專利名稱：多功能抗癌重組腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗癌領(lǐng)域，描述一種多功能抗癌重組腺病毒。這種重組腺病毒能選擇性地在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、繁殖，高效表達(dá)外源性抗腫瘤蛋白，并殺死腫瘤細(xì)胞，而在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)基本上是非復(fù)制型的。本發(fā)明還提出了應(yīng)用這種重組腺病毒治療、預(yù)防腫瘤的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康與生命的常見多發(fā)病。全世界每年癌癥的新發(fā)病人數(shù)超過1000萬(癌癥患者人數(shù)超過4000萬)。癌癥已超過心腦血管疾病而成為人類致死的第一位原因。目前對(duì)惡性腫瘤的常規(guī)治療仍以手術(shù)，放療及化療為主，這種常規(guī)治療對(duì)極大多數(shù)腫瘤的治療效果很不理想。而對(duì)極大多數(shù)化療藥物而言，其治療指數(shù)仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故化療的治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制，脫發(fā)等。因此選擇性的殺傷腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的治療方案對(duì)腫瘤治療非常重要。
腫瘤基因治療是近年興起的治療惡性腫瘤方案的一種新方法。基因轉(zhuǎn)染方法可分為病毒法與非病毒法兩種。病毒法通常采用逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，單純瘡疹病毒及痘病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外具有較高的轉(zhuǎn)染率，但病毒滴度偏底，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染率較低，而且只能感染分裂期的細(xì)胞，同時(shí)具有整合至染色體內(nèi)，存在癌變的可能性的缺點(diǎn)。非病毒法包括脂質(zhì)體及基因槍等方法，其轉(zhuǎn)染基因表達(dá)時(shí)間較短，轉(zhuǎn)染率較低。
腺病毒是目前腫瘤基因治療中最常見的病毒載體，已廣泛地應(yīng)用于人體的基因治療方案中，它在體內(nèi)及體外均能有效轉(zhuǎn)染分裂及靜止細(xì)胞，無致癌性，并且有容易生產(chǎn)及純化的特點(diǎn)。腺病毒可以感染呼吸道，眼，胃腸道和膀胱，目前已鑒定出47個(gè)血清型。根據(jù)其血凝作用，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和G+C百分比，可將人腺病毒分為7個(gè)類型。腺病毒基因組含有11個(gè)基因，其中E1區(qū)在早期基因合成中是非常重要的。研究表明腺病毒E1A蛋白具有抗腫瘤作用，它能抑制原癌基因如HER-2/neu，P27/kipi，P21/waf1/cip1，P15/INK41等的轉(zhuǎn)錄，還能將腫瘤細(xì)胞變化為上皮類細(xì)胞，并防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。E1A基因還能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷制劑，如化療，放療的敏感性，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生依賴或非依賴p53狀況的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。E1B 19K蛋白是一類超強(qiáng)的細(xì)胞凋亡抑制劑，能抑制Bax，Bak，Nbk/Bik，F(xiàn)as，腫瘤壞死因子受體，腺病毒E1A，P53和TNF等所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，還能降低腺病毒E1A蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量。E1B 55k蛋白可結(jié)合P53腫瘤抑制蛋白，螯合或滅活P53蛋白。正常情況下，腺病毒主要在細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制，E1B區(qū)基因編碼合成55K蛋白可與宿主細(xì)胞中的P53蛋白結(jié)合，并使其失活從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使腺病毒得以復(fù)制。
美國(guó)專利5677178，Bischoff，J.R等，科學(xué)(Science)，274卷，373-376頁(yè)(1996)及Heise，C等，自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)3卷，639-645頁(yè)(1997)報(bào)道了應(yīng)用E1B 55K突變腺病毒(d1 1520)，也稱ONYX 015對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用為一類新型的抗腫瘤療法。腺病毒E1B區(qū)基因編碼合成55K蛋白可與宿主細(xì)胞中的P53蛋白結(jié)合，使其失活而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并使病毒得以復(fù)制。由于d11520或ONYX 015缺失功能性55kd蛋白，因此該腺病毒突變體能在p53功能缺陷型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，繁殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解或凋亡。而在正常細(xì)胞中卻不能自我復(fù)制，因此正常細(xì)胞與組織并不受影響。
目前ONYX-015在美國(guó)已進(jìn)入III期臨床，并取得了一定療效。然而作為一類抗腫瘤新藥，ONYX-015存在著以下幾個(gè)問題第一，ONYX-015的抗腫瘤效果不夠理想。由于ONYX-015缺乏E1B 55K蛋白，從而極大地降低了腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力，它在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力只有野生型腺病毒的10％左右，它對(duì)淺部腫瘤如頭頸癌有一定療效，而對(duì)深部腫瘤如肝癌，胰腺癌療效不佳。第二，ONYX-015對(duì)P53基因突變型的腫瘤有一定殺傷效力，但對(duì)p53基因正常型的腫瘤療效不佳。目前已知50％左右的腫瘤是p53基因缺陷型，另外50％左右的腫瘤是p53基因正常型，由此可預(yù)測(cè)，ONYX-015對(duì)大約50％左右的腫瘤沒有療效。第三，ONYX-015的臨床結(jié)果表明單獨(dú)使用ONYX-015很難治愈腫瘤，ONYX-015必須與化療藥物聯(lián)用，才能有較好的抗腫瘤療效。但聯(lián)合用藥會(huì)增加化療藥物的毒副反應(yīng)，如骨髓抑制、脫發(fā)等，給病人增加許多不必要痛苦。因此發(fā)展新一代的重組腺病毒，具有超強(qiáng)的、多功能抗癌效應(yīng)，并對(duì)P53基因缺陷型或p53基因正常型的腫瘤均有較強(qiáng)的殺傷力是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種多功能抗癌重組腺病毒，其特征在于這種重組腺病毒滅活能夠與細(xì)胞內(nèi)功能性腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合的E1B 55K病毒蛋白，并攜帶兩組外源性基因，在兩組外源性基因之間由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)有效連接，因此兩組外源性基因能被共轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，并由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制第二組外源性基因的翻譯。本發(fā)明所提供的重組腺病毒能夠在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制繁殖，產(chǎn)生細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)，并能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源性蛋白，最終殺死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)P53功能正常型的非腫瘤細(xì)胞基本無殺傷作用。另外，這種腺病毒攜帶的E3基因能增加腺病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)的最大耐受劑量，降低病毒對(duì)宿主所產(chǎn)生的毒副反應(yīng)。因此，此新型重組腺病毒的抗癌效應(yīng)和安全性均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)改進(jìn)的重組腺病毒。
本發(fā)明所述的重組腺病毒優(yōu)選地通過缺失突變滅活該病毒的E1B55K蛋白，缺失部分包括E1B啟動(dòng)子序列，E1B 55K基因序列，缺失部分也可為E1B 55K基因序列，但保留E1B啟動(dòng)子序列。重組腺病毒也可通過定點(diǎn)突變，和/或插入突變，和/或移碼突變滅活該病毒的E1B 55K蛋白。
另一方面，本發(fā)明所述重組腺病毒所攜帶的兩組外源性基因，它們所編碼的蛋白優(yōu)選地為一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)自殺基因產(chǎn)物，包括但不限于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，美國(guó)專利5393870或5391485；白介素2，美國(guó)專利4738927或5641665；白介素7，美國(guó)專利4965195或5328988，白介素12，美國(guó)專利5457038，α-腫瘤壞死因子，美國(guó)專利677063或5773582，γ-干擾素，美國(guó)專利4727138或4762791，單純皰疹病毒胸苷激酶基因產(chǎn)物(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨基酶基因產(chǎn)物(cytocine deaminase，CD)，美國(guó)專利5358866和5677178，或?yàn)閮蓚€(gè)細(xì)胞因子，或?yàn)閮蓚€(gè)細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物。重組腺病毒所攜帶的兩組外源性基因所編碼的蛋白也可為一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，或?yàn)橐粋€(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白。
本發(fā)明所述重組腺病毒所攜帶的兩組外源性基因，其中第一組外源性基因由外源性啟動(dòng)子，或內(nèi)源性腺病毒啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)，優(yōu)選的外源性啟動(dòng)子為病毒類啟動(dòng)子，例如CMV早期啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子；外源性基因也可由組織特異性啟動(dòng)子，例如前列腺特殊抗原啟動(dòng)子(美國(guó)專利5648478)驅(qū)動(dòng)；優(yōu)選的內(nèi)源性腺病毒啟動(dòng)子為內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子。第二組外源性基因由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制翻譯，并在第二組外源性基因下游任選地含有外源性聚腺苷酸結(jié)構(gòu)。
另一方面，本發(fā)明所述的重組腺病毒，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列有效連接兩組外源性基因，并控制第二組外源性基因的翻譯。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列優(yōu)選地選自腦心肌炎病毒(EMCV)，和/或微管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，和/或免疫球蛋白鏈結(jié)合蛋白(BiP)，和/或纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor2)，和/或丙型肝炎病毒(HCV)基因組。
另一方面，本發(fā)明所述的重組腺病毒，其中所述外源性基因可優(yōu)選地插入到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突變，和/或定點(diǎn)突變，和/或插入突變，和/或移碼突變部位，外源性基因也可插入到腺病毒E1A部位，和/或腺病毒E2部位，和/或腺病毒E3部位，和/或腺病毒E4部位。
另一方面，本發(fā)明所述的重組腺病毒含有E3基因。E3基因產(chǎn)物能增加腺病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)的最大耐受劑量，并降低病毒對(duì)宿主所產(chǎn)生的毒副反應(yīng)。
本發(fā)明還提供了另一種多功能抗癌重組腺病毒，其特征在于該病毒同時(shí)滅活能夠與細(xì)胞內(nèi)功能性腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合的E1B 55K病毒蛋白和能夠抑制細(xì)胞凋亡的E1B 19K病毒蛋白，并任選地?cái)y帶一組由外源性啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的外源性基因。這種重組腺病毒能在P53功能缺陷型或P53功能正常型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制繁殖，產(chǎn)生細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)，并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源性蛋白，最終殺死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)P53功能正常型的非腫瘤細(xì)胞基本無殺傷作用。
