專利名稱：多枝檉柳脫水誘導(dǎo)蛋白rd22基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檉柳的脫水誘導(dǎo)蛋白基因。
背景技術(shù)：
目前，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物的抗性已經(jīng)成為共識(shí)，同時(shí)已經(jīng)有各種基因獲得專利的報(bào)道。檉柳抗旱、耐鹽能力極強(qiáng)，說(shuō)明其體內(nèi)有一系列抗逆能力強(qiáng)的基因。因此，是進(jìn)行抗性基因的良好材料。
進(jìn)行基因的克隆技術(shù)是要確定所要克隆的目的基因，然后通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)及EST分析、RT-PCR、酵母雙雜交等技術(shù)獲得所需基因的片段或全長(zhǎng)，對(duì)基因片段，則應(yīng)用RACE方法或cDNA文庫(kù)篩選方法獲得全長(zhǎng)基因。
目前，基因工程技術(shù)中，抗旱植物的基因種類及數(shù)量非常有限，缺乏從高抗旱木本植物中克隆的基因；由于多數(shù)抗旱基因都是從非抗逆植物中克隆獲得，如擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)等植物中獲得，非抗旱植物的抗鹽相關(guān)基因顯然不可能具有強(qiáng)的抗鹽性；而且，絕大多數(shù)抗旱相關(guān)基因是來(lái)自于草本植物、微生物等，由于它們與木本植物間的遺傳差異，這些基因在木本植物中未必能十分有效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆出一種抗鹽能力極強(qiáng)的木本植物檉柳的一種鹽、旱脅迫應(yīng)答基因-多枝檉柳(Tamarix ramosissima)脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因，這種抗逆相關(guān)基因可以用于科研與生產(chǎn)中，用于其詳細(xì)的抗性機(jī)理等方面的研究，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)培育抗逆植物新品種。本發(fā)明的多枝檉柳脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因具有如序列表所表示的編碼區(qū)核酸及氨基酸序列。檉柳廣泛分布于我國(guó)西北地區(qū)的干旱、鹽漬化荒漠中，是荒漠地區(qū)鹽漬化沙地上良好的固沙造林樹種，具有強(qiáng)的抗鹽、旱脅迫，耐高溫等特性(張道遠(yuǎn).張娟.譚敦炎.潘伯榮.國(guó)產(chǎn)檉柳科3屬6種植物營(yíng)養(yǎng)枝的解剖觀察，西北植物學(xué)報(bào)，2003，23(3)382～388)，有強(qiáng)的泌鹽能力(張道遠(yuǎn).尹林克.潘伯榮.檉柳泌鹽腺結(jié)構(gòu)、功能及分泌機(jī)制研究進(jìn)展西北植物學(xué)報(bào)2003，23(1)190-194)，因此，它是一種進(jìn)行植物抗鹽研究的理想材料。本發(fā)明通過(guò)克隆出抗鹽能力極強(qiáng)的木本植物檉柳的一種鹽、旱脅迫應(yīng)答基因—脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因，然后，通過(guò)Northern檢測(cè)和基因芯片技術(shù)檢測(cè)其在旱或鹽脅迫下表達(dá)情況，分析它是否與抗旱或抗鹽相關(guān)。本發(fā)明的基因編碼區(qū)長(zhǎng)1170bp，編碼389個(gè)氨基酸。經(jīng)序列同源性BlastX分析表明，該基因與其它物種的脫水誘導(dǎo)蛋白基因在序列上有明顯差異，與金華中棉(Gossypium arboreum)脫水誘導(dǎo)蛋白序列同源性最高，為46％，這說(shuō)明該基因在序列上與其他物種的脫水誘導(dǎo)蛋白基因有明顯差異。應(yīng)用Northern和基因芯片技術(shù)研究脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因在旱脅迫后的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，旱脅迫下該基因表達(dá)量增加3倍以上，為抗旱相關(guān)基因。該基因具有明顯的抵抗干旱的能力，對(duì)植物起到脫水保護(hù)作用。構(gòu)建植物表達(dá)載體ProkII中，轉(zhuǎn)化到煙草中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照相比具有明顯的抗旱效果，轉(zhuǎn)基因煙草可以在-45Kp左右的水勢(shì)下能夠正常生長(zhǎng)6天以上，而非轉(zhuǎn)基因煙草則出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象，說(shuō)明它有明顯的抗旱能力。