專利名稱：一種人野生型p53融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)人類基因P53，具體涉及一種P53融合蛋白。
背景技術(shù)：
自從Lane等發(fā)現(xiàn)P53蛋白后，國內(nèi)外許多學(xué)者對P53蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行了廣泛深入的研究，逐漸認(rèn)識到P53蛋白與人類腫瘤的關(guān)系極為密切。一方面，Barker等證明野生型P53(wild-type P53，wtP53)蛋白具有抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的能力。大量的研究也表明wtP53蛋白具有負(fù)調(diào)細(xì)胞生長和誘導(dǎo)DNA損傷細(xì)胞調(diào)亡的功能。另一方面，突變型P53(mutant-type P53，mtP53)蛋白則喪失了上述抗腫瘤的特性，并獲得了致癌活性從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展，在已檢測的人類腫瘤中，50％以上含有P53基因突變。wtP53蛋白由393個(gè)氨基酸組成，其中央核心區(qū)含有特異性DNA結(jié)合部位，腫瘤細(xì)胞中P53的大部分錯義突變位于該區(qū)。突變的P53蛋白功能失活，并引起細(xì)胞癌變。
wtP53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的腫瘤抑制因子。研究如何應(yīng)用wtP53治療腫瘤已成為腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，但因wtP53蛋白半衰期短暫，且屬于非分泌性蛋白，細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)膜上不存在P53受體或配體，因此，P53蛋白很難突破細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，國內(nèi)外的研究大多集中在通過載體(如病毒載體AAV)將P53基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，但導(dǎo)入的載體存在不安全性，因此如何使P53基因的編碼產(chǎn)物P53蛋白進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，既不影響P53蛋白的活性，又避免導(dǎo)入的載體的不安全性則是應(yīng)用wtP53治療腫瘤必須解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在用分子克隆方法制備一種人野生型P53融合蛋白以突破P53進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的難題。
本發(fā)明將人野生型P53基因全長cDNA與蛋白傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)融合，插入到融合型原核表達(dá)載體PGEX-3X的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建了正義PGEX-3X-P53重組體，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能表達(dá)人全長wtP53融合蛋白，經(jīng)親和層析純化獲得了wtP53融合蛋白，純化的wtP53融合蛋白可溶于水，無色透明，雖然半衰期很短，但在-20℃可以長期保存。分子量約為53kbp，經(jīng)DNA序列測定，它由1218個(gè)核苷酸組成，10～36為PTD序列，37～1218為wtP53蛋白表達(dá)基因序列，PTD為HIV編碼的反式激活蛋白TAT(86個(gè)氨基酸)中的9個(gè)氨基酸。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明


圖1 1、2、3、4為擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，圖2 PGEX-3X-P53原核表達(dá)重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，圖3 SDS-PAGE電泳，1為MARKER 2、4、6為未誘導(dǎo)菌3為wtP53融合蛋白加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)標(biāo)本5為GST誘導(dǎo)表達(dá)對照 7為BL21空菌對照圖4 wtP53融合蛋白高效表達(dá)和純化的SDS-PAGE膠電泳結(jié)果，1-4經(jīng)0，2，4，6h誘導(dǎo)表達(dá)的樣品5BL21空菌6PGEX-3X載體對照 7PGEX-3X載體誘導(dǎo)表達(dá)GST對照8純化后標(biāo)本 9純化標(biāo)本經(jīng)因子Xa處理后樣本圖5純化標(biāo)本W(wǎng)estern-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，1BL21空菌對照 2純化標(biāo)本1、人野生型P53融合蛋白的克隆與表達(dá)(1)設(shè)計(jì)引物引物(Primer)15’TGGGATCCGGCGTCGTCAGCAGCGACGTAAAAAGAGGATGGAGGAGCCGCAGTCAG 3’引物(Primer)25’ACGAATTCTTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTG 3’p1引物中包括酶切位點(diǎn)，PTD，起始密碼子及P53一段序列p2引物中包括酶切位點(diǎn)，終止密碼子及部分P53序列(2)PCR擴(kuò)增在0.2ml薄壁管中依次加入下列組分PRC-P53質(zhì)粒 0.5ulPrimerl1ulPrimer21ul10X PCR緩沖液 5uldNTP混合液 0.5ul50mM MgSO41ulPlatinumPfx DNA聚合酶(2.5u/ul)0.5ulDdH2O 40.5ul總?cè)莘e50ul
PCR反應(yīng)條件94℃ 5min；94℃ 45sec，60℃ 45sec，72℃ 90sec，共30cycles 72℃10min取PCR產(chǎn)物5ul，在1％瓊脂糖凝膠中電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，并用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)檢查特異性擴(kuò)增條帶大小(見圖1)。