這種重組腺病毒優(yōu)選地通過缺失突變滅活該病毒的E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，缺失突變部分包括E1B啟動(dòng)子序列，E1B 19k基因序列和E1B 55K基因序列。這種重組腺病毒也能通過定點(diǎn)突變，和/或插入突變，和/或移碼突變滅活E1B 19K和E1B 55K蛋白。
另一方面，這種重組腺病毒攜帶的外源性基因所編碼的蛋白優(yōu)選地為細(xì)胞因子，包括但不限于粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；美國(guó)專利5393870或5391485；白介素2，美國(guó)專利4738927或5641665；白介素7，美國(guó)專利4965195或5328988；白介素12，美國(guó)專利5457038；α-腫瘤壞死因子，美國(guó)專利677063或5773582；γ-干擾素，美國(guó)專利4727138或4762791，或?yàn)榧?xì)胞自殺基因產(chǎn)物，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美國(guó)專利編號(hào)5358866和5677178，或?yàn)榧?xì)胞周期調(diào)控蛋白，包括但不限于p16，Arapet等，癌癥研究，551351-1354，1995，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白，包括但不限于腫瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，61791-1797，1991。
外源性基因優(yōu)選地由外源性病毒類啟動(dòng)子，例如CMV早期啟動(dòng)子，SV40早期啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)，外源性基因優(yōu)選地插入到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突變，和/或定點(diǎn)突變，和/或插入突變，和/或移碼突變部位。外源性基因也可插入到腺病毒E1A部位，和/或腺病毒E2部位，和/或腺病毒E3部位，和/或腺病毒E4部位。
另一方面，這種重組腺病毒含有E3基因。E3基因產(chǎn)物能增加腺病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)的最高耐受劑量，并降低病毒對(duì)宿主所產(chǎn)生的毒副反應(yīng)。
本發(fā)明的另一目的是提供選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的方法。該方法包括在感染的條件下，將殺死腫瘤有效量的重組腺病毒與含有腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞種群接觸，由此產(chǎn)生感染的細(xì)胞群，并在感染的細(xì)胞種群內(nèi)高效表達(dá)外源性抗腫瘤蛋白，最終殺死感染的腫瘤細(xì)胞。所述病毒不能編碼E1B19K蛋白和/或E1B 55K蛋白，并可進(jìn)一步包含一組，兩組，或兩組以上的外源性基因。
另一方面，本發(fā)明提供含有該重組腺病毒和化療藥物的藥物組合物。


圖1示出了重組腺病毒E1區(qū)基因圖譜，其中，1.野生型腺病毒；2.重組腺病毒△1651；3.重組腺病毒△1714；4.重組腺病毒△1651/GM-CSF；5.重組腺病毒△1714/GM-CSF；6.重組腺病毒△1651/TK；7.重組腺病毒△1714/TK；8.重組腺病毒△1651/GM-CSF/TK；9.重組腺病毒△1714/GM-CSF/TK；10.重組腺病毒△2251/GM-CSF/TK。
圖2是重組腺病毒高效GM-CSF。
圖3示出了藥物前體GCV能加強(qiáng)重組腺病毒對(duì)肝癌細(xì)胞的致病效應(yīng)。
圖4示出了重緩腺病毒在疥列腺癌動(dòng)物模型中的藥效實(shí)驗(yàn)。
圖5示出了藥物前體GCV和重組腺病毒和藥效實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明使用的專用術(shù)語名稱以及下述細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)和分子病毒學(xué)的實(shí)驗(yàn)室步驟，都是本領(lǐng)域中為人熟知和常用的。核酸重組、多核苷酸合成、病毒毒株的構(gòu)建、生產(chǎn)與增殖(包括能夠反式互補(bǔ)重組缺陷型病毒原種的細(xì)胞株)、細(xì)胞培養(yǎng)等均按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。一般技術(shù)及步驟均按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法，并參照綜合性參考文獻(xiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，Sambrook等編著(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；病毒學(xué)，第二版，F(xiàn)ields BN與Knipe DM編著(1990)RAVEN出版社，紐約。酶切反應(yīng)，DNA純化步驟及克隆等均根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書進(jìn)行。
除非有另外不同的定義，本文所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常所理解的一樣，任何與本文描述相似或相同的方法及材料均可用于本發(fā)明的實(shí)施例或?qū)嶒?yàn)。本文對(duì)以下術(shù)語予以定義，并對(duì)本發(fā)明中的優(yōu)選方法和材料加以描述。
重組腺病毒這一術(shù)語指經(jīng)人類DNA重組技術(shù)有意修飾后所產(chǎn)生的新的腺病毒基因組。本發(fā)明中的重組腺病毒優(yōu)選地選自人類腺病毒2型或者5型。最優(yōu)選的腺病毒選自人類腺病毒5型，也包括腺病毒2型和5型的嵌合體。
多功能抗癌重組腺病毒這一術(shù)語指這種重組腺病毒具有兩種或兩種以上的抗癌功能。例如本發(fā)明中的重組腺病毒除了腺病毒本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接溶癌作用外，重組腺病毒所攜帶的一組，或兩組，或兩組以上的外源性抗腫瘤基因，能選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，進(jìn)一步加強(qiáng)了腺病毒的抗腫瘤效果。本發(fā)明中的重組腺病毒所攜帶的外源性基因所編碼的蛋白優(yōu)選地為細(xì)胞因子和細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物。
外源性基因這一術(shù)語是指一段不同于腺病毒基因組的多核苷酸序列。外源性基因可以編碼，也可不編碼蛋白質(zhì)。本發(fā)明中的外源性基因所編碼的蛋白質(zhì)通常具有抗腫瘤效應(yīng)，優(yōu)選的外源性基因所編碼的蛋白為免疫細(xì)胞因子，細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白。
有效地連接這一術(shù)語指多核苷酸元件以功能性關(guān)系連接。例如，一個(gè)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果影響某一段基因序列的轉(zhuǎn)錄，它就是有效地與這段基因序列相連接。有效地連接所指的DNA序列通常是鄰接連接的。然而，增強(qiáng)子通常與啟動(dòng)子相隔幾千個(gè)堿基對(duì)而發(fā)揮功能，因此某些核苷酸元件雖不鄰接，但可以是有效地連接。
內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site or IRES)這一術(shù)語是指一段多核苷酸序列，它能夠促使內(nèi)部核糖體進(jìn)入到蛋白質(zhì)啟始密碼ATG位點(diǎn)，并引導(dǎo)帽獨(dú)立的蛋白翻譯過程。參照J(rèn)ackson RJ等生物研究趨勢(shì)(Trends Biochem Sci)，15(12)477～83，1990和Jackson RJ等RNA1(10)985～1000，1995。本發(fā)明中的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列包括任何能夠促進(jìn)內(nèi)部核糖體進(jìn)入到蛋白質(zhì)啟始密碼ATG，并引導(dǎo)帽獨(dú)立的蛋白翻譯的多核苷酸序列。本發(fā)明中的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)優(yōu)選地選自腦心肌炎病毒(EMCV)，微管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(Bip)，纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2，和丙型肝炎病毒(HCV)。
P53功能正常型這一術(shù)語是指細(xì)胞內(nèi)由P53基因編碼的多肽水平基本正常。P53多肽能夠結(jié)合野生型腺病毒2或5的E1B 55K蛋白。P53功能缺陷型是指通過突變，或通過P53表達(dá)量的減少或完全消失而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)功能型P53蛋白的缺失。另外，P53蛋白功能型缺陷也可以通過P53基因以外的遺傳物質(zhì)的改變，如通過P53亞細(xì)胞加工或定位異常的突變而導(dǎo)致P53功能的缺陷。
E1B啟動(dòng)子序列是指腺病毒基因組從1636至1701的多核苷酸序列，其中包括SP1結(jié)和位點(diǎn)和TATA盒序列。腺病毒E1B 19K和E1B 55K序列是指腺病毒基因組從1715至3509的多核苷酸序列。
滅活E1B 55K蛋白是指通過DNA重組技術(shù)修飾后使E1B 55K蛋白失去了與P53蛋白結(jié)合或滅活P53基因轉(zhuǎn)錄活性的能力。滅活E1B 55K蛋白可以通過缺失突變消除E1B 55K蛋白與P53蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，也可通過定點(diǎn)突變、或插入突變、或移碼突變滅活E1B 55K蛋白活性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，重組腺病毒通過缺失突變切除腺病毒基因組2251至3509的多核苷酸序列以滅活E1B 55K蛋白。
同時(shí)滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白是指通過DNA重組技術(shù)修飾后使腺病毒的E1B 55K蛋白失去了與P53蛋白結(jié)合或滅活P53基因轉(zhuǎn)錄活性的能力，同時(shí)也使E1B 19K蛋白失去了能夠抑制細(xì)胞凋亡的能力。重組腺病毒可以通過缺失突變，和/或定點(diǎn)突變，和/或插入突變，和/或移碼突變滅活E1B 55K蛋白和E1B 19K蛋白活性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方法中，重組腺病毒通過缺失突變切除腺病毒基因組1651至2591多核苷酸序列，包括E1B啟動(dòng)子序列，E1B 19K基因序列和5′端E1B 55K基因序列，并插入多核苷酸GGTTAATTCCGCTCGAACGG序列，以滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，重組腺病毒通過缺失腺病毒基因組1714至2591多核苷酸序列，包括E1B 19K基因序列和5′端E1B 55K基因序列，并插入多核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列，以滅活E1B 19K蛋白和E1B55K蛋白。
外源性啟動(dòng)子是指一段不同于腺病毒基因組的DNA序列，這種DNA序列能調(diào)控與其有效連接的另一段基因組的轉(zhuǎn)錄與翻譯。本發(fā)明中的外源性啟動(dòng)子包括但不限于病毒類啟動(dòng)子，如CMV早期啟動(dòng)子，SV40啟動(dòng)子，細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)子，如α-延長(zhǎng)因子啟動(dòng)子，組織特異性啟動(dòng)子，如平滑肌特異性啟動(dòng)子，胰臟特異性啟動(dòng)子，Palmite等(1987)細(xì)胞50435；肝臟特異性啟動(dòng)子Rovet等(1992)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)，26720765，Lemaigne等(1993)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)，26819896，前列腺特異性啟動(dòng)子(美國(guó)專利5,698,443)；腫瘤特異性啟動(dòng)子，如甲胎蛋白啟動(dòng)子，胳氨酸酶啟動(dòng)子。腫瘤特異性啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈激活狀態(tài)，而在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈非激活狀態(tài)?？烧T導(dǎo)型啟動(dòng)子是指在化學(xué)刺激或溫度改變等外來刺激情況下，啟動(dòng)子呈激活狀態(tài)，并能調(diào)控與其功能性相連的基因組的轉(zhuǎn)錄與翻譯。參照Yoshida和Hamada(1997)生化與生物物理研究通訊(Biochem Biophys Res Comm)，230426～430；Iida等(1996)病毒學(xué)雜志(J Virol)，70(9)6054～6059；Hwang等(1997)病毒學(xué)雜志(J Virol)，71(9)7128～7131；Lee等(1997)分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell Biol)17(9)5097～5105?？烧T導(dǎo)型啟動(dòng)子包括X光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如XRE啟動(dòng)子[Boothman等放射學(xué)研究(Radiation Reseach)138(增訂刊1)S68～71]，UV誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[Garnier和Cole，(1998)分子微生物學(xué)(Mol Microbiol)，2607～614]。本發(fā)明優(yōu)選的外源型啟動(dòng)子為病毒類啟動(dòng)子如CMV早期啟動(dòng)子，或組織特異啟動(dòng)子，如前列腺特異性啟動(dòng)子。
