專利名稱：一種培養(yǎng)新月菱形藻的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藻類的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基，特別是涉及新月菱形藻的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
新月菱形藻(Nitzschia closterium)屬于硅藻門羽紋藻綱，是海洋生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)力的常見種類。新月菱形藻富含多種不飽和脂肪酸，特別是二十碳五烯酸(EPA)，成為很多珍貴水產(chǎn)動物的可口餌料，也是海洋生物制藥的原料。
天然狀態(tài)下新月菱形藻與多種其他微藻混雜生長在一起，種群數(shù)量極低，天然海水中的新月菱形藻密度很低，無法滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋生物制藥的需要。新月菱形藻的規(guī)模養(yǎng)殖、優(yōu)良藻種的選育已成為海洋微藻生物技術(shù)的重大課題之一。新月菱形藻人工培養(yǎng)目前多采用異養(yǎng)培養(yǎng)并結(jié)合流加技術(shù)，但該方法需要無菌環(huán)境，培養(yǎng)條件苛刻；而且所用培養(yǎng)基都適合于綠藻如小球藻、鹽藻等的生長，這些單細(xì)胞綠藻在培養(yǎng)過程中生長速度快，大量消耗培養(yǎng)基養(yǎng)分，同時還分泌胞外產(chǎn)物抑制新月菱形藻的生長，容易導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能使新月菱形藻快速生長的培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的新月菱形藻培養(yǎng)基命名為ZBNC，其配方為硝酸鈉，180-220mg；磷酸二氫鉀，18-22mg；硅酸鈉，90-110mg；碳酸氫鈉，400-500mg；檸檬酸鐵，0.45-0.55mg；維生素B12，0.35-0.55μg；維生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二鈉，1.8-2.2mg；脲素，3.5-4.5mg，海水定容至1000m1。
培養(yǎng)基配方的優(yōu)選方案為硝酸鈉，200mg；磷酸二氫鉀，20mg；硅酸鈉，100mg；碳酸氫鈉，450mg；檸檬酸鐵，0.5mg；維生素B12，0.4μg；維生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二鈉，2mg；脲素，4mg，海水定容至1000ml。
為了防止在培養(yǎng)過程中新月菱形藻受到綠藻等雜藻的污染，在培養(yǎng)基中還加有800-1000mg/L碘化鉀。
海水在配置培養(yǎng)基前按如下步驟處理1)用鹽酸調(diào)節(jié)天然海水pH為2-4，靜置12-24h；2)用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0-8.0。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種應(yīng)用本發(fā)明所提供的ZBNC培養(yǎng)基培養(yǎng)新月菱形藻的方法。
應(yīng)用本發(fā)明所提供的ZBNC培養(yǎng)基培養(yǎng)新月菱形藻，包括如下步驟1)用海水配置培養(yǎng)基；2)新月菱形藻藻種密度為3×105細(xì)胞/毫升，按與培養(yǎng)基體積比為1∶5-9的比例將新月菱形藻接種到培養(yǎng)基中，在19-25℃，光照強(qiáng)度3000-6000Lux，光照時間8-12h/天條件下通氣培養(yǎng)。
培養(yǎng)過程的通氣量為0.5m3/min；培養(yǎng)6-10天即可達(dá)到培養(yǎng)終點(diǎn)。優(yōu)選培養(yǎng)條件為溫度為25℃；光照強(qiáng)度為5000Lux；光照時間為10h/天。
