專利名稱：：一株高抗金屬鹽的微紫青霉菌的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新的青霉屬(Penicillium)真菌。更具體地，本發(fā)明涉及一種高抗銅鹽、兼具高抗多種其它金屬鹽的同時可用于吸附銅的微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)。
背景技術：
：一、銅離子在生物體中的作用需氧生物需要象銅(copper)之類的痕量(traceamount)元素，此類元素一般具有獲得和失去電子的雙重功能。在活的生物體內，銅離子以化合物形式與高濃度富電子分子共存，如硫或抗壞血酸等[1]，或者參予RNA和DNA的結構的構建[2-3]或參予其它生物代謝活動并促進生物體生長[4-5]。因此，銅離子可作為許多蛋白酶的催化中心，這些蛋白涉及到多種關鍵性的酶催化過程，如電子運輸?shù)鞍證yt氧化酶、解除氧自由基毒性的蛋白如銅/鋅SOD蛋白、抗壞血酸氧化酶、二胺氧化酶和酚氧化酶等[6-8]。由于“嗜好”參加氧化還原反應，過量的銅會導致產(chǎn)生對細胞具有極度毒性的傷害性羥基，從而引起脂類的過氧化作用和核酸的斷裂[9]。二、銅在細胞內的轉運機制及轉運因子在實驗室條件下，銅是一個上佳的催化劑，氧化破壞那些富電子分子。但在細胞內它與其它具有氧還活性的金屬一樣，是以非活性形式被螯合并轉運到細胞內的，之后通過細胞組分轉運至細胞的特定部位和反應區(qū)[1]。到目前為止，對于參予轉運銅的組分和向膜轉運的機制仍有許多細節(jié)不清楚。相對而言，在酵母中關于銅的代謝研究得相對比較深入[10]。在酵母中，銅是以一價銅(Cu+)的形式由Ctr1蛋白介導進行跨膜轉運，并被轉運到小的可溶性的細胞質銅轉運子或銅轉運伴侶蛋白(chaperones)[11]。在酵母中，至少有5種細胞內的銅轉運因子位于分泌途徑中的Ccc2(一種P型ATP酶)和多銅氧化酶Fet3、線粒體中的細胞色素氧化酶、細胞核中的銅轉錄因子、胞質溶膠中的銅/鋅SODi蛋白、胞質中的Atx1p蛋白[9-13]。已鑒定出了4種不同的銅轉運介導蛋白，其中的3種介導性的銅轉運路線是由Ctr1蛋白上將銅轉運到3個不同的細胞位點[1]1)Cox17蛋白引導銅轉運到線粒體并插入其呼吸鏈的末端氧化酶一細胞色素C氧化酶中。2)Lys7蛋白指導銅定位于細胞質溶膠使其形成一種基本的抗氧化物酶CuZnSOD。3)Atx1則將銅引導到后高爾基體(post-Golgi)腔，并借助于Ccc2(一種P型ATP酶)而最終插入具有高親和性的離子吸收所必須的多銅氧化酶Fet3。4)Atx1p蛋白是將細胞表面的轉運因子中的銅離子轉運到Ccc2和Fet3，但還不知道該蛋白是否與銅向線粒體，細胞核或胞質溶膠中的銅/鋅SOD1蛋白的轉運有關[13]。在研究過的生物體中，銅代謝涉及的轉運因子均具有同源性。在酵母的銅代謝中涉及的轉運因子中有銅的金屬伴侶蛋白(Coppermetallochaperone)和膜轉運子[1-3，13-20]，其中有些與人類的一些蛋白同源酵母Atx1/人Hah1、酵母Lys7/人Ccs1、酵母Cox17/人Cox17、酵母Ccc2/人Wilson病蛋白[21]。這些結果說明，在許多方面，酵母和人類之間的銅和離子的體內穩(wěn)定機制是相似的。銅在生物體內的轉運途徑并不是固定不變的，可隨銅離子的濃度而發(fā)生變化。在酵母中，在低濃度銅條件下，銅離子的細胞內的轉運采用一種轉運路線。當培養(yǎng)基中銅鹽濃度較高時，銅離子轉運完全采用其它的旁側途徑[1]。三、生物體的抗銅機制如同其它重金屬，銅是構成地殼的元素之一。自然狀態(tài)下，銅多存在于各種礦物中，其含量一般低于0.1％，屬微量重金屬元素[15]。從生物利用角度，重金屬的特點是不能被降解而從環(huán)境中徹底消失、只能從一種形態(tài)轉化為另一種形態(tài)、從高濃度變?yōu)榈蜐舛?、部分可在毒性一無毒或低毒狀態(tài)之間轉化、能在生物體內積累富集[16]。部分重金屬可以一定量(微量)的水平或某種離子價態(tài)參予生物體的一些特殊的生長代謝活動[17]。生物在演化過程中，在其細胞體內發(fā)展了一套感應、轉運和螯合銅的系統(tǒng)，以維持銅的基本需求和其毒性水平之間的精細平衡[4，18-20，22]，因而生物體或多或少的具有銅抗性，并演化出一套復雜的抗銅機制。原核生物主要依靠P-型的ATPase輸出泵調節(jié)體內的銅離子濃度而獲得銅的抗性[13，23-25]；真核生物主要依賴關閉銅離子的吸收通道和合成金屬硫蛋白兩種機制獲得銅抗性[26]。實際上銅抗性涉及到多個代謝過程和復雜的機制，例如與銅抗性相關的銅內平衡過程是和導致細胞傷害的氧自由基的代謝的部分過程相互重疊的[4，24]。四、銅的污染及危害工業(yè)化的發(fā)展加之銅的廣泛使用已使包括自然水、各種有機廢水、工業(yè)廢棄物如媒阡、沉積的淤泥、金屬加工生產(chǎn)區(qū)的周邊環(huán)境等均出現(xiàn)銅污染現(xiàn)象[15，27-37]。銅過量之后便會產(chǎn)生污染，污染一般會造成植物植株的矮化、生長緩慢、生物量大幅度下降[27，38-39]；銅過量后也會造成人體的代謝紊亂，可造成多種疾病，代表性疾病如Menkes綜合癥和Wilson病[21，40-41]、神經(jīng)退化病(NeurodegenerativeDiseases)[42]、致死性運動神經(jīng)元病(fatalmotorneurondisease)[3]等許多其它疾病[44-45]。其中原因之一是在分子水平上可造成DNA和RNA損傷[42]。銅的毒性是氧依賴性，其過程遵循Harber-Weiss反應，產(chǎn)生活性氧中間體[45]或者是以不適當方式與生物分子相結合[19]；重金屬離子對微生物群落的影響有兩方面低濃度時對微生物群落的發(fā)展有促進作用，高濃度時則有抑制作用，不同類群微生物的敏感度不同，通常是放線菌＞細菌＞真菌[17，46-47]。土壤受重金屬污染愈重，微生物種群數(shù)量愈少；耐單一種類重金屬的相對較多；耐2種或2種以上的重金屬離子的極少；土壤中的微生物較之空氣微生物的抗(耐)性高。以銅污染為例，有研究報道表明，對照土壤(Cu＜100mg/L)有35種真菌，中度污染土(1000mgCu/L)中有25種真菌，高度污染土(10000mgCu/L)僅有13種真菌[47-48]?？