內(nèi)源性腺病毒啟動(dòng)子是指一段來源于腺病毒基因組的DNA序列，它能調(diào)控與其有效連接的另一組DNA序列的轉(zhuǎn)錄與翻譯。內(nèi)源性腺病毒啟動(dòng)子包括早期啟動(dòng)子E1A啟動(dòng)子、E1B啟動(dòng)子、E3啟動(dòng)子、E4啟動(dòng)子和主要晚期啟動(dòng)子。本發(fā)明優(yōu)選的內(nèi)源性腺病毒啟動(dòng)子是內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子。
多功能抗癌重組腺病毒的構(gòu)建本發(fā)明提供了一種多功能抗癌重組腺病毒，這種腺病毒同時(shí)滅活能夠與細(xì)胞內(nèi)功能性腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合的E1B 55K病毒蛋白和能夠抑制細(xì)胞凋亡的E1B 19K病毒蛋白，但攜帶兩組編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因，并通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)有效地連接，因此這兩組外源性基因能被共轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，并由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制第二組外源性基因的翻譯。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，重組腺病毒通過缺失突變滅活E1B19K蛋白和E1B 55K蛋白。缺失部分包括E1B啟動(dòng)子序列，E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，并在E1B基因缺失突變部位插入新的酶切位點(diǎn)。通過新的酶切位點(diǎn)，該重組腺病毒能攜帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。
為了獲得上述重組腺病毒，首先優(yōu)選地以pXC-1質(zhì)粒(從MicrobixBiosystems公司購(gòu)得)作為啟始材料，構(gòu)建缺失E1B基因的腺病毒左端質(zhì)粒。有關(guān)質(zhì)粒pXC-1的資料可以參照由Microbix Biosytems出版的“Gene Transfer with Adenovirus Vectors”一文。除了質(zhì)粒pXC-1外，任何從pXC-1衍生出來的腺病毒左端質(zhì)粒，或任何含有腺病毒5’端反向末端重復(fù)序列(ITR)、腺病毒包裝信號(hào)，E1A增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、和聚腺苷酸信號(hào)以及來自于腺病毒基因組的一段DNA片段所組成的腺病毒載體均可用于構(gòu)建本發(fā)明所述的重組腺病毒。
為了構(gòu)建缺失E1B 19K基因和55K基因的腺病毒左端質(zhì)粒，采用PCR方法從質(zhì)粒pXC-1上優(yōu)選地切除nt1651至2591的DNA序列。并在缺失突變部位插入新的酶切位點(diǎn)PacI和XhoI，獲得新的質(zhì)粒pXC-Δ1651。質(zhì)粒pXC-Δ1651缺失內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列，并同時(shí)滅活E1B19K蛋白和E1B 55K蛋白。E1B基因缺失部分也可包括nt1636至3509之間的任意一段DNA序列，并通過此缺失突變同時(shí)滅活腺病毒E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。
質(zhì)粒pXC-Δ1651能攜帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。優(yōu)選外源性基因所編碼的抗腫瘤蛋白為免疫細(xì)胞因子，例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，美國(guó)專利5393870或5391485，白介素2，美國(guó)專利4738927或5641665，白介素7，美國(guó)專利4965195或5328988，白介素12，美國(guó)專利5457038，α-腫瘤壞死因子，美國(guó)專利677063或5773582，γ-干擾素，美國(guó)專利4727138或4762791；細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物，例如單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美國(guó)專利5358866和5677178；細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，例如P16，Arapet等，癌癥研究，551351-1354，1995；細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白，例如腫瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，61791-1797，1991。優(yōu)選的兩組外源性基因所編碼的蛋白分別為一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)自殺基因產(chǎn)物，兩個(gè)細(xì)胞因子，兩個(gè)細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物，一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白，或上述蛋白的任意組合。
用于控制上述外源性基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的啟動(dòng)子為外源性啟動(dòng)子，優(yōu)選地為外源性病毒類啟動(dòng)子，如CMV早期啟動(dòng)子。然而組織特異性啟動(dòng)子如前列腺特殊抗原啟動(dòng)子也可用于控制外源性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。
上述重組腺病毒載體所攜帶的兩組或兩組以上外源性基因優(yōu)選地通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)有效地連接。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)是一段特殊的DNA序列，它能通過啟始密碼(通常為AUG)，啟動(dòng)一段含有雙基因或多基因(編碼兩組或多組蛋白質(zhì))的RNA轉(zhuǎn)錄體的翻譯過程。因此通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)有效連接的兩組或多組基因組能被共轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，并通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制雙基因或多組基因的翻譯。本發(fā)明所述的重組腺病毒，其中所包含的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)優(yōu)選地選自腦心肌炎病毒(EMCV)，微管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，免疫球蛋白鏈結(jié)合蛋白(BiP)，纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor2)和丙型肝炎病毒(HCV)基因組。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，重組腺病毒通過缺失突變同時(shí)滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。缺失部分為E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，但保留E1B啟動(dòng)子序列，并在E1B基因缺失突變部位插入新的酶切位點(diǎn)。通過新的酶切位點(diǎn)，該病毒能任選地?cái)y帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。
為了獲得上述重組腺病毒，優(yōu)選地以質(zhì)粒pXC-1作為啟始材料，構(gòu)建缺失E1B 19K和55K基因的腺病毒左端質(zhì)粒pXC-Δ1714。pXC-Δ1714缺失nt1714-2591的DNA序列，缺失部分為E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，但保留E1B啟動(dòng)子序列，并在E1B基因缺失突變部位插入新的酶切位點(diǎn)PacI和XhoI。質(zhì)粒pXC-Δ1714還能攜帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。優(yōu)選外源性基因所編碼的抗腫瘤蛋白為免疫細(xì)胞因子，例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，美國(guó)專利5393870或5391485，白介素2，美國(guó)專利4738927或5641665，白介素7，美國(guó)專利4965195或5328988，白介素12，美國(guó)專利5457038，α-腫瘤壞死因子，美國(guó)專利677063或5773582，γ-干擾素，美國(guó)專利4727138或4762791，細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物，例如單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美國(guó)專利5358866和5677178，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，例如P16，Arapet等，癌癥研究，551351-1354，1995，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白，例如腫瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，61791-1797，1991。優(yōu)選的兩組外源性基因所編碼的蛋白分別為一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)自殺基因產(chǎn)物，兩個(gè)細(xì)胞因子，兩個(gè)細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物， 一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白，或上述蛋白的任意組合。
用于控制上述外源性基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的啟動(dòng)子為外源性啟動(dòng)子，優(yōu)選地啟動(dòng)子為外源性病毒類啟動(dòng)子，例如CMV早期啟動(dòng)子。然而組織特異性啟動(dòng)子，例如前列腺特殊抗原啟動(dòng)子，或內(nèi)源性腺病毒啟動(dòng)子，如內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子可用于控制上述重組腺病毒攜帶的兩組，或兩組以上外源性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。在外源性基因之間由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)有效連接，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)優(yōu)選地選自腦心肌炎病毒(EMCV)，微管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，免疫球蛋白鏈結(jié)合蛋白(BiP)，纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor2)和丙型肝炎病毒(HCV)基因組。