人工培養(yǎng)新月菱形藻主要涉及兩方面的關(guān)鍵技術(shù)即培養(yǎng)基的組成和綠藻污染的防治。本發(fā)明所提供的ZBNC培養(yǎng)基能使新月菱形藻細(xì)胞快速利用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，達(dá)到細(xì)胞快速分裂，可利于新月菱形藻生物量的積累，比傳統(tǒng)培養(yǎng)基高出1.2-1.4倍；在ZBNC培養(yǎng)基中加入碘化鉀，能有效達(dá)到防治綠藻污染的目的，可以采用開放式的培養(yǎng)方式在短期內(nèi)獲得大量新月菱形藻及其目標(biāo)產(chǎn)物，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋生物制藥有著十分重要的意義。


圖1為新月菱形藻的生長曲線圖2為不同培養(yǎng)基的新月菱形藻胞外多糖含量3為新月菱形藻在ZBNC培養(yǎng)基的生長曲線圖4為新月菱形藻在不同濃度碘化鉀ZBNC培養(yǎng)基中的生長曲線具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、新月菱形藻在ZBNC培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)1、ZBNC培養(yǎng)基的配制1)取1L天然靜置海水，加入1N鹽酸調(diào)節(jié)海水pH為3，靜置12h，除去沉淀物；然后加入1N NaOH調(diào)節(jié)至pH為7.5左右，靜置除去沉淀物。
2)定量稱取ZBNC配方中各種營養(yǎng)成分硝酸鈉(NaNO3)，200mg；磷酸二氫鉀(KH2PO4)，20mg；硅酸鈉(Na2SiO3)，100mg；碳酸氫鈉(NaHCO3)，450mg；檸檬酸鐵(FeC6H5O7·5H2O)，0.5mg；維生素B12，0.4μg；維生素B1，400μg；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)，2mg；脲素(NH2)2CO，4mg。
3)將上述物質(zhì)溶解在步驟1)所得海水中，并定容至1升，然后加入1000mg碘化鉀。
2、新月菱形藻在ZBNC培養(yǎng)基中的培養(yǎng)新月菱形藻藻種密度為3×105細(xì)胞/毫升，按新月菱形藻與ZBNC培養(yǎng)基體積比為1∶5的比例接種新月菱形藻到培養(yǎng)罐中，在溫度為25℃、光照時間為10h/天、光強(qiáng)5000Lux條件下，以0.5m3/min通氣量通氣培養(yǎng)。
以培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基II(培養(yǎng)基I、II為新月菱形藻常規(guī)培養(yǎng)基，配方見《海洋餌料生物培養(yǎng)》，湛江水產(chǎn)?？茖W(xué)校主編，農(nóng)業(yè)出版社，1980年出版100-101)作為對照，采用與上相同的培養(yǎng)條件。
新月菱形藻的生長曲線如圖1所示，圖中A為培養(yǎng)基I；B為培養(yǎng)基II；C為ZBNC培養(yǎng)基。從圖中可以看出，新月菱形藻在ZBNC培養(yǎng)基中生長周期為8-10天，隨初始培養(yǎng)的接種密度和比例不同而有差異。通常情況下當(dāng)藻種密度為3×105cells/ml、接種比例為1∶5時，培養(yǎng)第2天即進(jìn)入指數(shù)生長期，第5天藻細(xì)胞密度達(dá)最大值；接著是3-5天的穩(wěn)定期，此時藻細(xì)胞分裂、生長變慢，密度變化不大；接著進(jìn)入衰退期，藻體開始下沉，培養(yǎng)液變澄清并最終在底部形成藻泥，生長結(jié)束。而且，與在新月菱形藻常規(guī)培養(yǎng)基I、II相比，新月菱形藻在ZBNC培養(yǎng)基中提前4-8天進(jìn)入對數(shù)期，生物量分別高出1.2、1.4倍。
實(shí)施例2、用ZBNC培養(yǎng)基培養(yǎng)的新月菱形藻胞外多糖含量分析按照如下配方配制ZBNC培養(yǎng)基硝酸鈉，180mg；磷酸二氫鉀，22mg；硅酸鈉，110mg；碳酸氫鈉，500mg；檸檬酸鐵，0.55mg；維生素B12，0.35μg；維生素B1，450μg；乙二胺四乙酸二鈉，1.8mg；脲素，3.5mg，海水定容至1L。碘化鉀含量為800mg/L。
以ZBNC為培養(yǎng)基，在溫度為25℃、光照時間為8h/天、接種量為1∶9、光強(qiáng)5000Lux條件下通氣培養(yǎng)新月菱形藻8天，其他操作與實(shí)施例1相同。