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式是這樣實(shí)現(xiàn)的(一)提取檉柳的總RNAa、向離心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液(2％(w/v)CTAB，NaCl 1.4mol/L，四硼酸鈉0.025mol/L，pH＝9)和10％(V/V)β-巰基乙醇得到提取液，65℃水浴鍋中預(yù)熱5分鐘；b、將檉柳材料用液氮冷卻研磨，加入到提取液中，混勻，65℃水浴10分鐘；c、加入等體積的Tris酚/氯仿混合液，12000g離心5分鐘，取上清液，重復(fù)酚/氯仿抽提一次；d、向上清液中加入等體積氯仿，12000g離心5分鐘，取上清，加入終濃度為2mol/L的LiCl，冰浴放置3小時(shí)；e、15000g，4℃離心15分鐘，棄上清，用70％乙醇清洗沉淀，溶于適量的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水中待用；f、用Promega公司的mRNA分離試劑盒(PolyATtract mRNA IsolationSystem III)分離mRNA取mRNA 5ug用于構(gòu)建檉柳cDNA文庫(kù)，cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒為ZAP-cDNA Synthesis Kit and ZAP-cDNA GigapackIII GoldCloning Kit(Stratagene公司生產(chǎn)，其產(chǎn)品號(hào)為200450)，所建立的檉柳cDNA文庫(kù)滴度為7.2×105pfu，重組率為98％；g、用PCR法檢測(cè)文庫(kù)克隆插入片段長(zhǎng)度在1kb左右；(二)對(duì)文庫(kù)克隆進(jìn)行測(cè)序
然后對(duì)文庫(kù)克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為T3引物，cDNA文庫(kù)克隆的測(cè)序儀為Amersham Pharmacia公司的MegaBACETM1000 DNA序列分析儀。通過(guò)對(duì)文庫(kù)克隆的Blast X分析獲得脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因的片段，該片段長(zhǎng)度為691bp，具有完整的3’端，但5’端不完整，序列如下＞脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22部分序列5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTTATTTAAGTAAACGAAAGTATCTTTTTATTCGCAAATGAAACGTACAGTAATATTATGCATCAGGCGAGTGTATATGACACGCGTATATGTCTGCCGTAGCGAAGCAAACGATACAAGCATCTTCATGTAGCAGTATAGTATAGTAGCTAGAGTACCGCTGCATACATTAATTCCACACAAGAAGTGTGGAGAGAAATTCAAAATACTAGTAGCTAGTGCATCAATCAAACAGCACCAAAATCAAGTGAACGCATGCATGGTGGAGAAATCCAACTCTGTAACTAGTAATGCGGCACCCACACAACATGATCTTGAGGAAGGAAGTGACACACGGGAACCGTCCCAGGTTCCACCTTAAGCACTTGAAAAGCCAAGTGCTTAGGATTCCACTCGGACGTATCCTTATGGCAGACGGCCTCAGCATTCACTTTCTTCCCATCCTTCTCACCTACCATCTCAACCTCGTACGAAGCCGTATTCCTCGTCTCGTGGCAGTAAAACACGGCATATGCATAATTCTGCTTGTGGCACACCACCGCATGATCGTCCTTGTTGTTGTTCTTTCTCACTCTCTTCATGGTATACTTTTGTGCCTCGCTTCCTTTCCCGGTGGTTACCTCAG 3’。
根據(jù)上面獲得的已知的基因序列設(shè)計(jì)5’RACE引物5’TACGAAGCCGTATTCCTCGTCTCGTGGC 3’，然后通過(guò)5’RACE技術(shù)獲得完整的基因。
用RACE試劑盒(RACE克隆試劑盒為SmartTMRACE cDNAAmplificationKit(BD Biosciences公司))進(jìn)行克隆全長(zhǎng)cDNA序列，用1μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體所用的試劑及操作步驟均嚴(yán)格參照按試劑盒說(shuō)明書，反轉(zhuǎn)錄后將反轉(zhuǎn)錄溶液用TE緩沖液(試劑盒提供)稀釋到100μL，PCR反應(yīng)體系嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書，PCR反應(yīng)使用改動(dòng)的降落PCR(touchdown PCR)程序，具體PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性1min，94℃ 6sec，72℃ 3min 6個(gè)循環(huán)，94℃6sec，70℃ 12sec 72℃ 3min 5個(gè)循環(huán)，94℃ 6sec，68℃ 12sec 72℃ 3min 30個(gè)循環(huán)，72℃保溫7min。擴(kuò)增后的片段與pMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Jm109，將插入片段與目的片段大小相符合的克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如下
