專利名稱：一種測(cè)定巰基蛋白酶酶活的方法及其專用穩(wěn)定溶液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶活力測(cè)定方法及其專用穩(wěn)定溶液，特別是涉及一種巰基蛋白酶活力測(cè)定的方法及其專用穩(wěn)定溶液。
背景技術(shù)：
使用巰基蛋白酶進(jìn)行紅細(xì)胞血型、免疫性血型抗體檢定已有近60年的應(yīng)用歷史。木瓜蛋白酶(Papain)、菠蘿蛋白酶(Bromelein)和無(wú)花果蛋白酶(Ficin)是幾種常用的血型血清學(xué)使用的巰基蛋白酶。
酶活力效價(jià)的標(biāo)化是涉及體外血型血清實(shí)驗(yàn)檢定質(zhì)量的關(guān)鍵內(nèi)容，國(guó)際眾多學(xué)者，如R，Lsmbert(Medical Sciences 1978；35233)、PK Phillips(J ClinPathol 1988；457)、M.L.Scoott(Medical Laboratory Sciences 1988；457)等人都曾報(bào)道過(guò)血型血清學(xué)使用的巰基蛋白酶的活力效價(jià)分析方法，但這些活力效價(jià)分析方法與體外血型血清檢定實(shí)驗(yàn)方法差距較遠(yuǎn)，如ISBT/ICSH-1994工作條約顯示用M.L.Scoott等人的報(bào)道方法標(biāo)化的木瓜蛋白酶試劑進(jìn)行的體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢定會(huì)產(chǎn)生“假陽(yáng)性”反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種較準(zhǔn)確地測(cè)定巰基蛋白酶活力效價(jià)的方法及其專用穩(wěn)定溶液。
本發(fā)明所提供的巰基蛋白酶的穩(wěn)定溶液，含有0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mmol/L普魯蘭。
為了增加巰基蛋白酶在溶液中的穩(wěn)定性，所述穩(wěn)定溶液一般還含有0.015-0.03mol/L乙二胺四乙酸二鉀和0.2-0.3mol/L甘露醇。
磷酸鹽優(yōu)選的是磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物，所述磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的摩爾比為20-22∶1。
穩(wěn)定溶液的pH為5.3-5.7。
本發(fā)明所提供的測(cè)定巰基蛋白酶活力效價(jià)的方法，是用巰基蛋白酶、專用穩(wěn)定溶液配制的酶樣品，用pH6.8-7.2的1-2％偶氮化白蛋白(底物溶液)溶液與酶樣品溶液在36.5-37.5℃反應(yīng)10分鐘，在430nm測(cè)定OD值，計(jì)算酶活力效價(jià)；所述巰基蛋白酶的穩(wěn)定溶液含有0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mol/L普魯蘭。
所述底物溶液是用偶氮化白蛋白、磷酸鹽溶液配制的，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物，它們的摩爾比為1.5-2.5∶1。
在上述內(nèi)容的基礎(chǔ)上，酶活力效價(jià)測(cè)定的具體步驟包括1)將濃度為30-40mg/100ml的樣品溶液、底物溶液在36.5-37.5℃水浴箱中預(yù)熱10分鐘；2)將底物溶液和樣品溶液按體積比10∶1比混合，置37℃±0.5℃水浴箱反應(yīng)10分鐘；3)加入4-6％三氯乙酸溶液1ml，混合；4)離心取上清液，加入等體積的0.5mol/L氫氧化鈉溶液；5)在430nm測(cè)定酶水解液OD值。
本發(fā)明由于采用了上述技術(shù)方案，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、使用了較強(qiáng)的緩沖體系，將酶反應(yīng)過(guò)程的pH控制在了7.0±0.1范圍內(nèi)，降低了測(cè)量不定度。