(3)PCR產(chǎn)物的純化用QIAquickGel Extraction Kit凝膠純化試劑盒純化回收，操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。
(4)純化的PCR片段及載體PGEX-3X的酶切、純化①酶切采用通用buffer(MULTI-CORETMBuffer，Cat.NoR999A)同時(shí)進(jìn)行雙酶切的方法，具體體系如下純化的PCR產(chǎn)物16ul PGEX-3X vector 3ulEcoR I(12u/ul) 1ulEcoR I(12u/ul) 1ulBamH I(10u/ul) 1ulBamH I(10u/ul) 1ul10x MULTI-CORETMBuffer 2ul10x MULTI-CORETMBuffer 2ulTotal volume 20ul ddH2O 13ulTotal volume20ul②37℃水浴2小時(shí)30分鐘，產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，QIAquickGel ExtractionKit凝膠純化試劑盒純化回收(5)制備感受態(tài)細(xì)胞；1)新鮮過夜培養(yǎng)的BL21菌液3ml轉(zhuǎn)入100ml含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基中，用500ml三角燒瓶于37℃恒溫?fù)u床，300r/min劇烈震蕩培養(yǎng)2小時(shí)。
2)無菌條件下把細(xì)菌轉(zhuǎn)入冰預(yù)冷的50ml離心管，冰上30分鐘，冷卻到0℃。
3)4℃，4000r/min，離心10分鐘，棄上清，倒置離心管1分鐘，流盡殘留的培養(yǎng)液。
4)用10ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸細(xì)胞沉淀，冰上放置40分鐘。
5)重復(fù)第3)步6)按每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2的標(biāo)準(zhǔn)重懸細(xì)胞。
7)每200μl分裝，加入15％滅菌甘油，于-70℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?br> (6)重組PGEX-3X-P53的構(gòu)建1)建立如下連接體系，載體與插入片段的摩爾比約為1∶310X T4DNA連接酶緩沖液 1.5ul
雙酶切、純化的PGEX-3X質(zhì)粒 6ul雙酶切、純化的目的基因PCR產(chǎn)物 6ulT4DNA連接酶(3u/ul) 1.5ul總?cè)莘e15ul混勻，瞬時(shí)離心，16℃過夜，次日轉(zhuǎn)化用2)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物進(jìn)入大腸桿菌BL21中①、連接反應(yīng)產(chǎn)物15ul與感受態(tài)細(xì)胞200ul混勻，冰浴30min(另取200ul感受態(tài)細(xì)胞不加質(zhì)粒作對照)，②、42℃水浴中熱休克細(xì)菌90sec，將離心管轉(zhuǎn)入冰浴2min，③、加800ulAmp(-)LB培養(yǎng)基于上述管中；孵育45min(37℃200rpm/分)，④、1000rpm離心10min棄800μl上清液，重懸于200μlLB培養(yǎng)基中，⑤、加入X-gal(100mM IPTG200ul，50ng/ml X-gal20ul)均勻涂布在含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB瓊脂平板上(在1000ml LB培養(yǎng)基中加入15g瓊脂糖，高壓下蒸氣滅菌20分鐘，冷卻到50℃，加入適量氨芐青霉素混勻，鋪制平板)，37℃吸收30分鐘后置超凈臺上備用，⑥、將100μl菌液均勻涂布于已準(zhǔn)備好的平皿上，待干燥后放37℃培養(yǎng)箱中倒置過液培養(yǎng)。
次日從培養(yǎng)箱中取出瓊脂平板觀察，加入未酶切的PGEX-3X vector的陽性對照平板滿布針尖大小菌落，而陰性對照平板未見菌落生長。加入連接產(chǎn)物的平板有十余個(gè)白色菌落生長。
(7)小規(guī)模抽提質(zhì)粒DNA采用WizardPlus SV Minipreps DNA Purification System，提取質(zhì)粒DNA。
(8)陽性克隆的篩選和鑒定重組質(zhì)粒經(jīng)過PCR鑒定和雙酶切鑒定(見圖2)，挑選陽性克隆進(jìn)行序列測定(送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序)。
(9)誘導(dǎo)與表達(dá)挑取測序正確的陽性克隆于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，結(jié)果產(chǎn)生了wtP53融合蛋白(圖3)。
結(jié)果PGEX-3X多克隆位點(diǎn)上存在BamH I(GGATCC)及EcoR I(GAATTC)酶切位點(diǎn)，因此，我們在上游引物加了一個(gè)BamH I酶切位點(diǎn)，在下游引物加了一個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，這樣為wtP53基因正確插入到PGEX-3X載體中(即定向克隆)提供了可能。
本發(fā)明將PCR產(chǎn)物與PGEX-3X載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切、純化、連接，成功構(gòu)建了PGEX-3X-P53原核表達(dá)重組體。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR及測序證實(shí)，結(jié)果正確。序列中包含了起始密碼子和終止密碼子，方向正確。
2、重組人野生型P53融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)與純化(1)、構(gòu)建的PGEX-3X-P53轉(zhuǎn)化BL21，步驟同前述轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PGEX-3X-P53為人野生型P53融合蛋白原核表達(dá)載體，內(nèi)含Amp抗性基因和5’端融合GST標(biāo)記的人野生型P53蛋白基因，該基因的轉(zhuǎn)錄由T7啟動子控制。