諝庵械脑S多微生物對重金屬的耐性僅在10mM左右，如已報道的從空氣分離到的82種真菌分離物中，52種(鏈孢屬(Alernaria)、曲霉屬(Aspergillus)、枝孢霉屬(Cladosporium)、青霉屬(Penicillium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、葡萄穗霉屬等)分離物只耐1種金屬(As2+、Cd2+、Co2+、Cr2+、Hg2+、Ni2+、Pb2+)，僅有15種霉菌和1種酵母耐濃度為10mM的2種以上金屬[27，38-39，49]。五、銅的污染的治理現(xiàn)狀及其研究發(fā)展方向如同其它重金屬，銅污染的工業(yè)治理技術主要采用物理化學的方法，如吸附、離子交換、膜和化學沉淀以及溶劑抽提等，效果雖為明顯，但投資、運行費極高，操作復雜難以推廣，對于大流域低濃度的污染更是無法施展[50]。與其它重金屬一樣，由于銅不能被生物體代謝為另一種元素物質，目前對其造成的污染的生物治理主要以去除(removal)或回收(recovery)的生物修復(bioremedation)為主，主要途徑有兩種1)通過在污染農(nóng)田、土壤中種植某些木本、經(jīng)濟植物利用其對重金屬的吸收、累積、耐性和濾過性除去重金屬。2)利用生物化學、生物有效性和生物活性特性，把重金屬轉化為較低毒性的產(chǎn)物(絡合態(tài)、脫烷基、改變價態(tài)等)，或者利用重金屬與微生物的親合性進行吸附及生物學活性來固化、轉化降低重金屬的毒性和遷移能力[16，47，51-53]。目前用于重金屬污染修復的生物物種主要有植物、微生物、藻類三大類[13，16-18，28-31，33-34，49，51-63]，有死體和活體生物修復技術之分[29，49-50，57]。生物修復的機理大致有活體細胞的主動吸收、被動吸收、淋濾、解析和轉化等過程[54，61-62]。六、銅污染的生物修復發(fā)展方向目前包括銅在內的許多重金屬的大面積土壤污染是以植物生物修復為主，同時也已克隆了許多抗重金屬的基因(參見http//www.ncbi.nlm.nih.govGenBank)，最具代表性的是在多種生物體內克隆到的能與多種重金屬結合的結合肽或金屬硫蛋白(MTs)、金屬硫蛋白樣蛋白、植物螯合素(phtochelatin)和金屬抗性調節(jié)蛋白基因等，并以此類基因構建修復重金屬污染的轉基因生物[21，45，50，64]。但是絕大部分克隆報道的是單一重金屬抗性基因(參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov；GenBank)。雖然，轉MTs蛋白基因的植物報道很多并在局部的重金屬污染修復中取得了較為滿意的結果，由于基因工程研究中固有的技術問題仍然存在，如啟動子的表達效率不穩(wěn)定、在植物受體中表達部位不確定，或因受體內部復雜的原因導致表達的異源MTs蛋白失活等[57]，從而限制了進一步推廣應用。重金屬污染生物修復的發(fā)展方向之一是微生物展示技術(microbialdisplaytechnology)，這是將與重金屬高度親合的肽或蛋白通過基因工程技術使其定位表達在微生物的表面，提高微生物對重金屬的吸附能力，從而消除重金屬的污染或回收稀有貴重金屬，但是這一技術本身并不能增強微生物對重金屬的抗耐受水平[45]。近年來，在真菌中，已經(jīng)嘗試利用含銅誘導的啟動子(該啟動子來自酵母金屬硫蛋白基因)的多拷貝質粒，克隆編碼鋅指(zinc-finger)轉錄因子的基因并轉化酵母(S.cerevisiae)，構建細胞表面工程酵母，以其回收和去除銅離子[62]。另一發(fā)展方向是免(未)培養(yǎng)微生物技術(unculturedmicrobes)，此項技術發(fā)展也十分迅速，成為尋找抗重金屬的新的微生物種群及克隆新的重金屬抗性基因的一條新穎的途徑。但這一技術目前主要集中在菌體的鑒定。在細菌中已通過克隆、測序分析細菌16srRNA基因鑒定了許多抗性類群(參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov；GenBank)，存在的問題是即使已發(fā)現(xiàn)免(未)培養(yǎng)微生物，因受現(xiàn)有技術所限而無法獲得其培養(yǎng)物。七、微生物銅抗性研究和應用中的問題高抗銅性同時兼具高抗多種其它重金屬鹽的、具有高吸附能力的微生物菌株的開發(fā)無疑在生物體的銅抗性的理論研究如抗銅代謝途徑、抗銅和耐高滲透壓新基因的克隆、銅污染的微生物修復應用中具有重要意義。這類菌株也可進一步開發(fā)為構建可降解重金屬鹽一有機物混合污染環(huán)境中的有機污染物的基因工程菌的受體菌株。但目前微生物銅抗性研究和應用中的問題存在如下問題1)迄今為止，在真菌中發(fā)現(xiàn)的單抗銅的抗性水平最高的是一種白假絲酵母(Candidaalbicans)，其抗銅水平最高也只為50mMCuSO4[26]。2)對于包括銅(Cu)在內的重金屬與青霉屬的菌株(Penicilliumspp.)生長、代謝等的關系的研究已十分廣泛[65-66]。雖然報道認為Penicilliumjanthineleum是最常見的鋅(Zn)的積累者[67]。也在該種菌中分離到了可高抗100mMAlCl3的株系[68]。但是迄今尚未見報道有極高抗銅鹽、富集銅并能析出銅的、耐高濃度的鹽(NaCl)，同時又兼具高抗多種其它有毒重金屬鹽的Penicilliumjanthineleum的分離株系或其它真菌屬種。3)如果某種微生物能夠在高濃度銅鹽環(huán)境中不斷生長，而且其菌體具有較高的銅離子吸附能力，至少可以做到一次投加菌體可以無需復加而達到延長菌體的長時期的去除能力，減少操作環(huán)節(jié)和工藝從而降低成本。但目前無此方面的研究報道、應用實例和菌種專利。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個方面涉及一種微生物微紫青霉菌株(Penicilliumjanthinellum)，其屬于青霉屬(Penicillium)真菌，能夠高抗銅鹽，富集并能析出銅的兼具高抗多種其它金屬鹽。該菌株于2003年10月31日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(北京，中關村，北一條)，保藏號為CGMCC1027。