B，蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(11)靜置5-7分鐘，(12)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(13)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清加入另一管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)棄去含蛋白沉淀的管，(15)向含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(16)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(17)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(18)去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，關(guān)蓋，輕晃管五下洗沉淀，(20)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄450μl乙醇，(21)吸棄剩余乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(22)根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入50-60μl的溶液C，輕擊打管底混勻沉淀，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有絨毛DNA的溶液。本發(fā)明提取DNA的試劑具有價格低廉，易獲得，沒有毒、副作用，解決了傳統(tǒng)的提取試劑對操作者有害的難題。適用于提取多種組織、細胞的DNA，適用范圍廣的優(yōu)點；本發(fā)明提取DNA的方法具有提取操作簡便、快捷，省去了傳統(tǒng)提取方法繁雜的操作程序。所獲得的DNA片段大，可應(yīng)用于構(gòu)建基因組DNA文庫及PCR反應(yīng)等各種分子生物學(xué)試驗。DNA純度高，不含有影響PCR反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)的優(yōu)點。從各種標(biāo)本中提取的DNA預(yù)期濃度范圍見下表標(biāo)本種類濃度范圍 平均濃度全血12-48μg/ml 33μg/ml口腔上皮細胞4-12μg/ml 7μg/ml羊水培養(yǎng)細胞46-99μg/ml 76μg/ml絨毛50-105μg/ml 85μg/ml
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的提取DNA的試劑由紅細胞裂解液、細胞混合液、細胞裂解液、溶液A、溶液B和溶液C成分組成，紅細胞裂解液由下列物質(zhì)按容量制成10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、10mmol/L NaCl、超純水1升，紅細胞裂解液的制作方法如下將所述的Tris-HCl、MgCl2、NaCl放入容器內(nèi)，加入超純水至1升混合均勻即可；細胞混合液由下列物質(zhì)按重量或容量制成8.0g NH4Cl、1.0gEDTA、0.1g KH2PO4，超純水＜1升，細胞混合液的制作方法如下將所述NH4Cl、EDTA、KH2PO4放入容器內(nèi)，加入超純水至1升，然后加入10mol/LnaOH，調(diào)PH值為7.0，經(jīng)高壓滅菌即可。細胞混合液的終濃度為149mmol/L NH4Cl，2.6mmol/L EDTA，0.7mmol/LKH2PO4；細胞裂解液由下列物質(zhì)按容量制成50ml 2mol/L Tris，PH值為7.5，80ml 5mol/L NaCl，4ml 500mmol/L EDTA、超純水＜1升，細胞裂解液的制作方法如下將所述的Tris、NaCl、EDTA放入容器內(nèi)，再加入超純水至1升，以10mol/LNaOH調(diào)pH值為8.0(用塑料吸管加入約0.75ml)高壓滅菌即可；細胞裂解液的終濃度為100mmol/LTris-HCl，400mmol/L NaCl，2m mol/LEDTA。溶液A的制作方法如下在900ml超純水中溶解100g SDS，混合均勻，加超純水至1升混合即可。溶液B的制做方法如下在含有少量超純水(減少靜電)的容器中加入340.52g NaCl，再加超純水至1升搖晃混合均勻即可。溶液C的制做方法如下配制500ml 10∶1 TE，在容器中加入2.5ml 2mol/LTRIS-HCL，(pH值為7.5)和1ml 500mmol/L EDTA，加超純水至500ml混合均勻，高壓滅菌即可。
具體實施例方式
二本實施方式使用實施方式一所述的提取DNA的試劑，提取哺乳動物外周血細胞DNA的方法其步驟如下(1)在管中加入0.5ml血和0.5ml紅細胞裂解液，上下振搖，靜止10分鐘至溶液呈透明的紅色，或者0.5ml血置于-80℃冰箱中5分鐘，(2)將管放入離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄去3/4上清，留下細胞層，(3)加入900μl細胞混和液，關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(4)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(5)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(6)加入20μl溶液A，10μl 20mg/ml蛋白酶K，上下輕混15-20次，使混和充分，(7)56℃水浴2小時至溶液均勻化，稍離心，(8)加入105μl溶液B，搖晃15秒，靜置5-7分鐘，(9)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(10)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清，每管加入800μl濃度為100％乙醇，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(11)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉約1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(12)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，輕晃管五下，洗沉淀，(13)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉所有乙醇，(14)使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(15)加入適量的溶液C(約50-60μl)，輕擊打管底混勻沉淀，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解，即獲得含有外周血細胞DNA的溶液。
具體實施例方式
三本實施方式使用實施方式一所述的提取哺乳動物DNA的試劑提取口腔上皮細胞DNA的方法，其步驟如下(1)在每個管中放相應(yīng)的上皮細胞刷2個，加入900μl細胞混和液，(2)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(3)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(4)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(5)每管加入20μl溶液A，加入10μl濃度為20mg/ml蛋白酶K，(6)上下輕混15-20次，使混和充分，(7)56℃水浴2小時～18小時至溶液均勻化，(8)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，用鑷子夾住上皮細胞刷，擠出水分，棄去上皮細胞刷，(9)每管加入105μl溶液B，(10)蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(11)靜置5-7分鐘，(12)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(13)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清(約400μl)，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)將含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(15)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(16)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(17)打開蓋，勿擾沉淀，去掉約1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(18)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，洗沉淀，(19)關(guān)蓋，輕晃管五下，沉淀可能浮起，(20)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(21)棄約450μl乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(22)根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入合適量的溶液C(約50-60μl)，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有口腔上皮細胞DNA的溶液。