(2)、工程菌發(fā)酵培養(yǎng)與誘導(dǎo)取出低溫保存的工程菌菌種接種到5ml含Amp100mg/L的LB中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)入500ml含同樣抗生素的LB中，37℃，200r/min搖瓶至OD600≈0.8，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃誘導(dǎo)2-6h，離心收集菌體，貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br> (3)細(xì)菌的裂解 解凍細(xì)菌，并在50ml離心管中用20ml裂解液重懸，充分混勻，將菌液進(jìn)行超聲破碎。破碎后的菌液于4℃，16000r/min離心30min，收集上清。
(4)親和層析純化wtP53融合蛋白 將去離子水泡過夜的谷胱甘肽膠用平衡緩沖液清洗3次，取600μl 50％的谷胱甘肽膠懸液加入細(xì)菌裂解上清液中，4℃下放置1h后，500r/min離心2min，用平衡緩沖液清洗谷胱甘肽膠3次。用500μl洗脫液把吸附在谷胱甘肽膠上的wtP53融合蛋白洗脫下來，洗3次，合并所有的洗脫液，透析脫鹽后用因子Xa處理，以切除GST。
平衡緩沖液20mmol/L Tris，PH8.0，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5％TritonX-100；裂解液平衡緩沖液，2mmol/L PMSF，0.2mmol/L DTT；洗脫液50mmol/L Tris PH8.0，20mmol/L谷胱甘肽。
SDS-PAGE分析顯示，工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在86KD處出現(xiàn)GST-wtP53融合蛋白的表達(dá)帶，經(jīng)凝膠成象系統(tǒng)分析，誘導(dǎo)6h表達(dá)時(shí)最高，占菌體總蛋白的28.2％，BL21空菌和含PGEX-3X空載體的細(xì)菌無此表達(dá)帶，而后者誘導(dǎo)后在26KD處出現(xiàn)GST表達(dá)帶，純化后可見86KD處單一的條帶，經(jīng)因子Xa處理后可見53KD和26KD處分別出現(xiàn)wtP53融合蛋白帶和切除的GST帶(圖4)。
經(jīng)Western印記法檢測表明，不含P53基因片段的菌落裂解標(biāo)本無wtP53蛋白陽性帶，而工程菌誘導(dǎo)表達(dá)并純化后標(biāo)本出現(xiàn)wtP53蛋白陽性帶(圖5)。
3、野生型P53對癌細(xì)胞的增殖抑制及調(diào)亡促進(jìn)作用供試細(xì)胞肝癌細(xì)胞HepG2、宮頸癌細(xì)胞Hela為本室保存，肺癌細(xì)胞H1299為中南大學(xué)分子藥理研究所惠贈。
(1)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT比色法)
分別消化上述供試細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×105個(gè)/ml，種96孔板，37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)24小時(shí)，按終濃度2.5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml，50μg/ml加wtP53融合蛋白，每個(gè)濃度3個(gè)平行孔，空白孔加GST作對照，繼續(xù)按上述條件培養(yǎng)72小時(shí)后每孔加20μl MTT(5mg/ml)，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μl充分溶解孔內(nèi)沉淀物，570nm波長比色檢測各孔OD值。結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用兩樣本t檢驗(yàn)，應(yīng)用軟件SPSS10.0計(jì)算分析。
結(jié)果見表1、表2表1 MTT檢測wtP53融合蛋白的細(xì)胞增殖抑制作用結(jié)果

表2wtP53融合蛋白的細(xì)胞增殖抑制作用結(jié)果(抑制率)

*p＜0.05**＜0.01
由細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1、2可以看出wtP53融合蛋白對H1299細(xì)胞、HepG2細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，特別是對H1299細(xì)胞，當(dāng)wtP53融合蛋白量加至2.5μg/ml時(shí)已有明顯抑制。
(2)TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡1)將poly-L-lysine處理的玻片置于6孔培養(yǎng)板中，分別消化HepG2細(xì)胞和H1299細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，種于已加玻片的六孔板，每孔2ml細(xì)胞懸液，24小時(shí)后加藥，空白對照加GST，實(shí)驗(yàn)孔加wtP53融合蛋白，終濃度12.5ug/ml，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)；2)取出帶細(xì)胞的玻片，用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘；3)將玻片置于用PBS(PH7.4)溶液新鮮配制的4％無甲醇的甲醛溶液中，4℃ 25分鐘固定細(xì)胞；4)用新鮮配制的PBS溶液室溫洗滌2次，每次5分鐘；5)將玻片置于用PBS溶液新鮮配制的0.2％ TritonX-100溶液中透化處理細(xì)胞5～10分鐘；6)重復(fù)步驟4；7)輕輕敲打玻片以去除多余液體，然后每塊玻片加100μl平衡緩沖液(Equilibration Buffer)，室溫10分鐘平衡；8)配制TdT孵育緩沖液冰上融化核苷酸混合物，按每反應(yīng)50μl的量配制。陰性對照孵育緩沖液以滅菌去離子水代替TdT Enzyme。具體配方見表2；表2 TdT孵育緩沖液的組成 9)用濾紙沿玻片的周邊吸凈平衡緩沖液；10)每塊玻片滴加50μl孵育緩沖液，用塑料蓋玻片覆蓋以保證溶液分布均勻，置于37℃恒溫水育箱避光反應(yīng)60分鐘(以下各步均避光操作)；11)將20X SSC溶液用去離子水稀釋10倍。移走塑料蓋玻片，將玻片置于2X SSC中室溫孵育15分鐘以終止反應(yīng)；