本發(fā)明的另一個方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在吸附和/或抗銅鹽和/或鋅鹽方面的應用。本發(fā)明的另一個方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在吸附和/或抗銅鹽或鋅鹽以外的金屬鹽方面的應用。本發(fā)明的另一個方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在浸礦方面的應用。本發(fā)明的另一個方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在制備用于治理重金屬環(huán)境污染的生物吸附劑方面的應用。本發(fā)明的另一個方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在構建可降解重金屬鹽—有機物混合污染環(huán)境中的有機污染物的基因工程菌中的應用。圖1微紫青霉菌株GXCR的ITS序列。圖2顯示在500ml體積的三角瓶中，加入200ml的液體培養(yǎng)基PDL，并接種105個微紫青霉菌株GXCR分生孢子，在不同溫度下，150rpm搖床培養(yǎng)7天后的菌體生長量的圖表(圖中的直條線為3個獨立實驗的平均值標準誤)。圖3顯示在500ml體積的三角瓶中，加入200ml的不同pH的液體培養(yǎng)基PDL，并接種105個微紫青霉菌株GXCR分生孢子，32℃，150rpm搖床培養(yǎng)7天后的菌體生長量的圖表(圖中的直條線為3個獨立實驗的平均值標準誤)。圖4顯示在500ml體積的三角瓶中，加入200ml的不同pH的含金屬鹽的液體培養(yǎng)基PDL，并接種105個微紫青霉菌株GXCR分生孢子，32℃下培養(yǎng)5天時，該菌的菌體生長量的圖表(◆Cu；■Cr6+；▲Pb；×Zn，圖中的直條線為3個獨立實驗的平均值標準誤)。圖5顯示微紫青霉菌株GXCR在含Cu和Mn的PDA培養(yǎng)基上32℃培養(yǎng)7天的生長狀況的圖片，其中APDA-Cu；BPDA-Cu-5mM的Mn；CPDA-Cu-5mM的Mn-添加有機營養(yǎng)(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)(圖中的數(shù)字代表Cu的濃度)。圖6顯示微紫青霉菌株GXCR在含Cu、Zn/Al的PDA培養(yǎng)基上32℃培養(yǎng)7天的生長狀況的圖片，其中APDA-Cu；BPDA-Cu-5mM的Zn；CPDA-Cu-5mM的Zn-添加有機營養(yǎng)(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)；DPDA-Cu-5mM的Al；EPDA-Cu-5mM的Al-添加有機營養(yǎng)(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)(圖中的數(shù)字代表Cu的濃度)。圖7顯示微紫青霉菌株GXCR在含Cu和Cd的PDA培養(yǎng)基上32℃培養(yǎng)7天的生長狀況的圖片，其中APDA-Cu；BPDA-Cu-2mM的Cd；CPDA-Cu-2mM的Cd-添加有機營養(yǎng)(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)(圖中的數(shù)字代表Cu的濃度)。圖8顯示微紫青霉菌株GXCR在PDA培養(yǎng)基上的生長狀況的圖片，其中A未添加Cu的PDA，32℃培養(yǎng)7天；B未添加Cu的PDA，32℃培養(yǎng)20天；C含40mM的Cu的PDA，32℃培養(yǎng)20大(C1正面氣生菌落)；C2氣生菌落的背面)；D含40mM的Cu的PDA，32℃培養(yǎng)20d以上。圖9顯示微紫青霉菌株GXCR的氣生菌絲體的掃描電鏡(SEM)觀察的圖片，其中A1-2未添加Cu的PDA在32℃培養(yǎng)20天以上；B1-4含40mM的Cu的PDA，32℃培養(yǎng)20天以上。圖10顯示在未添加或添加40mMCu的PDA上，32℃培養(yǎng)20天以上，微紫青霉菌株GXCR氣生菌落正面菌絲體成份的能譜分析(EDAX)，A1未添加Cu的PDA培養(yǎng)基；A2未添加Cu的PDA上的氣生菌落；B1添加40mMCu的PDA上的正面氣生菌落；B2添加40mMCu的PDA上的正面氣生菌落下方的PDA培養(yǎng)基。圖11顯示在500ml體積的三角瓶中，加入200ml的含不同濃度Cu的液體培養(yǎng)基PDL，并接種105個微紫青霉菌株GXCR分生孢子，28℃，150rpm搖床培養(yǎng)5天后，生長菌絲表面對Cu的生物吸附和菌體細胞內的Cu積累的圖表(□生物吸附；◇生物累積(累積量太小，累積曲線與X軸重合)；圖中的直條線為3個獨立實驗的平均值標準誤)。圖12顯示在500ml體積的三角瓶中，加入200ml的含不同濃度Cu的去離子水中(自然pH)，接種1.5g的微紫青霉菌株GXCR菌體，28℃，150rpm搖床培養(yǎng)30分鐘，0.5mM的NaOH預先處理(浸泡)30分鐘的微紫青霉菌株GXCR菌體和未經(jīng)0.5mMNaOH預處理(自然狀態(tài)的)的微紫青霉菌株GXCR菌體表面的Cu的生物吸附的圖表(◇0.5mM的NaOH預處理(浸泡)的菌體；◆未經(jīng)0.5mMNaOH預處理的菌體；虛線表示對照菌株桔青霉(Penicilliumcitrinum)。直條線表示3個獨立實驗的平均值標準誤)。本發(fā)明的微紫青霉菌株GXCR于2003年10月31日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(北京，中關村，北一條)，保藏號為CGMCC1027。具體實施例方式下面參考實施例詳細描述本發(fā)明。應當理解，下述實施例是為了更好地理解本發(fā)明，而不是為限制本發(fā)明的目的。培養(yǎng)微紫青霉菌株GXCR所用的培養(yǎng)基如下1)PDA(1000ml)20％(w/v)馬鈴薯，1.5％葡萄糖，1.5％瓊脂，pH7.02)PDL無瓊脂的PDA培養(yǎng)細菌所用的培養(yǎng)基如下LB培養(yǎng)基(1000ml)胰蛋白胨10.0g；酵母提取物5.0g；NaCl5.0g；pH7.0本發(fā)明所用金屬鹽Al(Al2(SO4)3)；Cd(CdCl2·2.5H2O)；Cr6+(K2Cr2O7)；Cr3+(CrCl3·6H2O)；Cu(CuSO4·5H2O)；Mn(MnCl2·4H2O)；Ni(NiCl2·6H2O)；Pb(PbAc2·3H2O)；Zn(ZnSO4·7H2O))均購自廣西科學器材進出口公司。