5’GCTACTTTAGTACTACCATATACCACCACCAACTGTCAGCCACTAAAATTTCAGTGTTGTTCGATCTTATATCTTCAGAGCATAATTTTTCACCAATGGAGTTGCGTCTCCTACCAATCATCACCTTCTTCTCTGTGGTTCTTGTGGTTAGCCATGCGGCTGCATCACCTGAAGATTACTGGAAGAAAGTGCTGCCCAACACTCCTATGCCAGGAGCTGTCAGGGACTTTCTGCAACCTGCAGAATGGACCGAAGACAAGAGCACTTCTGTGGGAGTAGGCAAAGGCGGAGTTAATGTCGACACAGGCGGCGACAGACCCCAGGGCAAAGGCACCGACGTCAACGTTGGCCACGGCAACGTCGAGGTCCACACCAACAAACCTAACAAGGGCGGGGCAGACGTAAACGTAGGCCGAAAAGGCGGGGTGGGAGTGAATGCTGGAAAGGCCGGAAAAGGCGCCCAAGTCGGTGTTGGAAAGGGCGGAGTATCGGTCCACGCTGGACCGAAGAAAAAGCCCGTCGTTGTGGGAGTAAAGCCTACAAGTAACCCATTTATGTACAAATACGCAGCAACCGAGACCCAGCTTCATGACGACCCAAACGTTGCCTTGTTTTTCCGAGAGGAAGATCTTAAACCCGGTAAATCAATGAACCTCCACTTTATGAGGACCACCAACGAAGGGTCCACATTTCTAAGCCGCAAGGAGGCAGAATCGATCCCGTTCTCGACCCAAGAGATGCCAGAGATCCTAGCCCGGTATGACATCAGGCCCGAGTCCGAAGAGGCCCGAGTGATGAAGCACACGGTCGAGGACTGCGAAGACAAGGGAATCGAAGGAGAAGACAAGTACTGCGCCACTTCACTAGAAGGCATGGTAGACTACGCCGTATCAAAGCTAGGGAAACACGTCAAGGCTGGCTCTACTGAGGTAACCACCGGGAAAGGAAGCGAGGCACAAAAGTATACCATGAAGAGAGTGAGAAAGAACAACAACAAGGACGATCATGCGGTGGTGTGCCACAAGCAGAATTATGCATATGCCGTGTTTTACTGCCACGAGACGAGGAATACGGCTTCGTA 3’用NCBI的Align two sequences程序?qū)υ蛄泻蚏ACE獲得的序列進(jìn)行拼接，將拼接后應(yīng)用ORF FOUNDER尋找開放讀碼框，將開放讀碼區(qū)的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行BLASTP相似性比較，該基因編碼區(qū)長(zhǎng)1170bp，編碼389個(gè)氨基酸。經(jīng)序列同源性BlastX分析表明，該基因與其它物種的脫水誘導(dǎo)蛋白基因在序列上有明顯差異，與金華中棉(Gossypium arboreum)脫水誘導(dǎo)蛋白序列同源性最高，為46％，這說(shuō)明該基因在序列上與其他物種的脫水誘導(dǎo)蛋白基因有明顯差異。
應(yīng)用Northern和基因芯片技術(shù)研究脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因在旱脅迫后的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，旱脅迫下該基因表達(dá)量增加3倍以上，為抗旱相關(guān)基因。
<110>東北林業(yè)大學(xué)<120>多枝檉柳脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因<160>1<210>1<211>1170<212>DNA<213>多枝檉柳脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因編碼區(qū)cDNA序列<400>11 atggagttgcgtctcctaccaatcatcaccttcttctctgtggttM E L R L L P I I T F F S V V46 cttgtggttagccatgcggctgcatcacctgaagattactggaagL V V S H A A A S P E D Y W K91 aaagtgctgcccaacactcctatgccaggagctgtcagggactttK V L P N T P M P G A V R D F136 ctgcaacctgcagaatggaccgaagacaagagcacttctgtgggaL Q P A E W T E D K S T S V G181 gtaggcaaaggcggagttaatgtcgacacaggcggcgacagacccV G K G G V N V D T G G D R P226 cagggcaaaggcaccgacgtcaacgttggccacggcaacgtcgagQ G K G T D V N V G H G N V E271 gtccacaccaacaaacctaacaagggcggggcagacgtaaacgtaV H T N K P N K G G A D V N V316 ggccgaaaaggcggggtgggagtgaatgctggaaaggccggaaaaG R K G G V G V N A G K A G K361 ggcgcccaagtcggtgttggaaagggcggagtatcggtccacgctG A Q V G V G K G G V S V H A406 ggaccgaagaaaaagcccgtcgttgtgggagtaaagcctacaagtG P K K K P V V V G V K P T S