12)將玻片置于PBS溶液中洗滌3次，每次5分鐘，以充分洗去未結(jié)合的fluofescein-12-dUTP；13)用PBS溶液新鮮配制1μg/ml碘化丙啶(propidium iodide)40ml，將標(biāo)本置于其中室溫避光染色15分鐘；14)去離子水洗滌3次，每次5分鐘；用濾紙吸去多余的水分，立即用熒光顯微鏡觀察，波長488nm處可見到黃綠色熒光(FITC)，波長620nm處可見到紅色熒光(碘化丙啶)。結(jié)果照相保存。
陽性對照的處理第1～6步相同。此時(shí)去除玻片上的多余液體，向固定的細(xì)胞中加入100μl DNase I buffer，室溫孵育5分鐘；隨后甩去多余液體，加入含1 unit/mlDNase I的DNase I buffer 100μl，室溫孵育10分鐘；然后去除多余液體，用去離子水反復(fù)洗滌3次，每次5分鐘，以除盡DNase I；接著進(jìn)行上述7～15步。陽性對照標(biāo)本的洗滌分開進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果為大部分陽性對照細(xì)胞的細(xì)胞核中可見到綠色熒光，而陰性對照細(xì)胞沒有綠色熒光。未加藥的H1299細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中可見到少量細(xì)胞有綠色熒光，而加了wtP53融合蛋白的細(xì)胞中有綠色熒光的細(xì)胞明顯增多。說明wtP53融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)能促進(jìn)肺癌細(xì)胞H1299和肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡。
為使P53蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，我們將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(proteintransduction domain，PTD)與wtP53蛋白融合，得到產(chǎn)物wtP53融合蛋白，經(jīng)MTT法及TUNEL法體外實(shí)驗(yàn)檢測其抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，結(jié)果證實(shí)wtP53融合蛋白可明顯抑制肺癌細(xì)胞H1299、肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，促進(jìn)其凋亡。因此應(yīng)用wtP53融合蛋白治療腫瘤，避免了P53基因?qū)氲妮d體不安全性，且因?yàn)槿诤狭薖TD，在不改變其活性的基礎(chǔ)上克服了P53難以突破細(xì)胞膜的困難，有望成為一種冶療腫瘤的新藥。
<210>1<211>1218<212>cDNA<213>人野生型P53融合蛋白<220>
<400>1ggg atc cgg cgt cgt cag cag cga cgt aaa aag agg atg gag gag ccg 48Gly Ile Arg Arg Arg Gln Gln Arg Arg Lys Lys Arg Met Glu Glu Pro1 5 10 15cag tca gat cct agc gtc gag ccc cct ctg agt cag gaa aca ttt tca 96Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser20 25 30gac cta tgg aaa cta ctt cct gaa aac aac gtt ctg tcc ccc ttg ccg 144Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro35 40 45tcc caa gca atg gat gat ttg atg ctg tcc ccg gac gat att gaa caa 192Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln50 55 60tgg ttc act gaa gac cca ggt cca gat gaa gct ccc aga atg cca gag 240Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu65 70 75 80gct gct ccc ccc gtg gcc cct gca cca gca gct cct aca ccg gcg gcc 288Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala85 90 95cct gca cca gcc ccc tcc tgg ccc ctg tca tct tct gtc cct tcc cag 336Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln100 105 110aaa acc tac cag ggc agc tac ggt ttc cgt ctg ggc ttc ttg cat tct 384Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser115 120 125ggg aca gcc aag tct gtg act tgc acg tac tcc cct gcc ctc aac aag 432Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys130 135 140atg ttt tgc caa ctg gcc aag acc tgc cct gtg cag ctg tgg gtt gat 480Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp145 150 155 160tcc aca ccc ccg ccc ggc acc cgc gtc cgc gcc atg gcc atc tac aag 528Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys165 170 175cag tca cag cac atg acg gag gtt gtg agg cgc tgc ccc cac cat gag 576Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu180 185 190cgc tgc tca gat agc gat ggt ctg gcc cct cct cag cat ctt atc cga 624Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg195200 205gtg gaa gga aat ttg cgt gtg gag tat ttg gat gac aga aac act ttt 672Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe210 215 220