實施例1微紫青霉菌株的獲得土樣品的采集和真菌菌株的篩選從銅礦礦區(qū)洗礦水排水溝的上、中、下游三處采集底泥(表層以下10cm)，每處約500g，裝入玻璃瓶。稱取所采泥樣10g，放入250ml三角瓶中，加入無菌水100ml，用玻璃棒充分攪拌，靜置30分鐘后，取上清液1ml，用無菌水將上清液按10倍梯度稀釋后涂布于含有5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mMCu的PDA平板上，28℃培養(yǎng)7天，將長出的候選真菌菌落轉移至新的含相應濃度的Cu的PDA培養(yǎng)基平板上純化后作候選菌株保存。將所有得到的候選真菌菌株再接種至含有40mM的Cu的PDA平板上，28℃培養(yǎng)7天，將能夠繼續(xù)生長的真菌菌落轉至新的含40mM的Cu的PDA平板上，28℃培養(yǎng)后保存。用此方法獲得了一株在含40mM的Cu的PDA平板上正常生長的真菌菌株，并將該菌株編號為GXCR。實施例2GXCR生物學特征及其特性1)GXCR的固體培養(yǎng)特征GXCR菌株在PDA上28℃培養(yǎng)時，其菌落呈圓形或接近圓形，菌落扁平，培養(yǎng)初期(48小時)氣生菌絲呈白色。隨著培養(yǎng)時間的增加，由于分生孢子的產(chǎn)生，菌落會逐漸由灰綠色變成淡黃褐色(圖8B)。光學顯微鏡鏡鑒結果表明，該菌菌絲及孢子梗光滑，初生孢子梗呈指狀一級分枝，頂生1～4個柱狀小梗，小梗頂串生10～20個分生孢子，分生孢子圓形或橢圓形，根據(jù)上述形態(tài)特征和文獻[69]，該菌屬于青霉屬(Penicillium)真菌。2)GXCR的染色體的內轉錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer；ITS)的DNA序列真核生物的染色體DNA內轉錄間隔區(qū)ITS的序列是染色體DNA上一段保守的rDNA的核苷酸序列，由于該序列具有種的特異性，因此，它現(xiàn)在是被廣泛采用的鑒定真核生物物種的重要的分子生物學標準。(a)GXCR的總DNA的制備在100ml的PDL培養(yǎng)基中，接種105個GXCR的分生孢子，28℃下培養(yǎng)48小時，用210目篩絹過濾收集菌體，用吸水紙將水分吸干。移入-20℃預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末。立即將粉末轉入預冷的50ml離心管中，加入10ml的DNA提取液(200mM的NaCl，4mM的EDTA-Na，0.2％的SDS，0.1M的Tris-HCl，pH8.0)，緩慢顛倒混勻；加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻后4℃，12000rpm離心15分鐘，將上清液轉移至新的滅菌離心管中。用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)再抽提一次，將上清轉移至新的離心管，加入1/10體積的8M的LiCl，混勻，置冰上1小時。然后，4℃，12000rpm離心10分鐘。取上清，加入2.5倍體積無水乙醇，混勻后-80℃放置30分鐘。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清液，沉淀塊用75％乙醇洗滌2次，室溫干燥后溶于1×TE緩沖液(10mM的Tris-HCl(pH8.0)，10mM的EDTA)中備用。(b)用于PCR擴增GXCR的ITS序列的引物引物按文獻報道設計[70，71]，引物由上海生工公司合成。引物15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQIDNO1)引物25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQIDNO2)(c)PCR擴增[70]反應體系10×緩沖液(Takara公司)10μldNTPs(Takara公司)4μlGXCR菌體的DNA模板20μg/2μl引物1(25pM)4μl引物2(25pM)4μlDMSO(二甲亞砜)6μlTaq-酶(5U/μl)(Takara公司)1μl滅菌去離子水(ddH2O)69μl總體積100μlPCR反應條件第一階段95℃，2分鐘；第二階段(35個循環(huán))96℃，30秒，55℃，1分鐘，72℃，1分鐘第三階段72℃，10分鐘。PCR產(chǎn)物回收PCR產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠，5v/cm條件下電泳1小時，溴乙錠染色后，長波長紫外燈下切取600bp處的目標DNA帶，用華瞬公司的膠回收試劑盒回收DNA。將回收產(chǎn)物溶于30μl的1×TE緩沖液中備用。(d)PCR產(chǎn)物的克隆試劑采用上海生工公司的pUCM-TVector試劑盒，并按說明書使用。膠回收PCR產(chǎn)物回收后，連接克隆到pUCM-T載體。連接反應體系如下10×連接緩沖液1μlpUCm-T載體1μl膠回收的PCR產(chǎn)物1μl(10μg)滅菌ddH2O6μlT4DNA連接酶1μl(1U)總體積10μl連接溫度條件將連接反應體系液放在16℃，24小時。連接產(chǎn)物的純化將連接液在65℃放置5分鐘中止反應。加入1/10體積5M的醋酸鉀(KAc)和2倍體積無水乙醇。-80℃放置30分鐘以上(或20℃過夜)。離心，去上清，沉淀用75％乙醇洗滌4～5次，12000pm離心，小心吸取殘余的乙醇液。室溫干燥后，溶于5μl的ddH2O中。轉化將5μl連接好的重組載體DNA(PUCm-ITSDNA片段)水溶液，與40μl的EscherichiacoliJM109感受態(tài)細胞(Takara公司)混勻后，移入預冷的電脈沖杯中，200Ω、25μD、12.5KV/cm電擊，電擊后馬上在電脈沖杯中加入1ml預冷的SOC培養(yǎng)基(InvitrogenTM公司)，加蓋搖勻后吸出菌液，37℃搖床培養(yǎng)1小時，將細菌涂布在含有氨芐青霉素Amp(100μg/ml)且表面預先用20μl的100mM的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(上海生工公司)和100μl的20mg/mlX-gal(上海生工公司)涂布的LA培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)16小時。