內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子位于腺病毒基因組nt1636至1701，含有與SP1具有高度親和力的結(jié)合位點(diǎn)和TATA盒。E1B啟動(dòng)子能調(diào)控至少4條mRNA的轉(zhuǎn)錄，包括22S、14.5S、14S和13S，其中22S和13S編碼兩組最主要的E1B蛋白-E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。由于E1B啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒早期蛋白的合成，當(dāng)腺病毒進(jìn)入感染晚期時(shí)，E1B啟動(dòng)子的活性被抑制，主要晚期啟動(dòng)子的活性被激活，晚期蛋白如腺病毒殼蛋白和其他結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)量大幅增加。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列，E1B 19K基因和E1B 55K基因被切除，由外源性超強(qiáng)啟動(dòng)子如CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控的外源性基因被插入到E1B基因缺失突變部分，這樣在CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控下，外源性基因能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)持續(xù)高效地表達(dá)抗腫瘤蛋白，極大地了加強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，腺病毒的內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列被保留，E1B 19K基因和E1B 55K基因被切除，外源性基因被插入到E1B基因缺失突變部位，并由外源性病毒類啟動(dòng)子如CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控外源性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。然而，由于E1B啟動(dòng)子序列與CMV早期啟動(dòng)子序列相鄰連接，兩者之間有可能互相作用而影響或降低外源性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。外源性抗腫瘤蛋白基因也可由內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子調(diào)控，然而當(dāng)腺病毒進(jìn)入感染晚期時(shí)，E1B啟動(dòng)子的活性被仰制，外源性抗腫瘤蛋白的表達(dá)量會(huì)明顯降低從而影響其抗腫瘤效應(yīng)。
內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)能將兩組或兩組以上編碼蛋白的基因組有效連接，通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)將這些基因組共轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，并在翻譯水平上控制基因組所編碼蛋白的表達(dá)。目前已知腫瘤的發(fā)生、演變過程是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，需要多種因素，通過多種途徑同時(shí)作用才能將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫細(xì)胞。單一療法，如化療，或放療很難治愈腫瘤。而許多抗癌藥物具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，聯(lián)合用藥已成為腫瘤治療的一種趨勢(shì)。目前已知許多抗腫瘤蛋白具有協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重組腺病毒所攜帶的兩組或兩組以上抗腫瘤蛋白基因通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)有效連接，因此，兩組或兩組以上抗腫瘤蛋白能同時(shí)在同一腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效、持續(xù)表達(dá)，加上重組腺病毒本身的直接溶癌作用，這樣可極大地加強(qiáng)了抗腫瘤效應(yīng)。
外源性基因表達(dá)盒包括外源性啟動(dòng)子序列和外源性基因序列(包含一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因，通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)有效相連)，并任選地含有外源性聚腺苷酸信號(hào)，可優(yōu)選地連接到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突變，或定點(diǎn)突變，或移碼突變部位。然而外源性基因表達(dá)盒也能插入到腺病毒E1A部位，或E3部位，或E4部位。
優(yōu)選的外源性抗腫瘤基因?yàn)榱＜?xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，或HSV-TK基因。它們分別通過PacI位點(diǎn)被插入到pXC-Δ1651或pXC-Δ1714腺病毒載體上，獲得新的、含有外源性基因的腺病毒左端載體pXC-Δ1651/GM-CSF，pXC-Δ1714/GM-CSF，pXC-Δ1651/TK或pXC-Δ1714/TK。優(yōu)選的兩組外源性抗腫瘤基因?yàn)榱＜?xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)與TK基因。它們通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列有效連接，并被分別插入到pXC-Δ1651或pXC-Δ1714腺病毒左端載體，獲得新的、含有兩組外源性基因的腺病毒左端載體pXC-Δ1651/GM-CSF/TK和pXC-Δ1714/GM-CSF/TK。
本發(fā)明還提供了另一種多功能抗癌重組腺病毒，這種腺病毒滅活能夠與細(xì)胞內(nèi)功能性腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合的E1B 55K病毒蛋白，但攜帶兩組編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因，并由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)有效連接這兩組外源性基因，因此兩組外源性基因能被共轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，并由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制第二組外源性基因的翻譯。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，這種重組腺病毒通過缺失突變滅活E1B 55K蛋白。缺失部分為nt2251至3509 DNA序列，并在E1B 55K基因缺失突變部位插入新的酶切位點(diǎn)。通過此新的酶切位點(diǎn)，該重組腺病毒能攜帶兩組，或兩組以上編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因。
為了獲得上述重組腺病毒，優(yōu)選地以質(zhì)粒pXC-1作為啟始材料，通過PCR技術(shù)構(gòu)建缺失E1B 55K基因的腺病毒左端質(zhì)粒pXC-Δ2251，pXC-Δ2251缺失nt2251至3509的DNA序列，并在E1B 55K基因缺失突變部位插入新的酶切位點(diǎn)PacI和XhoI。質(zhì)粒pXC-Δ2251能攜帶兩組，或兩組以上的外源性基因。優(yōu)選的兩組外源性基因所編碼的蛋白分別為一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)自殺基因產(chǎn)物，兩個(gè)細(xì)胞因子，兩個(gè)細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物，一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白，或上述蛋白的任意組合。用于控制上述外源性基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子為外源性病毒類啟動(dòng)子，例如CMV早期啟動(dòng)子。然而組織特異性啟動(dòng)子，例如前列腺特殊抗原啟動(dòng)子也可用于控制上述外源性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。在外源性基因之間優(yōu)選地由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)有效相連。因此外源性基因能被共轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，并由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制第二組外源性基因的翻譯。
優(yōu)選的兩組外源性抗腫瘤基因?yàn)榱＜?xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)與TK基因。它們通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列有效連接，并被分別插入到pXC-Δ2251的PacI位點(diǎn)，獲得新的、含有兩組外源性基因的腺病毒左端載體pXC-Δ2251/GM-CSF/TK。
為了獲得相應(yīng)的重組腺病毒，上述重組腺病毒左端載體與含有E3區(qū)基因的腺病毒右端載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組方式獲得新的重組腺病毒Δ1651，Δ1714，Δ1651/GM-CSF，Δ1714/GM-CSF，Δ1651/TK，Δ1714/TK，Δ1651/GM-CSF/TK，Δ1714/GM-CSF/TK，Δ2251/GM-CSF/TK。優(yōu)選的腺病毒右端載體為pBHGE3質(zhì)粒，也可為含有E3區(qū)基因的感染性腺病毒顆粒。腺病毒右端載體也可為不含E3區(qū)基因的pBGH10或pBGH11質(zhì)粒，或從這些質(zhì)粒衍生出來的類似質(zhì)粒。有關(guān)腺病毒質(zhì)粒的資料及它們的應(yīng)用，參考Hitt，Construction andPropagation of Human Adenovirus Vectors，InCell BiologyA LaboratoryHandbook，J.Celis，Academic Press，NY，1995，或參考Graham，Adenovirus Based Expression Vectors and Recombinant Vaccines，InVaccinesNew Approaches to Immunological Problems，R.W.Eliss，Butterworth，pp363-390，1992。
為了證實(shí)本發(fā)明中所述重組腺病毒的抗腫瘤效果，首先進(jìn)行細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)，比較野生型腺病毒、重組腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF、Δ1651/TK、Δ1651/GM-CSF/TK、Δ1714，Δ1714/GM-CSF，Δ1714/TK，和1714/GM-CSF/TK在正常細(xì)胞--微管內(nèi)皮細(xì)胞(MVEC)，宮頸癌細(xì)胞株C33A、肝癌細(xì)胞株HeP3B和前列腺癌細(xì)胞株LNCaP中的復(fù)制能力。實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果參考實(shí)施例4。本發(fā)明還通過比較野生型腺病毒與重組腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF對(duì)各種正常細(xì)胞、P53缺陷型和P53正常型腫瘤細(xì)胞株所產(chǎn)生的細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)來評(píng)估重組腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用，參見實(shí)施例5。此外，含有一組或兩組外源性抗腫瘤蛋白基因的重組腺病毒Δ1651/GM-CSF、Δ1651/TK、Δ1651/GM-CSF/TK，Δ2251/GM-CSF/TK能選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)抗腫瘤蛋白，參見實(shí)施例6、7和附圖2、3。
除了細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)外，本發(fā)明還通過動(dòng)物腫瘤模型來進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明所提供的重組腺病毒的抗癌效應(yīng)，參見實(shí)施例8、9、10和附圖4、5。
由實(shí)施例4、5所見，同時(shí)滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重組腺病毒，能選擇性地在P53功能正常型和/或P53正常缺陷型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、繁殖，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)，并殺死腫瘤細(xì)胞，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力超過了野生型腺病毒，而對(duì)正常細(xì)胞基本上無殺傷作用。重組腺病毒Δ1651/GM-CSF，Δ1651/GM-CSF/TK除了能選擇性地在P53缺陷型和/或P53功能正常型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、繁殖，還能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，參照實(shí)施例6和附圖2，進(jìn)而誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和非特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)而進(jìn)一步加強(qiáng)殺傷腫瘤的效應(yīng)。有關(guān)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的資料可從本領(lǐng)域中各種不同來源獲得。重組腺病毒Δ1651/TK和Δ1651/GM-CSF/TK除了能選擇性地殺傷P53功能正常型和/或P53功能缺陷型的腫瘤細(xì)胞，還能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)HSV-TK基因產(chǎn)物，參照實(shí)施例7和附圖3。HSV-TK基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞沒有直接毒性，然而，當(dāng)細(xì)胞群接觸到一種藥物前體無環(huán)鳥苷(GCV)或FIAU時(shí)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的TK基因產(chǎn)物能將藥物前體無環(huán)鳥苷(GCV)轉(zhuǎn)化成有毒藥物二，三磷酸核苷，并將腫瘤細(xì)胞選擇性的消除，因此極大的增強(qiáng)了重組腺病毒的抗腫瘤作用。有關(guān)藥物前體的資料可從本領(lǐng)域中各種不同來源獲得。重組腺病毒Δ1651/GM-CSF/TK除了能選擇性地殺傷P53功能正常型和/或P53功能缺陷型的腫瘤細(xì)胞外，還能在上述腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和TK基因產(chǎn)物，參照實(shí)施例6和7，附圖2和3。這類重組腺病毒具有多功能抗腫瘤效應(yīng)重組腺病毒的直接溶癌作用，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子所誘發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)和TK基因產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的“旁觀者效應(yīng)”，這三方面的抗癌作用結(jié)合在一起，產(chǎn)生了三殺傷的最佳抗腫瘤效應(yīng)。