2、由0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸、0.05-0.10mmol/L普魯蘭配制酶原料的樣品溶液，對(duì)酶樣品的激活、酶樣品溶液的穩(wěn)定是重要的，可以克服酶樣品溶液的活力衰減，降低測(cè)量不定度。
3、控制酶與底物的水解反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、離子強(qiáng)度、pH條件等實(shí)驗(yàn)條件，使酶活力效價(jià)的測(cè)定條件與體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢定條件保持一致，為體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢定使用的巰基蛋白酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)，以及體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢定技術(shù)的評(píng)價(jià)提供了數(shù)據(jù)化保證。
4提出了酶試劑溶液的活力控制標(biāo)準(zhǔn)，10-16U/50μl，或100-160U/50μl。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、木瓜凝乳蛋白酶的提取與制備取1000g的番木瓜果漿冰凍物，用微波加熱融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5)，在勻漿器中勻漿。
加入1％殼聚糖溶液100ml，勻漿攪拌，室溫靜置2小時(shí)后過(guò)濾，去除沉淀，保留濾液。
向?yàn)V液中加入硫酸銨至35％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉淀；向離心上清液中加入硫酸銨至50％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉淀；在上清液中加入過(guò)量酒石酸溶液，調(diào)節(jié)pH至＜2.5，室溫靜置60分鐘。10000×g離心20分鐘，棄去沉淀物；最后再向上清液中加入硫酸銨至70％飽和度，室溫靜置60分鐘，10000×g離心20分鐘，收集沉淀物。
將沉淀物用200ml純水溶解，然后用截留分子量為1萬(wàn)的聚砜中空纖維超濾膜超濾，在超濾過(guò)程中分次加入2-8℃水，在0.1兆帕的條件下循環(huán)超濾1h，得到超濾濃縮液。
向上述溶液中加入100ml 0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(pH5.5)，混勻。用該磷酸鉀緩沖液預(yù)先平衡纖維素CM-92色譜柱，然后以5ml/min的速度，將溶液上柱，以0.7mol/L磷酸鈉緩沖液(pH5.5)為洗脫液，收集木瓜凝乳蛋白酶洗脫液，用截留分子量為1萬(wàn)的聚砜中空纖維超濾膜濃縮洗脫液。
向濃縮液加入普魯蘭0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷凍干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物30g。
實(shí)施例2、巰基蛋白酶制劑的制備本實(shí)施例制備了木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶的制劑，其中木瓜凝乳蛋白酶為實(shí)施例1所得，木瓜酶、菠蘿蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶為市售商品酶。
一、木瓜凝乳蛋白酶制劑1配方普魯蘭 0.048mmol甘露醇 0.3mol海藻糖 0.02mol抗壞血酸鈉 0.02molL-半胱氨酸 0.05mol木瓜凝乳蛋白酶 200000PU2、制備工藝及過(guò)程定量稱取上述溶質(zhì)，溶解于純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，然后按每瓶2000PU規(guī)格分裝至潔凈西林瓶。用冷凍干燥機(jī)迅速降溫至-40℃，維持4小時(shí)；然后啟動(dòng)干燥程序，以每小時(shí)升溫5℃速率減壓干燥，將被凍結(jié)產(chǎn)品升溫33℃維持3小時(shí)，停止減壓，對(duì)成品進(jìn)行密封包裝，得到成品木瓜凝乳蛋白酶制劑。