按常規(guī)方法測定培養(yǎng)基中胞外多糖含量，結(jié)果如圖2所示，圖中1為培養(yǎng)基ZBNC；2為培養(yǎng)基I；3為培養(yǎng)基II。結(jié)果表明，與其他培養(yǎng)基相比，新月菱形藻在ZBNC培養(yǎng)基中胞外多糖含量有顯著增加。
實(shí)施例3、用ZBNC培養(yǎng)基培養(yǎng)的新月菱形藻藻體脂肪酸的組成分析按照如下配方配制ZBNC培養(yǎng)基硝酸鈉，220mg；磷酸二氫鉀，18mg；硅酸鈉，90mg；碳酸氫鈉，400mg；檸檬酸鐵，0.45mg；維生素B12，0.55μg；維生素B1，350μg；乙二胺四乙酸二鈉，2.2mg；脲素，4.5mg，海水定容至1L，碘化鉀含量為800mg/L。
以上述ZBNC為培養(yǎng)基，在溫度為25℃、光照時間為12h/天、接種量為1∶9、光強(qiáng)5000Lux條件下通氣培養(yǎng)新月菱形藻10天，其他操作與實(shí)施例1相同。
以培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II和培養(yǎng)基III(培養(yǎng)基I、II、III為新月菱形藻常規(guī)培養(yǎng)基，配方見《海洋餌料生物培養(yǎng)》，湛江水產(chǎn)?？茖W(xué)校主編，農(nóng)業(yè)出版社，1980年出版100-101)作為對照。培養(yǎng)結(jié)束后，收集藻體細(xì)胞，按常規(guī)方法測定藻體脂肪酸的組成，結(jié)果如表1所示，其中表中14:0表示十四碳酸；i-15:0表示十五碳酸；16:1(n-7)表示十六碳-9～烯酸；其余與此類似。
結(jié)果表明，新月菱形藻其藻體脂肪酸的組成以二十碳五烯酸(EPA)為主，以ZBNC為培養(yǎng)基能提高EPA含量，達(dá)到總脂肪酸的38.1％；其他脂肪酸組成與另外三種培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果基本一致。
表1.新月菱形藻在不同培養(yǎng)基中的藻體脂肪酸組成(占總脂肪酸百分比)

實(shí)施例4、含碘化鉀ZBNC培養(yǎng)基對新月菱形藻培養(yǎng)過程中綠藻污染的防治作用按實(shí)施例1的培養(yǎng)基配方配制ZBNC培養(yǎng)基，一種加入碘化鉀使其濃度為1000mg/L，另一種不加碘化鉀，按實(shí)施例1的培養(yǎng)方式接種培養(yǎng)。新月菱形藻的生長曲線如圖3所示，新月菱形藻的生長指標(biāo)如表2所示。
結(jié)果表明，新月菱形藻在不加碘化鉀的ZBNC培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，接種5天后，培養(yǎng)體系受到綠藻污染，新月菱形藻生長速度緩慢，藻體細(xì)胞密度下降；在ZBNC培養(yǎng)基中加入1000mg/L的碘化鉀時，可有效預(yù)防綠藻類的污染，對已污染的新月菱形藻培養(yǎng)物中單細(xì)胞綠藻也能有效遏制，具體表現(xiàn)為單細(xì)胞綠藻類種群數(shù)量增長停止并逐漸減少，存活的單細(xì)胞綠藻多附著在容器液面上方的器壁上。此外，碘化鉀的加入還能促進(jìn)新月菱形藻的生長，迅速形成生長優(yōu)勢，進(jìn)一步抑制單細(xì)胞綠藻等雜藻的生長。800mg/L碘化鉀的加入還可大大縮短接種后新月菱形藻細(xì)胞分裂的潛伏期，整個生長周期由8-10天縮短為6-8天，生物量增加10％-15％。
表2.新月菱形藻的生長指標(biāo)

實(shí)施例5、不同濃度碘化鉀對ZBNC培養(yǎng)新月菱形藻的影響按實(shí)施例1的培養(yǎng)基配方配制ZBNC培養(yǎng)基，然后分別加入200，400，600，800，1000，1200，1400和1600mg/L的碘化鉀，按實(shí)施例1的培養(yǎng)方式接種培養(yǎng)。
新月菱形藻在不同碘化鉀濃度的生長曲線如圖4所示，圖中B為200；C為400；D為600；E為800；F為1000；G為1200；H為1400；I為1600mg/L。結(jié)果表明，1000mg/L濃度的碘化鉀對新月菱形藻生物量積累最為顯著。
按常規(guī)方法測定藻體脂肪酸的組成，結(jié)果如表3所示，表中表示方法與實(shí)施例3相同。結(jié)果表明，碘化鉀加入ZBNC培養(yǎng)基后，新月菱形藻的多不飽和脂肪酸含量沒有顯著的變化；碘化鉀濃度為1000mg/L時，EPA含量略有增加。