本發(fā)明中的重組腺病毒還含有E3區(qū)基因。目前認(rèn)為E3基因產(chǎn)物能降低宿主對(duì)腺病毒的免疫排斥效應(yīng)，延長(zhǎng)外源性蛋白在宿主體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間。[Ican，等(1997)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(PNAS)942587～2592；Bunder等(1997)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)717623～7628]。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)帶有E3基因的腺病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)的最大耐受量比不帶E3基因的腺病毒提高了2倍左右，表明E3基因產(chǎn)物能提高宿主對(duì)腺病毒的耐受性，降低腺病毒對(duì)宿主所產(chǎn)生的毒副反應(yīng)。參見實(shí)施例10。這可能E3區(qū)的14.7K蛋白和10.4K/14.5K蛋白復(fù)合物阻斷腫瘤壞死因子所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性及炎癥反應(yīng)有關(guān)。
在本發(fā)明的一個(gè)代替實(shí)施方案中，重組腺病毒蛋白可以通過定點(diǎn)突變，或/和插入突變，或/和移碼突變滅活E1B 19K蛋白和/或E1B 55K，所述病毒還可任選地?cái)y帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。本發(fā)明的重組腺病毒能進(jìn)一步包含一個(gè)在E1A基因上的額外突變。這種突變型的E1A蛋白質(zhì)缺乏能夠結(jié)合腫瘤抑制基因Rb(和/或300kd多肽和/或107kd多肽)的CR1和/或CR2結(jié)構(gòu)區(qū)域，但包含一個(gè)能夠反式激活腺病毒早期基因的功能CR3結(jié)構(gòu)區(qū)域。該重組腺病毒能夠在缺乏功能性Rb腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，繁殖，并殺傷腫瘤細(xì)胞。
治療腫瘤的方法本發(fā)明還提供了治療腫瘤的方法。本發(fā)明中的重組腺病毒可用于治療多種P53正常型和/或P53缺陷型的人類腫瘤。例如但不限于支氣管癌，鼻咽癌，喉癌，小細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌，肝癌，胰腺癌，膀胱癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，宮頸癌，卵巢癌，或淋巴細(xì)胞白血病的病人或非人類乳動(dòng)物。重組腺病毒以有效抗腫瘤劑量的混懸液，通過多種途徑應(yīng)用到腫瘤組織中，包括靜脈內(nèi)，腹腔內(nèi)，肌肉，皮下及局部腫瘤直接注射。每毫升含有大約103～1012或更多病毒顆粒的混懸物可做為一種氣霧劑吸入以治療腫瘤，例如支氣管癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，肺腺癌或喉癌，鼻咽癌，宮頸癌，或用藥簽將其直接敷到腫瘤部位以治療腫瘤，例如支氣管癌，鼻咽癌，喉癌，宮頸癌，或著可以注射方法治療腫瘤，例如可注射到腹腔以治療卵巢癌，注射到門靜脈治療肝腫瘤或其他非肝臟原發(fā)腫瘤的肝轉(zhuǎn)移，或著直接注射到腫瘤部位以治療腫瘤，例如乳腺肝癌，前列腺癌。
本發(fā)明的重組腺病毒還可用于預(yù)防多種P53正常型和P53缺陷型的人類腫瘤。在預(yù)防性應(yīng)用中，重組腺病毒或其混合物的組合物，被應(yīng)用到目前并不患有癌癥的病人上，以增強(qiáng)病人對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的抵抗力，或延長(zhǎng)緩解時(shí)間。
本發(fā)明的重組腺病毒還可作為一種腫瘤免疫療法，治療p53正常型和/或p53缺陷型的人類腫瘤，包括局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤。這種重組腺病毒可以通過多種途徑應(yīng)用到腫瘤組織中，選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、繁殖，并有效表達(dá)免疫細(xì)胞因子，免疫細(xì)胞因子能誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和非特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的抗腫瘤腺病毒療法可聯(lián)合其他抗腫瘤方案，如常規(guī)化療、和/或放療、和/或生物療法以治療各種腫瘤。優(yōu)選的化療藥物包括Taxol，Taxotere，Doxorubicin，這些化合物的抗腫瘤療效在本領(lǐng)域中是公認(rèn)的。
為了進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，以下實(shí)施例是通過舉例方法提供。然而在權(quán)利要求的范圍內(nèi)進(jìn)行某些改變和調(diào)整應(yīng)認(rèn)為屬于本發(fā)明的范疇。
實(shí)施例實(shí)施例1.腺病毒E1B基因突變體的構(gòu)建A.質(zhì)粒pXC-Δ1651的構(gòu)建質(zhì)粒pXC-1購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc(Toronto)。pXC-1含有人腺病毒5型(Ad5)從nt22-5790的基因序列。通過PCR方法[詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟參照分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，Sambrook編著(1989)]在pXC-1上構(gòu)建缺失E1B基因(從nt1651-2591)的腺病毒左端質(zhì)粒。具體構(gòu)建步驟如下以寡核苷酸鏈UCP 1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)UCP2(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCTAACACGCCATGCAAGTTAA-3’)XhoI PacI為引物，pXC-1 DNA為模板，得到PCR產(chǎn)物A。PCR產(chǎn)物A含有腺病毒從nt1316-1650的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
PacI XhoI以寡核苷酸鏈UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)UCP4(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGTAAATATCAGGAATTGTTG-3’)為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產(chǎn)物B。PCR產(chǎn)物B含有腺病毒從nt2592-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacI XhoI由此可見，PCR產(chǎn)物A的3’端含有與PCR產(chǎn)物B的5’端互補(bǔ)的22個(gè)寡核苷酸序列。將PCR產(chǎn)物A與PCR產(chǎn)物B混合在一起，100°C變性5分鐘，然后緩慢降溫復(fù)性。復(fù)性后有大約10％-20％左右的PCR產(chǎn)物A的正鏈與PCR產(chǎn)物B的副鏈，通過22個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸序列而互聯(lián)成為PCR產(chǎn)物A+B。加入Taq DNA多聚酶(購(gòu)于美國(guó)Promega公司)，在37℃條件下補(bǔ)平PCR產(chǎn)物A+B。
以寡核苷酸UCP1與UCP3為引物，PCR產(chǎn)物A+B為模板，得到PCR產(chǎn)物C。以AflII和HpaI消化PCR產(chǎn)物C，并將其與同樣的方式消化后的pXC-1連接，得到新的質(zhì)粒pXC-Δ1651。pXC-Δ1651含有從nt1651-2591的缺失突變，缺失部分包括內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子，E1B19K基因和5’端E1B 55K基因，并在E1B基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。PacI XhoIB.質(zhì)粒pXC-Δ1714的構(gòu)建為了在質(zhì)粒pXC-1上構(gòu)建缺失nt1714-2591的突變體，以寡核苷酸鏈UCP1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)UCP5(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCGAGGTCAGATGTAACCAAGA-3’)XhoI PacI為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產(chǎn)物D。PCR產(chǎn)物D含有腺病毒從nt1316-1713的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
PacI XhoI以寡核苷酸鏈UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)UCP4(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGTAAATATCAGGAATTGTTG-3’)PacI XhoI為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產(chǎn)物B。PCR產(chǎn)物B含有腺病毒從nt2592-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacIXhoIPCR產(chǎn)物D的3’端含有與PCR產(chǎn)物B的5’端互補(bǔ)的22個(gè)寡核苷酸序列。將PCR產(chǎn)物D與PCR產(chǎn)物B混合在一起，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復(fù)性。復(fù)性后有大約10％-20％左右的PCR產(chǎn)物D的正鏈與PCR產(chǎn)物B的副鏈，通過22個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸序列而互聯(lián)成為PCR產(chǎn)物D+B。加入Taq NDA多聚酶(購(gòu)于美國(guó)Promega公司)，在37℃條件下補(bǔ)平PCR產(chǎn)物D+B。以寡核苷酸UCP1與UCP3為引物，PCR產(chǎn)物D+B為模板，進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，得到PCR產(chǎn)物E。以AflII和HpaI消化PCR產(chǎn)物E，并將其與同樣的方式消化后的pXC-1相連接，得到新的質(zhì)粒pXC-Δ1714。pXC-Δ1714含有從nt1714-2591的缺失突變，缺失部分包括E1B19K基因和5’端E1B 55K基因，但保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列，并在E1B基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacI XhoIC.質(zhì)粒pXC-Δ2251的構(gòu)建為了在質(zhì)粒pXC-1上構(gòu)建缺失nt2251-3509的突變體，以寡核苷酸鏈UCP1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)UCP13(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCCAACATTCATTCCCGAGGGT-3’)XhoI PacI為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產(chǎn)物L(fēng)。PCR產(chǎn)物L(fēng)含有腺病毒從nt1316-2250的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