二、木瓜蛋白酶制劑1配方普魯蘭 0.05mmol甘露醇 0.3mol海藻糖 0.02mol
抗壞血酸鈉 0.02molL-半胱氨酸 0.05mol木瓜蛋白酶 200000PU2、制備工藝及過(guò)程定量稱取上述溶質(zhì)，溶解于純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，然后按每瓶2000PU規(guī)格分裝至潔凈西林瓶。用冷凍干燥機(jī)迅速降溫至-40℃，維持4小時(shí)；然后啟動(dòng)干燥程序，以每小時(shí)升溫5℃速率減壓干燥，將被凍結(jié)產(chǎn)品升溫33℃維持3小時(shí)，停止減壓，對(duì)成品進(jìn)行密封包裝，得到木瓜蛋白酶制劑。
三、菠蘿蛋白酶制劑1配方普魯蘭 0.042mmol甘露醇 0.28mol海藻糖 0.02mol抗壞血酸鈉 0.02molL-半胱氨酸 0.055mol菠蘿蛋白酶 200000PU2、制備工藝及過(guò)程定量稱取上述溶質(zhì)，溶解于純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，然后按每瓶2000PU規(guī)格分裝至潔凈西林瓶。用冷凍干燥機(jī)迅速降溫至-40℃，維持4小時(shí)；然后啟動(dòng)干燥程序，以每小時(shí)升溫5℃速率減壓干燥，將被凍結(jié)產(chǎn)品升溫33℃維持3小時(shí)，停止減壓，對(duì)成品進(jìn)行密封包裝，得到菠蘿蛋白酶制劑。
四、無(wú)花果蛋白酶制劑1配方普魯蘭 0.04mmol甘露醇 0.24mol海藻糖 0.02mol抗壞血酸鈉 0.02molL-半胱氨酸 0.05mol無(wú)花果蛋白酶200000PU2、制備工藝及過(guò)程定量稱取上述溶質(zhì)，溶解于純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，然后按每瓶2000PU規(guī)格分裝至潔凈西林瓶。用冷凍干燥機(jī)迅速降溫至-40℃，維持4小時(shí)；然后啟動(dòng)干燥程序，以每小時(shí)升溫5℃速率減壓干燥，將被凍結(jié)產(chǎn)品升溫33℃維持3小時(shí)，停止減壓，對(duì)成品進(jìn)行密封包裝，得到無(wú)花果蛋白酶制劑。
實(shí)施例3、巰基蛋白酶原料的活力效價(jià)測(cè)定本實(shí)施例分別測(cè)定木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶的酶活，其中木瓜凝乳蛋白酶為實(shí)施例1所得，木瓜酶、菠蘿蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶為市售。
1、溶液配制1)酶激活—穩(wěn)定劑(pH5.5±0.2)L-半胱氨酸 0.025mol乙二胺四乙酸二鉀0.03mol甘露醇 0.3mol普魯蘭 0.05mmol磷酸二氫鉀 0.064mol磷酸氫二鈉 0.003mol將上述溶質(zhì)溶解于900ml純水中，用純水定容至1000ml。
2)樣品溶液分別稱取酶樣品30mg，用酶激活—穩(wěn)定劑溶解，稀釋至100ml定容。
3)配制底物溶液(pH7.0±0.1)稱取磷酸氫二鈉0.93mol，磷酸二氫鈉0.06mol，，用蒸餾水溶解，稀釋至1000ml定容。稱取偶氮化白蛋白2.0g，溶解于100ml上述磷酸鹽溶液中。
2、酶活力效價(jià)測(cè)定1)將樣品溶液、底物溶液在37℃±0.5℃水浴箱中預(yù)熱10min。
2)用加樣器吸取底物溶液1.0ml、樣品溶液100μl注入試管中，置37℃±0.5℃水浴箱反應(yīng)10分鐘。
3)取出試管，加入5％三氯乙酸溶液1ml，混合。
4)1000×g離心5分鐘，吸取上清液1ml，加入0.5mol/L氫氧化鈉溶液1ml，混合。
5)在430nm下測(cè)定該溶液OD值。
6)活力效價(jià)定義在上述條件下，酶樣品溶液在430nm產(chǎn)生0.002吸光值的改變?yōu)橐粋€(gè)酶活力效價(jià)單位。
7)活力效價(jià)計(jì)算公式公式IPU＝A/0.002×10×100/10/W式中A為吸光度值；0.002為1酶活力單位；10為系數(shù)；100為酶樣品溶液體積，(ml)；10為反應(yīng)時(shí)間(分鐘)；W為酶樣品重量，(mg)。