挑取白色轉化子菌落轉接于含有氨芐青霉素Amp(100μg/ml)，的LA培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)16小時后，4℃保存。轉化子的質粒提取挑取白色的轉化子菌落，接種在含有Amp的10ml的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)16小時。然后用快速堿裂解法提取質粒[72]，用PstI酶切(Promega公司)，0.7％瓊脂糖凝膠電泳，將連接有600bp左右的DNA片段的轉化子菌體克隆保存?zhèn)溆?。之后，用快速堿裂解法提取這些白色轉化子的質粒用于測序。DNA測序委托上?；瞪锕こ坦具M行。序列參見圖1。如此獲得了GXCR的ITS序列(SEQIDNO3)，DNA測序結果表明，GXCR的ITS序列全長586bp(圖1)。利用Genbank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中的核苷酸同源行分析軟件BlastN對GXCR的ITS序列進行同源比較分析發(fā)現(xiàn)，GXCR的ITS序列與102株已報道的Penicilliumspp.的ITS序列有≥97％的一致性，其中與PenicilliumjanthinellumATCC4845的ITS序列(Genbank索引號AY373921)同源性最高同源性得分值(Score)＝1134，E值(Expect)＝0.0，一致性(Identities)＝586/588(99％)，間隔(Gaps)＝2/588(0％)。據(jù)此結果并結合形態(tài)鑒定，將GXCR鑒定為微紫青霉菌株(Penicilliumjanthinellum)，編號為GXCR，全稱為PenicilliumjanthinellumGXCR。3)微紫青霉菌株GXCR的生長溫度和pH范圍在500ml的三角瓶中，加入200ml的PDL培養(yǎng)基，之后，接種105個微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，在不同溫度下，培養(yǎng)7天，用210目篩絹過濾收集菌體，收集的菌體置于65℃烘烤4小時后稱重，根據(jù)該菌的菌體干重(g/L)，可知該菌的生長溫度范圍為22-42℃，最佳生長溫度為32℃(圖2)；在最佳生長溫度32℃條件下，按同樣的方法，測定菌體干重，根據(jù)該菌的菌體干重(g/L)，可知該菌的生長的pH范圍為2.0-9.0，最佳生長pH為5.0(圖3)。4)微紫青霉菌株GXCR菌株與其它參考菌株的抗銅性比較為了驗證GXCR菌株的高抗銅鹽的能力，我們作了如下對比試驗。例1將微紫青霉菌株GXCR菌體、購自Invitrogen公司的2株酵母Pichiapastoris、P.methanolica和Saccharomycescereivisae分別接種于含40mM的Cu的PDA和不添加Cu的PDA培養(yǎng)基，置于32℃培養(yǎng)5天。結果發(fā)現(xiàn)，只有微紫青霉菌株GXCR既可同時在含40mM的Cu的PDA和不添加Cu的PDA培養(yǎng)基上同時生長。三種酵母菌不能在含40mM的Cu的PDA培養(yǎng)基上生長，只能在不添加Cu的PDA培養(yǎng)基上生長(表1)。表1微紫青霉菌株GXCR與其它酵母菌的生長比較+生長；-不生長例2將微紫青霉菌株GXCR菌體和購自中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC(中國科學院微生物研究所)的3株惡臭假單孢菌(Pseudomonasputida)1.761、惡臭假單孢菌(P.putida)1.781和惡臭假單孢菌(P.putida)1.924；購自Invitrogen公司的大腸桿菌(Escherichiacoli)DH10B和購自TakaRa公司的大腸桿菌JM109分別接種于含40mM的Cu的PDA和不添加Cu的PDA培養(yǎng)基，置于32℃培養(yǎng)5天。結果發(fā)現(xiàn)，只有微紫青霉菌株GXCR既可同時在含40mM的Cu的PDA和不添加Cu的PDA培養(yǎng)基上同時生長。3株假單孢菌和2株大腸桿菌均不能在含40mM的Cu的PDA培養(yǎng)基上生長，只能在不添加Cu的PDA培養(yǎng)基上生長(表2)。表2微紫青霉菌株GXCR與其細菌菌株的生長比較+生長-不生長例3將未預先接種任何菌體的和接種了微紫青霉菌株GXCR菌體的含40mM的Cu的PDA、40mM的Cu的LA、不添加Cu的PDA、和不添加的Cu的LA培養(yǎng)基平板(培養(yǎng)均盛在培養(yǎng)皿)，然后不蓋皿蓋，在培養(yǎng)基表面放置一團濕棉球，然后，置于室外(溫度約為夜28-晝37℃)放置10天(培養(yǎng)期間保持棉球濕潤，維持培養(yǎng)基不干燥)。結果是在40mM的Cu的PDA、40mM的Cu的LA培養(yǎng)基上只有微紫青霉菌株GXCR菌體生長，而無其它雜菌出現(xiàn)。在不添加Cu的PDA、和不添加的Cu的LA培養(yǎng)基平板，除預先接種的微紫青霉菌株GXCR的菌落外，尚有大量的雜菌的菌落出現(xiàn)(表3)。這些結果在一定程度上說明了GXCR是一株高抗Cu菌株。表3暴露在空氣中的PDA和LA培養(yǎng)基上的菌體培養(yǎng)結果+有菌落形成；-無菌落形成5)微紫青霉菌株GXCR對金屬鹽的抗性特征a)pH與微紫青霉菌株GXCR的對單一金屬鹽抗性在500ml的三角瓶中，加入200ml的含金屬鹽的不同pH的PDL培養(yǎng)基，之后，接種105個微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，32℃下培養(yǎng)7天，用210目篩絹過濾收集菌體，收集的菌體置于65℃烘烤4小時后稱重，該菌的菌體干重(g/L)。在測試鹽濃度條件下(40mM的Cu、2mM的Cr6+、5mM的Pb和40mM的Zn)，該菌對Cu、Cr6+和Pb的抗性隨pH增大而下降，在pH為3時，其抗性最強。