PacI XhoI以寡核苷酸鏈UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)UCP14(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGGTACTGAAATGTGTGGGCG-3’)PacI XhoI為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產(chǎn)物M。PCR產(chǎn)物M含有腺病毒從nt3510-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacI XhoIPCR產(chǎn)物L(fēng)的3’端含有與PCR產(chǎn)物M的5’端互補(bǔ)的22個(gè)寡核苷酸序列。將PCR產(chǎn)物L(fēng)與PCR產(chǎn)物M混合在一起，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復(fù)性。復(fù)性后有大約10％-20％左右的PCR產(chǎn)物L(fēng)的正鏈與PCR產(chǎn)物M的副鏈，通過22個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸序列而互聯(lián)成為PCR產(chǎn)物L(fēng)+M。加入Taq NDA多聚酶(購(gòu)于美國(guó)Promega公司)，在37℃條件下補(bǔ)平PCR產(chǎn)物L(fēng)+M。以寡核苷酸UCP1與UCP3為引物，PCR產(chǎn)物L(fēng)+M為模板，進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，得到PCR產(chǎn)物N。以AflII和HpaI消化PCR產(chǎn)物N，并將其與同樣的方式消化后的pXC-1相連接，得到新的質(zhì)粒pXC-Δ2251。pXC-Δ2251含有從nt2251-3509的缺失突變，缺失部分包括E1B 55K基因，但保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列和E1B 19K基因，并在E1B 55K基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacIXhoI實(shí)施例2.轉(zhuǎn)基因E1B基因突變體的構(gòu)建A.質(zhì)粒pXC-Δ1651/GM-CSF的構(gòu)建以寡核苷酸鏈UCP5(5’-CGCGGATCCGCGATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’)BamHIUCP6(5’-CCGGAATTCCCCTCACTCCGGACTGGCTCCC-3’)EcoRI為引物，以質(zhì)粒PGT60hGM-CSF(購(gòu)于美國(guó)Invivogen公司)為模板，獲得PCR產(chǎn)物F。PCR產(chǎn)物F含有完整的人源性GM-CSF基因序列，并在5’端和3’端含有BamHI和EcoRI的酶切 位點(diǎn)。以EcoRI和BamHI消化PCR產(chǎn)物F，并插入到同樣位點(diǎn)的質(zhì)粒pcDNA3(購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司)上，獲得新的重組質(zhì)粒pcDNA3-GM-CSF。
以寡核苷酸鏈UCP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)PacIUCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)PacI為引物，以質(zhì)粒pcDNA3-GM-CSF為模板，獲得PCR產(chǎn)物G。PCR產(chǎn)物G含有CMV早期啟動(dòng)子，人源性GM-CSF基因序列和牛生長(zhǎng)荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號(hào)，并在PCR產(chǎn)物G的兩端含有PacI酶切位點(diǎn)。以PacI消化PCR產(chǎn)物G，并連接到相同位點(diǎn)的pXC-Δ1651上獲得新的重組質(zhì)粒pXC-Δ1651/GM-CSF。質(zhì)粒pXC-Δ1651/GM-CSF缺失內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有人源性GM-CSF基因序列，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動(dòng)子，在GM-CSF基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
B.質(zhì)粒pXC-Δ1714/GM-CSF的構(gòu)建以同樣的方法獲得PCR產(chǎn)物G，并以PacI消化PCR產(chǎn)物G，連接到相同位點(diǎn)的pXC-Δ1714上獲得新的重組質(zhì)粒pXC-Δ1714/GM-CSF。質(zhì)粒pXC-Δ1714/GM-CSF缺失E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列。在E1B基因缺失突變部位插入人源性GM-CSF基因序列，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動(dòng)子，GM-CSF基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
C.質(zhì)粒pXC-Δ1651/TK的構(gòu)建以寡核苷酸鏈UCP9(5’-CCGCTCGAGCGGATGGCCTCGTACCCCGGCCA-3’)XhoIUCP10(5’-CTAGTCTAGACTAGTCAGTTAGCCTCCCCCATCT-3’)XbaI為引物，以質(zhì)粒PGT60hGM-CSF為模板，獲得PCR產(chǎn)物H。PCR產(chǎn)物H含有HSV TK基因序列，在PCR產(chǎn)物H的5’端含有XhoI位點(diǎn)，3’端含有XhaI位點(diǎn)，以XhoI和XbaI消化PCR產(chǎn)物H，并U插入到pcDNA3的相同位點(diǎn)獲得新的質(zhì)粒pcDNA3-TK。以寡核苷酸鏈CP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)PacIUCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)PacI為引物，以質(zhì)粒pcDNA3-TK為模板，獲得PCR產(chǎn)物I。PCR產(chǎn)物I含有CMV早期啟動(dòng)子，HSV-TK基因序列和牛生長(zhǎng)荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號(hào)，并在PCR產(chǎn)物I的兩端含有PacI酶切位點(diǎn)。以PacI消化PCR產(chǎn)物I，并連接到相同位點(diǎn)的pXC-Δ1651上獲得新的重組質(zhì)粒pXC-Δ1651/TK。質(zhì)粒pXC-Δ1651/TK缺失內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有HSV-TK基因序列，并在HSV-TK基因的上游含有CMV早期啟動(dòng)子，在HSV-TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
D.質(zhì)粒pXC-Δ1714/TK的構(gòu)建以同樣的方法獲得PCR產(chǎn)物I，并以PacI消化PCR產(chǎn)物I，連接到相同位點(diǎn)的pXC-Δ1714上獲得新的重組質(zhì)粒pXC-Δ1714/TK。質(zhì)粒pXC-Δ1714/TK缺失E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列。在E1B基因缺失突變部位插入HSV-TK基因序列，并在HSV-TK基因的上游含有CMV早期啟動(dòng)子，HSV-TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
E.質(zhì)粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK的構(gòu)建以XhoI和XbaI消化質(zhì)粒pcDNA-TK獲得HSV TK基因，并將HSVTK基因插入到相同位點(diǎn)的pcDNA-GM-CSF獲得新的質(zhì)粒pcDNA-CSF-TK。以寡核苷酸鏈UCP11(5’-GACGTCGACTAATTCCGGTTATTTTCCA-3’)SalIUCP12(5’-GACGTCGACATCGTGTTTTTCAAAGGAA-3’)SalI為引物，以質(zhì)粒PCITE-3a(+)(購(gòu)于美國(guó)Novagen公司)為模板，獲得PCR產(chǎn)物J。PCR產(chǎn)物J含有腦心肌炎病毒(EMCV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列，并在PCR產(chǎn)物J的兩端含有內(nèi)切酶SalI位點(diǎn)。以SalI消化PCR產(chǎn)物J，并插入到pcDNA-CSF-TK的XboI位點(diǎn)的，獲得新的質(zhì)粒pcDNA-GM-CSF/TK。以寡核苷酸鏈UCP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)PacIUCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)PacI為引物，以質(zhì)粒pcDNA-CSF/TK為模板，獲得PCR產(chǎn)物K。PCR產(chǎn)物K含有CMV早期啟動(dòng)子，人源性hGM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生長(zhǎng)荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號(hào)，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之間由腦心肌類病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)有效連接。以PacI消化PCR產(chǎn)物K，并連接到相同位點(diǎn)的pXC-Δ1651上獲得新的重組質(zhì)粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK。質(zhì)粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK缺失內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有人源性hGM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生長(zhǎng)荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號(hào)，并在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之間由腦心肌類病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)有效連接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動(dòng)子，在HSV TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
F.質(zhì)粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK的構(gòu)建以同樣的方法獲得PCR產(chǎn)物K，并以PacI消化PCR產(chǎn)物K，連接到相同位點(diǎn)的pXC-Δ1714上獲得新的重組質(zhì)粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK。質(zhì)粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK缺失E1B 19K基因序列和5’端E1 B 55K基因，保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列，并含有人源性GM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生長(zhǎng)荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號(hào)，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之間由腦心肌類病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)有效連接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動(dòng)子，在HSVTK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
G.質(zhì)粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK的構(gòu)建以同樣的方法獲得PCR產(chǎn)物K，并以PacI消化PCR產(chǎn)物K，連接到相同位點(diǎn)的pXC-Δ2251上獲得新的重組質(zhì)粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK。質(zhì)粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK缺失E1B 55K基因，保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子序列和E1B 19K基因，并含有人源性GM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生長(zhǎng)荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號(hào)，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之間由腦心肌類病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)有效連接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動(dòng)子，在HSVTK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
實(shí)施例3.重組腺病毒的產(chǎn)生