公式IIPU＝A/0.002×10×100/W式中A為吸光度值；0.002為1酶活力單位；10為系數(shù)；100為酶樣品溶液的體積(ml)；W為酶樣品重量，(mg)。
按照上述的計(jì)算公式I計(jì)算酶活力木瓜凝乳蛋白酶為750PU/mg，木瓜蛋白酶為500PU/mg，菠蘿蛋白酶450PU/mg，無(wú)花果蛋白酶為480PU/mg。
按照上述的計(jì)算公式II計(jì)算酶活力，木瓜凝乳蛋白酶為7500PU/mg，木瓜蛋白酶為5000PU/mg，菠蘿蛋白酶4500PU/mg，無(wú)花果蛋白酶為4800PU/mg實(shí)施例4巰基蛋白酶制劑活力效價(jià)測(cè)定本實(shí)施例分別測(cè)定木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶制劑的活力效價(jià)，所測(cè)定的酶樣品均為本發(fā)明實(shí)施例2制備。
1溶液配制1)磷酸鹽溶液磷酸二氫鉀 0.064mol磷酸氫二鈉 0.003mol將上述溶質(zhì)溶解于900ml純水中，用純水定容至1000ml。
2)樣品溶液取標(biāo)示活力效價(jià)同為2000PU規(guī)格的木瓜凝乳蛋白酶制劑、木瓜蛋白酶制劑、菠蘿蛋白酶制劑和無(wú)花果蛋白酶制劑各1瓶，用上述的磷酸鹽溶液10毫升溶解，混合均勻。
3)底物溶液(pH7.0±0.1)稱取磷酸氫二鈉0.93mol，磷酸二氫鈉0.06mol，，用蒸餾水溶解，稀釋至1000ml定容。
稱取偶氮化白蛋白2.0g，溶解于100ml上述磷酸鹽溶液中。
2、酶活力效價(jià)測(cè)定1)將樣品溶液、底物溶液在37℃±0.5℃水浴箱中預(yù)熱10min。
2)用加樣器吸取底物溶液1.0ml、樣品溶液100μl注入試管中，置37℃±0.5℃水浴箱反應(yīng)10分鐘。
3)取出試管，加入5％三氯乙酸溶液1ml，混合。
4)1000g離心5分鐘，吸取上清液1ml，加入0.5mol/L氫氧化鈉溶液1ml，混合。
5)在430nm下測(cè)定該溶液OD值。
6)活力效價(jià)定義在上述條件下，酶樣品溶液在430nm產(chǎn)生0.002吸光值的改變?yōu)橐粋€(gè)酶活力單位。
7)活力效價(jià)的計(jì)算公式公式IPU＝A/0.002×10×2/10式中A為吸光度值；0.002為1酶活力單位；10為系數(shù)；2為酶樣品溶液體積，ml10為反應(yīng)時(shí)間(分鐘)公式IIPU＝A/0.002×10×2式中A為吸光度值；0.002為1酶活力單位；10為系數(shù)；2為酶樣品溶液的體積(毫升)；按照上述的計(jì)算公式I計(jì)算酶活力木瓜凝乳蛋白酶制劑的活力效價(jià)為2010PU/瓶，木瓜蛋白酶制劑的活力效價(jià)為2002PU/瓶、菠蘿蛋白酶制劑的活力效價(jià)為2004PU/瓶，無(wú)花果蛋白酶制劑的活力效價(jià)為2012PU/瓶；依照體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢定靈敏度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，每50μl上述的巰基蛋白酶試劑溶液所應(yīng)具備的活力效價(jià)為10-16PU。
按照上述的計(jì)算公式II計(jì)算酶活力，木瓜凝乳蛋白酶制劑的活力效價(jià)為20100PU/瓶，木瓜蛋白酶制劑的活力效價(jià)為20020PU/瓶、菠蘿蛋白酶制劑的活力效價(jià)為20040PU/瓶，無(wú)花果蛋白酶制劑的活力效價(jià)為20120PU/瓶；依照體外血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢定靈敏度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，每50μl上述的巰基蛋白酶試劑溶液所應(yīng)具備的活力效價(jià)為100-160PU。
權(quán)利要求