但是，在pH為6時，對Zn的抗性最強，總體上pH的變化對該菌的Zn的抗性影響不大(圖4)。b)限制微紫青霉菌株GXCR生長的金屬鹽的最小濃度用滅菌的打孔器(直徑0.2cm)從不含Cu的PDA培養(yǎng)基平板上32℃培養(yǎng)5天的微紫青霉菌株GXCR菌落邊緣打菌餅，將菌餅接種于含不同濃度金屬鹽的PDA培養(yǎng)基(自然pH)上，32℃培養(yǎng)7天，同時以不添加金屬鹽的PDA培養(yǎng)物作平行對照，觀察菌落的生長狀況；在500ml的三角瓶中，加入200ml的含不同金屬鹽的PDL培養(yǎng)基(自然pH)，之后，接種105個微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，32℃，150rpm搖床培養(yǎng)7天，同時以不添加金屬鹽的PDL培養(yǎng)物作平行對照。根據(jù)PDA培養(yǎng)基上的是否有明顯的菌落生長及PDL培養(yǎng)基中是否有菌絲體形成判斷限制微紫青霉菌株GXCR生長的各金屬鹽的濃度。結果見表4。表4限制微紫青霉菌株GXCR生長的金屬鹽的最小濃度*重復3次c)微紫青霉菌株GXCR對三種金屬鹽混合物的抗性在500ml的三角瓶中，加入200ml的含不同濃度、不同種金屬鹽的PDL培養(yǎng)基(自然pH)，之后，接種105個微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，32℃，150rpm搖床培養(yǎng)5天，同時以不添加金屬鹽的PDL培養(yǎng)物作平行對照。用210目篩絹過濾收集菌體，收集的菌體置于65℃烘烤4小時后稱重，該菌的菌體干重(g/L)。根據(jù)正交實驗(L9(43))結果，在設計的鹽濃度(20mM和40mM的Cu，1mM和3mM的Cd，1mM和3mM的Pb，100mM和200mM的Zn)條件下(表5)，表6結果表明，各處理間的F值的大小順序為AF＞CF＞BF＞DF，其AF、CF和BF值均大于F0.01(2，10)＝7.56，達到極顯著差異，但處理D的值DF小于F0.05(2，10)＝4.10，未達到顯極著差異水平。說明，在本設計濃度下的單一金屬鹽對該菌的生長影響的順序為Cu＞Cd＞Zn＞Pb(表6)。Dunca’sLSR(表7)及方差分析(表8)結果表明該菌在含3mM的Cd-3mM的Pb-200mM的Zn(處理3)，20mM的Cu-1mM的Pb-200mM的Zn(處理6)、40mM的Cu-3mM的Pb-100mM的Zn(處理8)或40mM的Cu-1mM的Cd-200mM的Zn(處理9)混合鹽的PDL培養(yǎng)基中能夠生長。在含20mM的Cu-1mM的Cd-3mM的Pb(處理4)混合鹽的PDL培養(yǎng)基中生長相對較差。但不能在含20mM的Cu-3mM的Cd-100mM的Zn(處理5)或40mM的Cu-3mM的Cd-1mM的Pb(處理7)混合鹽的PDL培養(yǎng)基中生長。表5.三種金屬鹽組合對微紫青霉菌株GXCR生長影響的正交實驗(L9(43))DM干菌體表6.因素(Cu、Cd、PbandZn)之間的方差分析*F0.05(2，10)＝4.10；F0.01(2，10)＝7.56**極顯著差異表7.Dunca’s新復極差測驗中的LSR值表8.不同的金屬鹽混合物處理間的微紫青霉菌株GXCR菌體干重的顯著性比較※※大于LSR0.01值，達到極顯著差異d)金屬鹽之間的相互作用對微紫青霉菌株GXCR生長的影響i)Mn的存在能顯著提高GXCR對Cu的抗性用滅菌的打孔器(直徑0.2cm)從不含Cu的PDA培養(yǎng)基平板上32℃培養(yǎng)5天的微紫青霉菌株GXCR菌落邊緣打菌餅，將菌餅接種于含不同濃度(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu、(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Mn和(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Mn-添加有機營養(yǎng)(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培養(yǎng)基(自然pH)上，32℃培養(yǎng)7天，觀察菌落的生長狀況。結果表明，微紫青霉菌株GXCR可在含800mM的Cu-5mM的Mn的PDA固體培養(yǎng)基上生長(圖5，B)；在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Mn-添加有機營養(yǎng)(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培養(yǎng)基上的菌落雖然較小但卻明顯的致密(圖5，C)。表明Mn能有效提高微紫青霉菌株GXCR對Cu的抗性。ii)Zn或Al與Cu同時存在時，未對微紫青霉菌株GXCR的生長產(chǎn)生無毒性協(xié)同效應用滅菌的打孔器(直徑0.2cm)從不含Cu的PDA培養(yǎng)基平板上32℃培養(yǎng)5天的微紫青霉菌株GXCR菌落邊緣打菌餅，將菌餅接種于含不同濃度(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu、(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn/Al和(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn/Al-添加有機營養(yǎng)(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培養(yǎng)基(自然pH)上，32℃培養(yǎng)7天，觀察菌落的生長狀況。圖6結果表明，與在只含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu的PDA上PenicilliumjanthinellumGXCR菌落相比較(圖6，A)，在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn的PDA培養(yǎng)基上的菌落大小沒有明顯的變化(圖6，B)，表明Zn與Cu同時存在時，未對微紫青霉菌株GXCR的生長產(chǎn)生毒性協(xié)同效應。