具體實施例方式
四本實施方式使用實施方式一所述的提取DNA的試劑提取哺乳動物羊水培養(yǎng)細胞DNA的方法，其步驟如下(1)取培養(yǎng)后的羊水棄大部分上清，(2)用細胞掛器掛下細胞，用塑料吸管吸入1.5ml置于離心管中，(3)離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，棄上清，留約100-200μl，(4)用PBS緩沖液洗細胞沉淀兩次，每次加入1ml PBS緩沖液，渦旋混勻，14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄上清，(5)加入900μl細胞混和液，(6)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(7)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl溶液A，10μl濃度為20mg/ml蛋白酶K，關(guān)蓋，上下輕混15-20次，使混和充分，(9)56℃水浴2小時～18小時至溶液均勻化，稍離心，(10)每管加入105μl溶液B，(11)蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(12)靜置5-7分鐘，(13)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(14)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清(約400μl)加入第二管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(15)棄去含蛋白沉淀的管，(16)將含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(17)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(18)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉約1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，洗沉淀，(20)關(guān)蓋，輕晃管五下，沉淀可能浮起，(21)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(22)棄450μl乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入合適量的溶液C(50-60μl)，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有羊水培養(yǎng)細胞DNA的溶液。
具體實施例方式
五本實施方式使用實施方式一所述的提取DNA的試劑提取哺乳動物絨毛DNA的方法，其步驟如下(1)取絨毛約5mg在15ml離心管中2000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，棄上清，留約1ml，(2)將細胞沉淀吸入1.5ml離心管中，離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，(3)棄上清，留約100-200μl，(4)加入900μl細胞混和液，(5)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(6)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(7)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl溶液A，10μl20mg/ml蛋白酶K，上下輕混15-20次，使混和充分，(9)56℃水浴2小時～18小時至溶液均勻化，稍離心，(10)每管加入105μl溶液B，蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(11)靜置5-7分鐘，(12)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(13)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清(400μl)加入另一管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)棄去含蛋白沉淀的管，(15)向含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(16)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(17)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(18)去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，關(guān)蓋，輕晃管五下洗沉淀，(20)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄450μl乙醇，(21)吸棄剩余乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(22)根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入合適量的溶液C(50-60μl)，輕擊打管底混勻沉淀，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有絨毛DNA的溶液。
權(quán)利要求
1.一種提取DNA的試劑，其特征在于它由紅細胞裂解液、細胞混合液、細胞裂解液、溶液A、溶液B和溶液C成分組成，紅細胞裂解液由下列物質(zhì)按容量制成10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L MgCl2、10mmol/L NaCl、超純水1升；細胞混合液由下列物質(zhì)按重量或容量制成8.0g NH4Cl、1.0g EDTA、0.1g KH2PO4，超純水＜1升，細胞裂解液由下列物質(zhì)按容量制成每升超純水中含50ml 2mol/L Tris，PH值，7.5，80ml 5mol/L NaCl，4ml 500mmol/L EDTA、超純水＜1升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取DNA的試劑，其特征在于細胞混合液的終濃度為149mmol/L NH4Cl，2.6mmol/L EDTA，0.7mmol/L KH2PO4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取DNA的試劑，其特征在于細胞裂解液的終濃度為100mmol/LTris-HCl，400mmol/L NaCl，2m mol/L EDTA。
4.使用權(quán)利要求1所述的試劑提取哺乳動物外周紅細胞DNA的方法，其特征在于其步驟如下(1)在管中加入0.5ml血和0.5ml紅細胞裂解液，上下振搖，靜止10分鐘至溶液呈透明的紅色，或者0.5ml血置于-80℃冰箱中5分鐘，(2)將管放入離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄去3/4上清，留下細胞層，(3)加入900μl細胞混和液，關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(4)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(5)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(6)加入20μl的溶液A，加入10μl的20mg/ml蛋白酶K，上下輕混15-20次，使混和充分，(7)56℃水浴2小時至溶液均勻化，稍離心，(8)加入105μl溶液B，搖晃15秒，靜置5-7分鐘，(9)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(10)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清，每管加入800μl濃度為100％乙醇，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(11)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(12)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，輕晃管五下，洗沉淀，(13)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉所有乙醇，(14)使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(15)加入50-60μl的溶液C，輕擊打管底混勻沉淀，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解，即獲得含有外周血細胞DNA的溶液。