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<400>1Gly Ile Arg Arg Arg Gln Gln Arg Arg Lys Lys Arg Met Glu Glu Pro1 5 10 15Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser20 25 30
Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro35 40 45Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln50 55 60Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu65 70 75 80Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala85 90 95Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln100 105 110Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser115 120 125Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys130 135 140Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp145 150 155 160Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys165 170 175Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu180 185 190Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg195 200 205Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe210 215 220Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp225 230 235 240Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly245 250 255Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser260 265 270Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala275 280 285Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys290 295 300Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu305 310 315 320Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp325 330 335Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met340 345 350Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly355 360 365Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys370 375 380Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu385 390 395 400Gly Pro Asp Ser Asp40權(quán)利要求
1.一種人野生型P53融合蛋白，其特征在于該融合蛋白的cDNA的核苷酸序列和相應(yīng)的編碼氨基酸序列如下ggg atc cgg cgt cgt cag cag cga cgt aaa aag agg atg gag gag ccg 48Gly Ile Arg Arg Arg Gln Gln Arg Arg Lys Lys Arg Met Glu Glu Pro15 10 15cag tca gat cct agc gtc gag ccc cct ctg agt cag gaa aca ttt tca 96Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser20 25 30gac cta tgg aaa cta ctt cct gaa aac aac gtt ctg tcc ccc ttg ccg 144Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro35 40 45tcc caa gca atg gat gat ttg atg ctg tcc ccg gac gat att gaa caa 192Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln50 55 60tgg ttc act gaa gac cca ggt cca gat gaa gct ccc aga atg cca gag 240Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu65 70 75 80gct gct ccc ccc gtg gcc cct gca cca gca gct cct aca ccg gcg gcc 288Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala85 90 95cct gca cca gcc ccc tcc tgg ccc ctg tca tct tct gtc cct tcc cag 336Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln100 105 110aaa acc tac cag ggc agc tac ggt ttc cgt ctg ggc ttc ttg cat tct 384Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly Phe Leu His Ser115 120 125ggg aca gcc aag tct gtg act tgc acg tac tcc cct gcc ctc aac aag 432Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys130 135 140atg ttt tgc caa ctg gcc aag acc tgc cct gtg cag ctg tgg gtt gat 480Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln Leu Trp Val Asp145 150 155 160tcc aca ccc ccg ccc ggc acc cgc gtc cgc gcc atg gcc atc tac aag 528Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys165 170 175cag tca cag cac atg acg gag gtt gtg agg cgc tgc ccc cac cat gag 576Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu180 185 190cgc tgc tca gat agc gat ggt ctg gcc cct cct cag cat ctt atc cga 624Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His Leu Ile Arg195 200 205gtg gaa gga aat ttg cgt gtg gag tat ttg gat gac aga aac act ttt 672Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe210 215 220cga cat agt gtg gtg gtg ccc tat gag ccg cct gag gtt ggc tct gac 720Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp225 230 235 240tgt acc acc atc cac tac aac tac atg tgt aac agt tcc tgc atg ggc 768Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser Cys Met Gly245 250 255ggc atg aac cgg agg ccc atc ctc acc atc atc aca ctg gaa gac tcc 816Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser260 265 270agt ggt aat cta ctg gga cgg aac agc ttt gag gtg cgt gtt tgt gcc 864Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala275 280 285tgt cct ggg aga gac cgg cgc aca gag gaa gag aat ctc cgc aag aaa 912Cys Pro Gly Asg Asp Arg Thg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys290 295 300ggg gag cct cac cac gag ctg ccc cca ggg agc act aag cga gca ctg 960Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu305 310 315 320ccc aac aac acc agc tcc tct ccc cag cca aag aag aaa cca ctg gat 1008Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp325 330 335gga gaa tat ttc acc ctt cag atc cgt ggg cgt gag cgc ttc gag atg 1056Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met340 345 350ttc cga gag ctg aat gag gcc ttg gaa ctc aag gat gcc cag gct ggg 1104Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly355 360 365aag gag cca ggg ggg agc agg gct cac tcc agc cac ctg aag tcc aaa 1152Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys370 375 380aag ggt cag tct acc tcc cgc cat aaa aaa ctc atg ttc aag aca gaa 1200Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu385 390 395 400ggg cct gac tca gac tga 1218Gly Pro Asp Ser Asp ---40全文摘要
本發(fā)明涉及一種P53融合蛋白。本發(fā)明將人wtP53基因cDNA片段和蛋白傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)融合，插入到大腸桿菌原核表達(dá)載體PGEX－3X中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒PGEX－3X－P53，利用IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生wtP53融合蛋白；分子量約為53kbp，經(jīng)DNA序列測定，它由1218個(gè)核苷酸組成；經(jīng)MTT法及TUMEL法體外實(shí)驗(yàn)，表明wtP53融合蛋白可明顯抑制肺癌細(xì)胞H1299和肝癌細(xì)胞HePG2的增殖，促進(jìn)其調(diào)亡，本發(fā)明為應(yīng)用wtP53融合蛋白治療腫瘤提供了可靠的途徑。
文檔編號C12N15/62GK1760208SQ20041004684
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月15日
發(fā)明者蘇先獅, 龔國忠 申請人:蘇先獅