A.Δ1651腺病毒的產(chǎn)生pBHGE3購(gòu)于加拿大Microbix Biosystems Inc。pBHGE3含有Ad5基因序列但E1區(qū)從nt188到1339缺失。pBHGE3本身不具有感染性，但pXC-1或從PXC-1衍生出來的質(zhì)粒與pBHG-E3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組能產(chǎn)生具有感染的病毒(詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟參照Hitt，Constructionand Propagation of Human Adenovirus Vectors，InCell BiologyALaboratory Handbook，J.Celis，Academic Press，NY，1995，或參考Graham，Adenovirus Based Expression Vectors and RecombinantVaccines，InVaccinesNew Approaches to Immunological Problems。R.W.Eliss，Butterworth，pp363-390，1992)。Δ1651腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ1651與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增。病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒(購(gòu)于美國(guó)Qiagen公司)獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ1651腺病毒缺失了nt 1651-2591部分，缺失部分包括內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子，E1B19K基因和E1B 55K基因的大部分，Δ1651腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B55K蛋白。
B.Δ1714腺病毒的產(chǎn)生Δ1714腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ1714與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ1714腺病毒缺失了nt 1714-2591部分，缺失部分包括E1B19K基因和E1B 55K基因的大部分，但保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子，Δ1714腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。
C.Δ1651/GM-CSF腺病毒的產(chǎn)生Δ1651/GM-CSF腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ1651/GM-CSF與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ1651/GM-CSF腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并攜帶由CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控的GM-CSF基因。
D.Δ1651/TK腺病毒的產(chǎn)生Δ1651/TK腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ1651/TK與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ1651/TK腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并攜帶由CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控的TK基因。
E.Δ1714/GM-CSF腺病毒的產(chǎn)生Δ1714/GM-CSF腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ1714/GM-CSF與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ1714/GM-CSF腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留 內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子，并攜帶由CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控的GM-CSF基因。
F.Δ1714/TK腺病毒的產(chǎn)生Δ1714/TK腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ1714/TK與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ1714/TK腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子，并攜帶由CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控的HSV TK基因。
G.Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒的產(chǎn)生Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并攜帶由CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它們通過腦心肌炎病毒(EMCV)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列有效連接。
H.Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒的產(chǎn)生Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子，并攜帶由CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它們通過腦心肌炎病毒(EMCV)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列有效連接。
I.Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒的產(chǎn)生Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒由質(zhì)粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK與質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認(rèn)。Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒不能編碼E1B 55K蛋白，但保留內(nèi)源性E1B啟動(dòng)子和E1B 19K蛋白，并攜帶由CMV早期啟動(dòng)子調(diào)控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它們通過腦心肌炎病毒(EMCV)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列有效連接。
實(shí)施例4.噬斑法檢測(cè)重組腺病毒的復(fù)制能力為了比較本發(fā)明中的重組腺病毒在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力，同等劑量的重組腺病毒和野生型腺病毒(1 MOI)分別感染正常細(xì)胞--人微管內(nèi)細(xì)胞MVEC(購(gòu)于美國(guó)Clonetics公司)，宮頸癌細(xì)胞(C33A，P53突變型，購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)，肝癌細(xì)胞(Hep3B，P53突變型，購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)和前列腺癌細(xì)胞(LNCaP，P53正常型，購(gòu)于美國(guó)ATCC公司)。48小時(shí)后，將細(xì)胞凍融三次釋放病毒，通過噬斑法在HEK293細(xì)胞內(nèi)測(cè)定病毒滴度[詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟參照Heise等自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)，3(6)639-645]。重組腺病毒在不同細(xì)胞株內(nèi)的滴度與野生型病毒在同一細(xì)胞內(nèi)的滴度相比較，其比率可用來評(píng)估病毒復(fù)制的有效性，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性。例如，當(dāng)比率小于100，表明重組腺病毒在其細(xì)胞株內(nèi)的復(fù)制能力小于野生型腺病毒，相反，當(dāng)比率大于100時(shí)，則表明此病毒在其細(xì)胞株內(nèi)的復(fù)制能力大于野生腺病毒。由表1所見，Δ1651腺病毒、Δ1715腺病毒、Δ1651/GM-CSF腺病毒、Δ1773/GM-CSF腺病毒、Δ1651/TK腺病毒、1773/TK腺病毒、Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒、Δ1773/GM-CSF/TK腺病毒與野生型腺病毒在腫瘤細(xì)胞C33A，HeP3B、LNCaP中的比率均超過150％，表明同時(shí)滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重組腺病毒在P53突變型和P53正常型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力強(qiáng)于野生型腺病毒。而這些重組腺病毒與野生型腺病毒在正常細(xì)胞MVEC內(nèi)的比率為0.2％左右，表明這類重組腺病毒在MVEV內(nèi)的復(fù)制能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型腺病毒。比較這些重組腺病毒在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力，也能進(jìn)一步表明這些重組腺病毒能選擇性地在P53突變型和P53正常型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，他們?cè)谀[瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力高于在正常細(xì)胞內(nèi)1000倍以上。
表1.噬斑法檢測(cè)重組腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力 實(shí)施例5.細(xì)胞致病效應(yīng)實(shí)驗(yàn)重組腺病毒和野生型腺病毒分別以20 MOI的劑量感染正常細(xì)胞，包括人微管內(nèi)皮細(xì)(MVEC)，乳腺上皮細(xì)胞(MEC)，纖維細(xì)胞(HS68)，以上正常細(xì)胞均購(gòu)于美國(guó)Clonetics公司，P53基因突變型的腫瘤細(xì)胞，包括宮頸癌細(xì)胞(C33A)，結(jié)腸癌細(xì)胞(SW620)，結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29)，肺癌細(xì)胞(NCI-H128)，肝癌細(xì)胞(Hep3B)，卵巢癌細(xì)胞(OVCAR3)，P53基因正常型腫瘤細(xì)胞，包括前列腺癌(LNCaP)，乳腺癌(MCF7)，宮頸癌細(xì)胞(Hela)，黑色素瘤細(xì)胞(SP6)，肝癌細(xì)胞(Hep G2)，胰腺癌細(xì)胞(PANC-1)，以上腫瘤細(xì)胞株均購(gòu)于美國(guó)ATCC公司(見表2)。感染后3天以顯微鏡法檢查細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)。(+)或(-)表明存在或缺乏致病效應(yīng)(CPE)。由表2結(jié)果可知，野生型腺病毒對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均產(chǎn)生致病效應(yīng)(CPE)，而Δ1651腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒對(duì)幾乎所有的P53基因突變型和P53基因正常型腫瘤細(xì)胞，均產(chǎn)生致病效應(yīng)(CPE)，但對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生致病效應(yīng)。此結(jié)果進(jìn)一步說明了同時(shí)滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重組腺病毒能選擇性地殺死P53功能正常型和P53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞。但對(duì)正常細(xì)胞基本上無傷害作用。
表2.重組腺病毒和野生型腺病毒對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的致病效應(yīng)(CPE)細(xì)胞株致病效應(yīng)(CPE)正常細(xì)胞 野生型腺病毒 Δ1651腺病毒Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒人微管內(nèi)皮細(xì)(MVEC)+ - -乳腺上皮細(xì)胞(MEC) + - -纖維細(xì)胞(HS68)+ - -淋巴細(xì)胞(Lymphocytes) + - -P53基因突變型腫瘤細(xì)胞宮頸癌細(xì)胞(C33A) + + +結(jié)腸癌細(xì)胞(SW620) + + +結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29) + + +肺癌細(xì)胞(NCI-H128)+ + +肝癌細(xì)胞(Hep3B) + + +卵巢癌細(xì)胞(OVCAR3)+ + +P53基因正常型腫瘤細(xì)胞前列腺癌(LNCaP) + + +乳腺癌(MCF7) + + +