與在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn的PDA培養(yǎng)基上的菌落相比(圖6，B)，在(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn-添加有機營養(yǎng)(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培養(yǎng)基上的菌落無明顯的變化，但菌落明顯致密(圖6，C)。與在只含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu的PDA上微紫青霉菌株GXCR菌落相比較(圖6，A)，在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Al的PDA培養(yǎng)基上的菌落大小沒有明顯的變化(圖6，D)，表明Al與Cu同時存在時，未對微紫青霉菌株GXCR的生長產(chǎn)生毒性協(xié)同效應。與在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Al的PDA培養(yǎng)基上的菌落相比(圖6，D)，在(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Al-添加有機營養(yǎng)(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培養(yǎng)基上的菌落明顯的致密(圖6，E)。iii)Cd與Cu同時存在時，對微紫青霉菌株GXCR的生長產(chǎn)生顯著的毒性協(xié)同效應用滅菌的打孔器(直徑0.2cm)從不含Cu的PDA培養(yǎng)基平板上32℃培養(yǎng)5天的微紫青霉菌株GXCR菌落邊緣打菌餅，將菌餅接種于含不同濃度(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu、(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-2mM的Cd和(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-2mM的Cd-添加有機營養(yǎng)(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培養(yǎng)基(自然pH)上，32℃培養(yǎng)7天，觀察菌落的生長狀況。與在只含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu的PDA上微紫青霉菌株GXCR菌落相比較(圖7，A)，在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-2mM的Cd的PDA培養(yǎng)基上的菌落明顯變小，菌體的幾乎不能生長(圖7，B)，表明Cd與Cu同時存在時，對微紫青霉菌株GXCR的生長產(chǎn)生強烈的毒性協(xié)同效應。與在含200mM的Cu-2mM的Cd的PDA培養(yǎng)基上的菌落相比(圖7，B)，在200mM的Cu-2mM的Cd-添加有機營養(yǎng)(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培養(yǎng)基上的菌落明顯較大而且致密(圖7，C)。上述結果同時也說明，有機營養(yǎng)能夠有效提高微紫青霉菌株GXCR對金屬鹽的抗性。6)微紫青霉菌株GXCR對Cu的富集及Cu2+化合物的析出用滅菌的打孔器(直徑0.2cm)從不含Cu的PDA培養(yǎng)基平板上32℃培養(yǎng)5天的微紫青霉菌株GXCR菌落邊緣打菌餅，將菌餅接種于含40mM的Cu的PDA培養(yǎng)基上，32℃，培養(yǎng)20天時，微紫青霉菌株GXCR的菌落表面出現(xiàn)在自然光下呈現(xiàn)金屬光澤的藍色的結晶物(圖8C1，C2，D)，而在不添加Cu的PDA培養(yǎng)基上的微紫青霉菌株GXCR的對照菌落表面無此現(xiàn)象(圖8A，B)。切取在含40mM的Cu的PDA和不含Cu的PDA培養(yǎng)基上，32℃，培養(yǎng)20d時，培養(yǎng)的微紫青霉菌株GXCR的3塊(大小為0.1×0.1×0.1cm)菌塊(連同菌落下的PDA培養(yǎng)基)，表面噴金后，用日本日立S-570型掃描電鏡(SEM)掃描觀察。電鏡掃描結果表明在含40mM的Cu的PDA上的微紫青霉菌株GXCR菌絲體表面有存在大量的結晶體并填充著菌絲體之間的空間(圖9B1-4)，但是在未添加Cu的PDA上生長的微紫青霉菌株GXCR菌體表面無結晶體存在(圖9A1-2)；用日本菲利浦PV9900型能譜分析儀(EDAX)分析的結果表明未添加Cu的PDA及在未添加Cu的PDA上的微紫青霉菌株GXCR的氣生菌落無Cu2+峰(圖10A1，A2)，在含40mM的Cu的PDA上的微紫青霉菌株GXCR的菌塊的正面(即有氣生菌絲的菌塊的面)的Cu2+的能譜峰值很高(圖10B1)，相反，對應于同一菌塊的反面(即菌塊的無菌絲的面)檢測到Cu2+的能譜峰值很低(圖10B2)。這一結果表明，培養(yǎng)基中添加的Cu已被的微紫青霉菌株GXCR菌絲體富集、吸收并分泌(析出)到菌體細胞表面。因而，導致添加了Cu的PDA培養(yǎng)基中Cu含量降低。7)微紫青霉菌株GXCR對Cu的生物吸附和在其細胞內Cu的累積注其中Cu離子濃度的測定采用原子吸收法[73]i)連續(xù)的長時間培養(yǎng)條件下的生物吸附和累積在500ml的三角瓶中，加入200ml的含不同濃度Cu的PDL培養(yǎng)基(自然pH)，之后，接種105個微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，28℃，150rpm搖床培養(yǎng)5天，用210目篩絹過濾收集菌體之后再用濾紙包住菌絲體，反復擠壓至無殘液。將菌體轉入三角瓶中，加入100ml的50mM的Tris-HCl和20mM的EDTA(pH7.0)混合液，磁力攪拌器充分打散菌體，再將三角瓶放置在28℃搖床，200rpm震搖10分鐘，用210目篩絹過濾收集菌體和收集殘的洗脫液，再用錫箔紙包住菌絲體，反復擠壓并收集殘余的洗脫液之后，5000rpm離心5分鐘，分別收集菌體和合并所有洗脫液，用合并的洗脫液按同樣的方法重復洗脫菌體4次，最后合并收集的洗脫液并定容至100ml。