1.一種巰基蛋白酶的穩(wěn)定溶液，含有0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mol/L普魯蘭。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定溶液，其特征在于所述巰基蛋白酶的穩(wěn)定溶液還含有0.015-0.03mol/L乙二胺四乙酸二鉀和0.2-0.3mol/L甘露醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定溶液，其特征在于所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的穩(wěn)定溶液，其特征在于所述磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的摩爾比為20-22∶1；所述溶液pH為5.3-5.7。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的穩(wěn)定溶液，其特征在于所述每50μl酶試劑溶液應(yīng)具有的活力效價(jià)是1/10分鐘10-16PU，或10分鐘100-160PU。
6.一種測(cè)定巰基蛋白酶活力效價(jià)的方法，是用穩(wěn)定溶液配制的巰基蛋白酶酶樣品溶液與pH6.9-7.1的1-2％偶氮化白蛋白底物溶液與酶樣品溶液在36.5-37.5℃反應(yīng)10分鐘，在430nm測(cè)定OD值，計(jì)算酶活力效價(jià)；所述巰基蛋白酶的穩(wěn)定溶液含有0.06-0.08mol/L磷酸鹽、0.025-0.05mol/L L-半胱氨酸和0.05-0.10mol/L普魯蘭。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定巰基蛋白酶酶活的方法，其特征在于所述的巰基蛋白酶的穩(wěn)定溶液還含有0.015-0.03mol/L乙二胺四乙酸二鉀和0.2-0.3mol/L甘露醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的測(cè)定巰基蛋白酶酶活的方法，其特征在于所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物，它們的摩爾比為20-22∶1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的測(cè)定巰基蛋白酶酶活的方法，其特征在于所述偶氮化白蛋白是用磷酸鹽溶液配制的，所述磷酸鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的混合物，它們的摩爾比為1.5-2.5∶1。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定巰基蛋白酶酶活的方法，其特征在于所述酶活力效價(jià)測(cè)定的步驟包括1)將濃度為30-40mg/100ml的樣品溶液、底物溶液在36.5-37.5℃水浴箱中預(yù)熱10分鐘；2)將底物溶液和樣品溶液按體積比10∶1比混合，置37℃±0.5℃水浴箱反應(yīng)10分鐘；3)加入4-6％三氯乙酸溶液1ml，混合；4)離心取上清液，加入等體積的0.5mol/L氫氧化鈉溶液；5)在430nm測(cè)定酶水解液OD值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測(cè)定巰基蛋白酶酶活的方法及其專用穩(wěn)定溶液，涉及酶活測(cè)定方法。本發(fā)明所提供的巰基蛋白酶的穩(wěn)定溶液，含有0.06－0.08mol/L磷酸鹽、0.025－0.05mol/L L－半胱氨酸、0.05－0.10mol/L普魯蘭。本發(fā)明所提供的測(cè)定巰基蛋白酶酶活的方法，包括如下步驟用磷酸鹽溶液配制酶樣品，用pH6.8－7.2的2％偶氮化白蛋白溶液與酶樣品溶液在36.8－37.2℃反應(yīng)10分鐘，430nm下測(cè)定OD值，計(jì)算酶活；所述磷酸鹽溶液含有0.06－0.08mol/L磷酸鹽、0.025－0.05mol/L L－半胱氨酸、0.05－0.10mol/L普魯蘭。本發(fā)明的酶活效價(jià)的測(cè)定方法與體外血型血清學(xué)檢定實(shí)驗(yàn)條件相一致，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定、精確，適用于體外血型血清學(xué)檢定實(shí)驗(yàn)使用的巰基蛋白酶試劑的酶活力測(cè)定。
文檔編號(hào)C12Q1/37GK1584047SQ20041004610
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月31日
發(fā)明者盧世昌, 劉俊鳳 申請(qǐng)人:廣州偉仕科技有限公司