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權(quán)利要求
1.多枝檉柳脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因，其特征在于該基因的編碼區(qū)cDNA序列為5’atggagttgcgtctcctaccaatcatcaccttcttctctgtggttcttgtggttagccatgcggctgcatcacctgaagattactggaagaaagtgctgcccaacactcctatgccaggagctgtcagggactttctgcaacctgcagaatggaccgaagacaagagcacttctgtgggagtaggcaaaggcggagttaatgtcgacacaggcggcgacagaccccagggcaaaggcaccgacgtcaacgttggccacggcaacgtcgaggtccacaccaacaaacctaacaagggcggggcagacgtaaacgtaggccgaaaaggcggggtgggagtgaatgctggaaaggccggaaaaggcgcccaagtcggtgttggaaagggcggagtatcggtccacgctggaccgaagaaaaagcccgtcgttgtgggagtaaagcctacaagtaacccatttatgtacaaatacgcagcaaccgagacccagcttcatgacgacccaaacgttgccttgtttttccgagaggaagatcttaaacccggtaaatcaatgaacctccactttatgaggaccaccaacgaagggtccacatttctaagccgcaaggaggcagaatcgatcccgttctcgacccaagagatgccagagatcctagcccggtatgacatcaggcccgagtccgaagaggcccgagtgatgaagcacacggtcgaggactgcgaagacaagggaatcgaaggagaagacaagtactgcgccacttcactagaaggcatggtagactacgccgtatcaaagctagggaaacacgtcaaggctggctctactgaggtaaccaccgggaaaggaagcgaggcacaaaagtataccatgaagagagtgagaaagaacaacaacaaggacgatcatgcggtggtgtgccacaagcagaattatgcatatgccgtgttttactgccacgagacgaggaatacggcttcgtacgaggttgagatggtaggtgagaaggatgggaagaaagtgaatgctgaggccgtctgccataaggatacgtccgagtggaatcctaagcacttggcttttcaagtgcttaaggtggaacctgggacggttcccgtgtgtcacttccttcctcaagatcatgttgtgtgggtgccgcattactag 3’。
全文摘要
多枝檉柳脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因，它屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)克隆出抗鹽能力極強(qiáng)的木本植物檉柳的一種鹽、旱脅迫應(yīng)答基因—脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因，然后，通過(guò)Northern檢測(cè)和基因芯片技術(shù)檢測(cè)其在旱或鹽脅迫下表達(dá)情況，分析它是否與抗旱或抗鹽相關(guān)。本發(fā)明的基因編碼區(qū)長(zhǎng)1170bp，編碼389個(gè)氨基酸。經(jīng)序列同源性BlastX分析表明，該基因與其它物種的脫水誘導(dǎo)蛋白基因在序列上有明顯差異，與金華中棉脫水誘導(dǎo)蛋白序列同源性最高，為46％。應(yīng)用Northern和基因芯片技術(shù)研究脫水誘導(dǎo)蛋白R(shí)D22基因在旱脅迫后的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，旱脅迫下該基因表達(dá)量增加3倍以上，為抗旱相關(guān)基因。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1624131SQ20041004403
公開日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2004年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月10日
發(fā)明者楊傳平, 劉桂豐, 王玉成, 姜靜 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)