洗脫后收集的菌體置于65℃烘烤4小時。用原子吸收法分別測定濾液中的Cu(生物吸附)和菌體細胞中的Cu(生物體內的累積)量。測定結果表明，菌體表面對Cu的生物吸附和細胞內的Cu的積累是濃度依賴型的。在20-40mM的Cu濃度下，菌絲表面對Cu的生物吸附量分別為26.0mgCu/g干菌體和26.19mgCu/g干菌體。但是在60mM的Cu濃度時，細胞內的Cu的累積達到最大，但僅為0.176mgCu/g干菌體。因此，與最大Cu的生物吸附量相比，細胞內的Cu的累積幾乎可以忽略不計(圖11)。ii)在含Cu的去離子水中，堿預浸泡處理的和未預處理(自然狀態(tài)的)的菌體對Cu的快速生物吸附在500ml的三角瓶中，加入200ml的PDL培養(yǎng)基，之后，接種105個微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，28℃，150rpm搖床培養(yǎng)5天，用210目篩絹過濾收集菌體之后再用濾紙包住菌絲體，反復擠壓至無殘液，5000rpm離心5分鐘。將離心后的菌體分兩份一份轉入200ml的0.2M的NaOH溶液中，磁力攪拌器充分打散菌體，靜置30分鐘，用210目篩絹過濾收集菌體之后再用濾紙包住菌絲體，反復擠壓至無殘余NaOH液，然后取其中的1.5g菌體轉入200ml的含不同濃度的Cu的去離子水中，磁力攪拌器充分打散菌體，28℃，150rpm搖床培養(yǎng)30分鐘后，用210目篩絹過濾收集菌體并用錫箔紙包住菌絲體，反復擠壓至無殘余液，然后將菌體轉入三角瓶中，加入100ml的50mM的Tris-HCl和20mM的EDTA(pH7.0)，磁力攪拌器充分打散菌體，200rpm震搖10分鐘，用210目篩絹過濾收集菌體之后再用濾紙包住菌絲體，反復擠壓至無殘余液，分別收集菌體和合并所有洗脫液，用合并的洗脫液按同樣的方法重復洗脫菌體4次，最后合并收集的洗脫液并定容至100ml。與此同時，用同樣的方法處理一株作為參照柑桔上的桔青霉Penicilliumcitrinum3.4039(中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，中國科學院微生物研究所)。用原子吸收法分別測定濾液中的Cu含量(代表生物吸附量)。測定結果表明，無論是0.2MNaOH預浸泡處理30分鐘的微紫青霉菌株GXCR和0.2MNaOH預浸泡處理30分鐘的參照桔青霉菌體還是未預浸泡處理(自然狀態(tài)的)的微紫青霉菌株GXCR和未預浸泡處理(自然狀態(tài)的)的參照的微紫青霉菌株的菌體，在測試的0-20mM的Cu濃度范圍內，其生物吸附能力均隨著Cu濃度的的增加而增加，而且0.2mM的NaOH預浸泡處理的微紫青霉菌株GXCR菌體的Cu的生物吸附大約是未經(jīng)0.2mM的NaOH預浸泡處理的微紫青霉菌株GXCR菌體的3倍(圖12)。在20mM的Cu濃度時微紫青霉菌株GXCR菌體和參照桔青霉的菌體，生物吸附量最大，0.2mM的NaOH預浸泡處理30分鐘的微紫青霉菌株GXCR菌體對Cu的生物吸附可達76.9mgCu/g干菌體，未用0.2M的NaOH預浸泡處理的微紫青霉菌株GXCR菌體則為38.1mgCu/g干菌體(圖12)；0.2M的NaOH預浸泡處理30分鐘的參照的桔青霉菌體生物吸附量為8.98mgCu/g干菌體，未用0.2M的NaOH預浸泡處理的參照的桔青霉菌體生物吸附量僅為7.67mgCu/g干菌體。微紫青霉菌株GXCR的0.2M的NaOH預浸泡處理的菌體的生物吸附量是0.2M的NaOH預浸泡處理的參照菌株桔青霉的菌體的生物吸附量的8.65倍。未經(jīng)0.2M的NaOH預浸泡處理的微紫青霉菌株GXCR的菌體的生物吸附量是未經(jīng)0.2M的NaOH預浸泡處理的參照的桔青霉菌體生物吸附量的4.9倍(圖12)。從圖12的曲線圖的走勢分析，隨著Cu濃度的進一步提高，Cu的吸附量有進一步提高的可能。參考文獻1.ValentineSJandGrallaEB(1997)EnhancedDeliveringCopperInsideYeastandHumanScience.278817-818.2.EnnifarE，WalterP，DumasP(2003)Acrystallographicstudyofthebindingof13metalionstotworelatedRNAduplexes.NucleicAcidsRes.31(10)2671-2682.3.OHalloranTVandCulottaVC(2000)Metallochaperones，anIntracellularShuttleServiceforMetalIons.JBiolChem.275(33)25057-25060.4.CulottaVC，JohHD，LinSJ，etal.(1995)AphysiologicalroleforSaccharomycescerevisiaecopper/zincsuperoxidedismutaseincopperbuffering.JBiolChem.27029991-29997.5.FogartyRV，TobinJM(1996)Fungalmelaninsandtheirinteractionswithmetals.EnzymeMicrobTechnol.19(4)311-317.6.RadiskyD，andKaplanJ(1999)Regulationoftransitionmetaltransportacrosstheyeastplasmamembrane..JBiolChem.2744481-4484.7.PeaMMO，LeeJ，andThieleDJ(1999)ADelicateBalanceHomeostaticControlofCopperUptakeandDistribution.JNutr.1291251-1260.8.BeaudoinJandLabbéS(2001)TheFissionYeastCopper-sensingTranscriptionFactorCuflRegulatestheCopperTransporterGeneExpr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