宮頸癌細(xì)胞(Hela)+++黑色素瘤細(xì)胞(SP6) +++肝癌細(xì)胞(Hep G2)+++實(shí)施例6.表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的腺病毒Δ1651腺病毒、Δ1651/GM-CSF腺病毒、Δ1651/TK腺病毒，Δ1651/GM-CSF/TK和Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒分別以10 MOI的劑量感染293細(xì)胞和C33A細(xì)胞。感染二天后，觀察到腺病毒引起90％以上細(xì)胞致病作用(CPE)。收獲被感染的293細(xì)胞和C33A細(xì)胞，快速離心除去細(xì)胞碎片，用ELISA方法檢測(cè)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(購(gòu)于美國(guó)R&D System公司)的表達(dá)水平。其測(cè)檢步驟按照廠家的要求進(jìn)行。由圖2所示，含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因表達(dá)盒的Δ1651/GM-CSF腺病毒，Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒和Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒均能高效表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，其中Δ1651/GM-CSF，Δ1651/GM-CSF/TK和Δ2251/GM-CSF/TK在293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的水平分別為1000ng/ml，1250ng/ml和500ng/ml(1ml含有1×105細(xì)胞)，在C33A細(xì)胞中的表達(dá)劑量分別為1100ng/ml，1300ng/ml和550ng/ml。而不含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的Δ1651腺病毒和Δ1651/TK腺病毒未能檢查出任何粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。腺病毒Δ1651/GM-CSF和Δ1651/GM-CSF/TK表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的水平基本相似，表明Δ1651/GM-CSF/TK內(nèi)的第二組外源性基因HSV TK并未影響第一組基因粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)。
實(shí)施例7.藥物前體GCV對(duì)重組腺病毒的細(xì)胞致病效應(yīng)的影響肝癌細(xì)胞株Hep3B(P53基因突變型)以2×10000細(xì)胞/孔的數(shù)量種到96孔細(xì)胞板，37℃培養(yǎng)過夜。第二天，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒分別以0.001 MOI劑量感染HeP3B。感染后72小時(shí)，將含有或不含有藥物前體GCV(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)96小時(shí)，由MTT方法測(cè)定細(xì)胞的成活率[詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟參照Kodama等抗病毒研究(Antiviral Res)199631(3)159-164]。在不含有GCV的培養(yǎng)條件下，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒以0.001 MOI劑量感染HeP3B細(xì)胞，HeP3B細(xì)胞的成活率分別為71％和68％。在含有GCV的培養(yǎng)條件下，以同樣劑量的病毒感染，HeP3B細(xì)胞的成活率明顯降低，且與GCV濃度呈正比。由圖3所見，當(dāng)Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒的感染劑量為0.001 MOI時(shí)，GCV的IC50為0.02ug/m1，當(dāng)GCV濃度為1ug/ml時(shí)，0.001 MOI的Δ1651/TK腺病毒或Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒能殺傷99％的HeP3B細(xì)胞。由此可見，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒均能高效表達(dá)HSV-TK基因產(chǎn)物，并在藥物前體GCV的誘導(dǎo)下，進(jìn)一步加強(qiáng)了腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞致病效應(yīng)。
比較腺病毒Δ1651/GM-CSF和Δ1651/GM-CSF/TK在藥物前提GCV的存在下的細(xì)胞致病效應(yīng)曲線，表明兩組重組腺病毒表達(dá)HSV TK產(chǎn)物的水平基本相似。由于Δ1651/GM-CSF/TK中的HSV TK基因是由腦心肌類病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制翻譯，本實(shí)驗(yàn)表明通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)而有效連接的兩組外源性基因組，其中第二組外源性基因能在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的調(diào)控下高效表達(dá)。
實(shí)施例8.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)I將LNCaP細(xì)胞(P53基因正常型)以1×106細(xì)胞/鼠的劑量，皮下注射到雄性無胸腺的裸鼠頸背部。當(dāng)腫瘤瘤體達(dá)到300mm3左右，將帶有腫瘤的裸鼠分別分為4組(每組共含六個(gè)以上的裸鼠)，第一組為陰性對(duì)照，直接注入含有10％甘油的PBS溶液，第二組裸鼠接受Δ1651的直接腫瘤注射，第三組接受Δ1651/TK的直接腫瘤注射，第四組接受Δ1651/GM-CSF/TK的直接腫瘤注射，其各病毒的注射量為109顆粒/mm3。每周測(cè)量腫瘤的生產(chǎn)情況，連續(xù)記錄六周，其結(jié)果列于圖4(LNCaP腫瘤)。由圖4所見，接受注射Δ1651、Δ1651/TK和Δ1651/GM-CSF/TK一周后，裸鼠的LNCaP腫瘤瘤體開始縮小，給藥后的六周，腫瘤均縮小至注射前瘤體體積的5％左右，腫瘤幾乎完全消失。而陰性對(duì)照組的腫瘤體積持續(xù)增大，六周后是原腫瘤體積近四倍。本實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明中的重組腺病毒具有超強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)， 單一療程的注射能徹底治愈患有前列腺癌的裸鼠。
實(shí)施例9.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)II將LNCaP細(xì)胞(P53基因正常型)以1×106細(xì)胞/鼠的劑量，皮下注射到雄性無胸腺的裸鼠頸背部。當(dāng)腫瘤瘤體達(dá)到300mm3左右，將帶有腫瘤的裸鼠分別分為4組(每組共含六個(gè)以上的裸鼠)。裸鼠除接受病毒的直接腫瘤注射外，同時(shí)還接受前體藥物GCV的腹腔內(nèi)注射。由圖5所示，此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為四組，第一組為陰性對(duì)照，接受10％甘油的PBS溶液注射，第二組接受Δ1651和GCV的注射，第三組接受Δ1651/TK和GCV的注射，第四組接受Δ1651/GM-CSF/TK和GCV的注射。病毒的注射劑量為1×107顆粒數(shù)/mm3，GCV的注射劑量為60mg/Kg，連續(xù)注射6天。由圖5可見，治療6周后，接受Δ1651與GCV注射的裸鼠腫瘤瘤體為原腫瘤瘤體的103％。而接受Δ1651/TK和GCV，Δ1651/GM-CSF/TK和GCV注射的裸鼠腫瘤瘤體顯著縮小，分別是原腫瘤體積的6.8％和8.7％。由此可見，Δ1651/TK和Δ1651/GM-CSF/TK內(nèi)的HSV TK基因能高效表達(dá)，并能通過前體藥GCV，極大地加強(qiáng)了腺病毒的抗腫瘤效應(yīng)。
實(shí)施例10。腺病毒的最大耐受量實(shí)驗(yàn)8周大的雄性小白鼠(各組為4只)接受大劑量重組腺病毒的直接靜脈注射，觀察大劑量腺病毒進(jìn)入小鼠體內(nèi)所產(chǎn)生的毒副反應(yīng)，以確定腺病毒在小白鼠體內(nèi)的最大耐受劑量(MTD)。重組腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF/TK，含有及不含有E3區(qū)基因的野生型腺病毒W(wǎng)t/E3和Wt/E3-以1×1011顆粒/鼠，2×1011顆粒/鼠，3×1011顆粒/鼠靜脈的劑量注射到小白鼠體內(nèi)，觀察各組小白鼠的死亡率以確定腺病毒的最大耐受量(表3)。由表3所示，3×1011顆粒/鼠的Δ1651，Δ1651/GM-CSF/TK和Wt/E3靜脈注射到小白鼠體內(nèi)，不會(huì)引起小白鼠死亡，表明它們?cè)谛“资篌w內(nèi)的最大耐受劑量至少為3×1011顆粒，而wt/E3-進(jìn)入小白鼠體內(nèi)的最大耐受量為1×1011顆粒/鼠。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明E3區(qū)基因產(chǎn)物能降低腺病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)的毒副反應(yīng)，并提高腺病毒的最大耐受劑量。
表3.腺病毒的最大耐受量實(shí)驗(yàn)

權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒，其特征在于該病毒滅活能夠與細(xì)胞內(nèi)功能性腫瘤抑制基因p53結(jié)合的病毒蛋白，但攜帶兩組能夠編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因，并通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site或IRES)有效連接，兩組外源性基因能被共轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制第二組外源性基因的翻譯。
2.權(quán)利要求1中所述的重組腺病毒，其特征在于其中所述病毒被滅活的病毒蛋白為E1B 55K蛋白。
3.權(quán)利要求1或2中所述的重組腺病毒，其特征在于其中所述病毒可在P53功能缺陷型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制繁殖，高效表達(dá)外源性蛋白，并殺死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)P53功能正常型的非腫瘤細(xì)胞基本無殺傷作用。
4.權(quán)利要求1或2中所述的重組腺病毒，其中所述病毒通過缺失突變，和/或定點(diǎn)突變，和/或插入突變，和/或移碼突變滅活該病毒的E1B55K蛋白。
5.權(quán)利要求1或2中所述的重組腺病毒，其中包括兩組外源性基因，它們所編碼的蛋白分別為兩個(gè)細(xì)胞因子，兩個(gè)細(xì)胞自殺基因產(chǎn)物，一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)自殺基因產(chǎn)物，一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，或一個(gè)細(xì)胞因子與一個(gè)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白。
6.權(quán)利要求1或2中所述的重組腺病毒，其中包括兩組外源性基因，它們由外源性啟動(dòng)子，或腺病毒啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)，并在第二個(gè)外源性基因下游任選地含有外源性聚腺苷酸結(jié)構(gòu)。
7.權(quán)利要求6中所述的重組腺病毒，其中所述外源性啟動(dòng)子為外源性病毒類啟動(dòng)子，或外源性組織特異性啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求1或2中所述的重組腺病毒，其中所述內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列來自腦心肌炎病毒(EMCV)，和/或微管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，和/或免疫球蛋白鏈結(jié)合蛋白(BiP)，和/或纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblastgrowth factor2)，和/或丙型肝炎病毒(HCV)基因組。
9.權(quán)利要求1～8中任意一項(xiàng)所述的重組腺病毒，其中所述病毒含有E3基因。
10.藥物組合物，該組合物含有殺死腫瘤細(xì)胞有效量的權(quán)利要求1～9中任意一項(xiàng)所述的重組腺病毒和化療藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組腺病毒，其特征在于該病毒滅活能夠與細(xì)胞內(nèi)功能性腫瘤抑制基因p53結(jié)合的病毒蛋白，但攜帶兩組能夠編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因，并通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site或IRES)有效連接，兩組外源性基因能被共轉(zhuǎn)錄成一條mRNA鏈，由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)控制第二組外源性基因的翻譯。這種重組腺病毒能夠在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制繁殖，產(chǎn)生細(xì)胞致病效應(yīng)(CPE)，并能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源性抗腫瘤蛋白，最終殺死腫瘤細(xì)胞，而對(duì)P53功能正常型的非腫瘤細(xì)胞基本無殺傷作用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1607248SQ20041004605
公開日2005年4月20日 申請(qǐng)日期2001年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月15日
發(fā)明者陳瑜 申請(qǐng)人:杭州中肽生化有限公司, 陳瑜