表3 碘化鉀對ZBNC培養(yǎng)新月菱形藻多不飽和脂肪酸含量的影響


權(quán)利要求
1.一種新月菱形藻培養(yǎng)基，其配方為硝酸鈉，180-220mg；磷酸二氫鉀，18-22mg；硅酸鈉，90-110mg；碳酸氫鈉，400-500mg；檸檬酸鐵，0.45-0.55mg；維生素B12，0.35-0.55μg；維生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二鈉，1.8-2.2mg；脲素，3.5-4.5mg；海水定容至1000ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述硝酸鈉為200mg；所述磷酸二氫鉀為20mg；所述硅酸鈉為100mg；所述碳酸氫鈉為450mg；所述檸檬酸鐵為0.5mg；所述維生素B12為0.4μg；所述維生素B1為400μg；所述乙二胺四乙酸二鈉為2mg；所述脲素為4mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中還含有800-1000mg/L碘化鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述海水按如下步驟處理1)用鹽酸調(diào)節(jié)天然海水pH為2-4，靜置12-24h；2)用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0-8.0。
5.一種新月菱形藻的培養(yǎng)方法，包括如下步驟1)用海水配置培養(yǎng)基，配方為硝酸鈉，180-220mg；磷酸二氫鉀，18-22mg；硅酸鈉，90-110mg；碳酸氫鈉，400-500mg；檸檬酸鐵，0.45-0.55mg；維生素B12，0.35-0.55μg；維生素B1，350-450μg；乙二胺四乙酸二鈉，1.8-2.2mg；脲素，3.5-4.5mg；海水定容至1000ml；2)新月菱形藻藻種密度為3×105細(xì)胞/毫升，按與培養(yǎng)基體積比為1∶5-9的比例將新月菱形藻接種到培養(yǎng)基中，在19-25℃，光照強(qiáng)度3000-6000Lux，光照時間8-12h/天條件下通氣培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)中所述硝酸鈉為200mg；所述磷酸二氫鉀為20mg；所述硅酸鈉為100mg；所述碳酸氫鈉為450mg；所述檸檬酸鐵為0.5mg；所述維生素B12為0.4μg；所述維生素B1為400μg；所述乙二胺四乙酸二鈉為2mg；所述脲素為4mg。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟1)所述培養(yǎng)基中還含有800-1000mg/L碘化鉀。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述海水在配置培養(yǎng)基前按如下步驟處理1)用鹽酸調(diào)節(jié)天然海水pH為2-4，靜置12-24h；2)用NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0-8.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述通氣培養(yǎng)的通氣量為0.5m3/min。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟2)所述培養(yǎng)溫度為25℃；光照強(qiáng)度為5000Lux；光照時間為10h/天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)新月菱形藻的方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，其配方為硝酸鈉，180－220mg；磷酸二氫鉀，18－22mg；硅酸鈉，90－110mg；碳酸氫鈉，400－500mg；檸檬酸鐵，0.45－0.55mg；維生素B
文檔編號C12N1/12GK1710061SQ20041004788
公開日2005年12月21日 申請日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日
發(fā)明者鄭維發(fā), 鮑康德 申請人:江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室