5.使用權(quán)利要求1所述的試劑提取哺乳動物口腔上皮細胞DNA的方法，其特征在于其步驟如下(1)在每個管中放入上皮細胞刷2個，加入900μl細胞混和液，(2)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(3)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(4)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(5)每管加入20μl的溶液A，加入10μl濃度為20mg/ml蛋白酶K，(6)上下輕混15-20次，使混和充分，(7)56℃水浴2小時～18小時至溶液均勻化，(8)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，用鑷子夾住上皮細胞刷，擠出水分，棄去上皮細胞刷，(9)每管加入105μl溶液B，(10)蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(11)靜置5-7分鐘，(12)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(13)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)將含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(15)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(16)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(17)打開蓋，勿擾沉淀，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(18)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，洗沉淀，(19)關(guān)蓋，輕晃管五下，沉淀可能浮起，(20)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(21)棄450μl乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(22)根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入50-60μl的溶液C，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有口腔上皮細胞DNA的溶液。
6.使用權(quán)利要求1所述的試劑提取哺乳動物羊水培養(yǎng)細胞DNA的方法，其特征在于其步驟如下(1)取培養(yǎng)后的羊水棄大部分上清，(2)用細胞掛器掛下細胞，用塑料吸管吸入1.5ml置于離心管中，(3)離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，棄上清，留100-200μ1，(4)用PBS緩沖液洗細胞沉淀兩次，每次加入1ml PBS緩沖液，渦旋混勻，14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄上清，(5)加入900μl細胞混和液，(6)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去上清，(7)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl的溶液A和10μl濃度為20mg/ml蛋白酶K，關(guān)蓋，上下輕混15-20次，使混和充分，(9)56℃水浴2小時～18小時至溶液均勻化，稍離心，(10)每管加入105μl溶液B，(11)蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(12)靜置5-7分鐘，(13)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(14)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清加入第二管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(15)棄去含蛋白沉淀的管，(16)將含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(17)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(18)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，洗沉淀，(20)關(guān)蓋，輕晃管五下，沉淀可能浮起，(21)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(22)棄450μl乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入50-60μl的溶液C，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有羊水培養(yǎng)細胞DNA的溶液。
7.使用權(quán)利要求1所述的試劑提取哺乳動物絨毛DNA的方法，其特征在于其步驟如下(1)取絨毛5mg在15ml離心管中2000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘，棄上清，留1ml，(2)將細胞沉淀吸入1.5ml離心管中，離心機中14000轉(zhuǎn)/min離心2分鐘，(3)棄上清，留100-200μl，(4)加入900μl細胞混和液，(5)關(guān)蓋，顛倒混勻7-10分鐘，(6)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(7)加入300μl細胞裂解液，上下吸打，破碎沉淀，(8)每管加入20μl的溶液A，10μl20mg/ml蛋白酶K，上下輕混15-20次，使混和充分，(9)56℃水浴2～18小時至溶液均勻化，稍離心，(10)每管加入105μl溶液B，蓋上蓋子，劇烈搖晃15秒，(11)靜置5-7分鐘，(12)標(biāo)本14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，如果分界不清，再離心1-3分鐘，(13)從標(biāo)本管中穿過泡沫層，吸出含DNA的上清加入另一管中，注意不要吸出蛋白沉淀，(14)棄去含蛋白沉淀的管，(15)向含上清的管加入800μl濃度為100％乙醇，(16)蓋上蓋子，輕混至有線狀DNA沉淀出現(xiàn)，(17)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，(18)去掉1000μl乙醇，注意不能碰沉淀，(19)每管中加入500μl濃度為70％乙醇，關(guān)蓋，輕晃管五下洗沉淀，(20)14000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄450μl乙醇，(21)吸棄剩余乙醇，使DNA沉淀氣干，至沉淀邊緣清晰，(22)根據(jù)DNA沉淀的大小和密度，加入50-60μl的溶液C，輕擊打管底混勻沉淀，56℃水浴2小時或室溫使沉淀溶解即獲得含有絨毛DNA的溶液。
全文摘要
提取DNA的試劑及使用該試劑提取哺乳動物DNA的方法，它涉及DNA提取試劑的組分及使用該試劑哺乳動物提取DNA的方法。本發(fā)明紅細胞裂解液由下列物質(zhì)按容量制成10mmol/L Tris－HCl、5mmol/L MgCl
文檔編號C12P19/00GK1635134SQ20041004396
公開日2005年7月6日 申請日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者常東 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)