專利名稱：利用小單孢菌將密實菌素羥基化為普伐他汀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備普伐他汀的新微生物方法。更具體地是，本發(fā)明涉及一種利用微生物由通式(II)的化合物制備式(I)的普伐他汀的微生物方法 其中R代表一種堿金屬或銨離子，其中所述微生物是一種屬于小單孢菌屬(Micromonospora)的原核生物，其能夠在6β-位置上羥基化通式(II)的化合物。
背景技術(shù)：
高膽固醇血癥被認為是動脈粥樣硬化疾病，尤其是冠心病的一種主要危險因素。在過去的二十年中，已經(jīng)對作為膽固醇生物合成過程中的主要限速酶3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶EC.1.1.1.34)進行了廣泛的研究。通過不同真菌菌種的選擇菌株生物合成的美維諾林(Mevinolin)及其相關(guān)化合物被發(fā)現(xiàn)是該酶的競爭性抑制劑[Endo，A等，抗生素雜志(J.Antibiotics)29，1346-1348(1976)；Endo，A等，F(xiàn)EBS Lett.72，323-326(1976)；Kuo，C.H.等，有機化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)48，1991-1998(1983)]。
普伐他汀也是HMG-CoA還原酶抑制劑家族中的一員。首先，在對密實菌素的代謝進行研究的過程中[Arai，M.等，Sankyo KenkyushoNempo，40，1-38(1988)]，發(fā)現(xiàn)普伐他汀是狗體內(nèi)一種密實菌素的次要尿代謝物(Tanaka，M.等，未公開)。
作為密實菌素的羥基化產(chǎn)物的普伐他汀的主要特征是它的組織選擇性。該藥物強烈地抑制甾醇在肝內(nèi)和腸內(nèi)的合成，但在其它器官，抑制作用較弱。有利的是普伐他汀的毒性低于其它HMG-CoA還原酶抑制劑的毒性。
據(jù)報道通過屬于多種不同真菌屬的種的幾種菌株，以及通過屬于諾卡氏菌屬(Nocardia)，馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的放線菌種的菌株，尤其是玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces roseochromogenes)和嗜碳鏈霉菌(Streptomycescarbophilus)，可在不同程度上實現(xiàn)密實菌素的微生物羥基化(美國專利5179013，4448979，4346227，4537859，及日本專利58010572)。
利用真菌由密實菌素制備普伐他汀的過程中存在的問題是這些生物體通常耐受不了液體培養(yǎng)基中較高的密實菌素濃度，這大概是由于密實菌素具有抗真菌活性[Serizawa，N.等，抗生素雜志36，887-891(1983)]。在嗜碳鏈霉菌中，已表明細胞色素P450系統(tǒng)為密實菌素被羥基化為普伐他汀所必需的[Matsuoka，T.等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)184，707-713(1989)]。遺傳改進這種酶羥基化能力的困難在于該酶是一種蛋白質(zhì)復(fù)合體而不是單個蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的公開我們的研究集中在尋找一種放線菌菌株，該菌株能由酸式密實菌素的鹽產(chǎn)生普伐他汀，該菌株在生物轉(zhuǎn)化中采用的底物濃度以及轉(zhuǎn)化率比上述專利說明書中公開的那些高。
在篩選過程中，篩選包括了大約6000個放線菌菌株，大多是我們自己的分離物，但也包括來源于國際菌株保藏中心的可靠菌株，選出五個鏈霉菌菌株和五個小單孢菌菌株用于進一步的研究，因為它們被證明具有將酸式密實菌素的鈉鹽羥基化為普伐他汀的能力。我們實驗室已在種的水平上對這十個放線菌菌株中的八個菌株進行了分類學(xué)鑒定，這十個放線菌菌株是紫色鏈霉菌(Streptomyces violaceus)(根據(jù)Kmpfer等，1991)，菌株號1/43；婁徹氏鏈霉菌(Streptomyces rochei)(Berger等，1949；Waksman和Lechevalier，1953)，菌株號1/41；拒霉素鏈霉菌(Streptomyces resistomycificus)(Lindenbein等，1952)，菌株號1/44；鏈霉菌屬的種(Streptomyces sp.)，菌株號1/28；羊毛鏈霉菌(Streptomyces lanatus)(Frommer，1959)，菌株號1/16；小單孢菌屬(Micromonospora sp.)，菌株號IDR-P3；絳紅小單孢菌(Micromonospora purpurea)(Luedemann和Brodsky，1964)，菌株號IDR-P4；棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)(Luedemann和Brodsky，1964)，菌株號IDR-P5；黑孢小單孢菌(Micromonospora megalomicea)(Weinstein等，1969)，菌株號IDR-P6；薔薇小單孢菌(Micromonospora rosaria)(Horan和Brodsky，1986)，菌株號IDR-P7。
迄今為止，還沒有文獻公開有關(guān)小單孢菌具有將酸式密實菌素的鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀的能力的數(shù)據(jù)，所以我們不僅全面地研究了該特定酶促能力，而且還研究了上面列出的小單孢菌屬菌株的分類學(xué)位置。
，DR-P3，IDR-P4，IDR-P5，IDR-P6和IDR-P7在屬水平上的分類學(xué)位置所有這些菌株產(chǎn)生生長良好的菌絲體，該菌絲體由0.4-0.7μm直徑的分支菌絲組成。不存在氣生菌絲體或只存在微量的氣生菌絲體。只在孢子體上長出不動孢子。基內(nèi)菌絲體的菌絲是革蘭氏陽性的并且不耐酸。菌株IDR P3-P7是需氧的，化能有機營養(yǎng)的并對低于6.0的pH敏感。壁含有內(nèi)消旋-二氨基庚二酸。上面列出的鑒別特征-為關(guān)鍵特征-清楚地表明這些單孢放線菌菌株是小單孢菌屬的典型成員。
小單孢菌屬菌株IDR-P3的分類學(xué)描述微觀形態(tài)學(xué)特征基內(nèi)菌絲體由生長良好的、略為彎曲的、單軸分支的細絲組成。孢子體上的孢子是單個的，大約1.8μm直徑的球形體并且或多或少地均勻分布在菌絲上。孢子是無柄的(sessile)或位于短孢子體的端部。大概由于成熟孢子釋放得非?？欤栽谌鉁囵B(yǎng)基中菌絲上沒有觀察到孢子。
培養(yǎng)的宏觀形態(tài)學(xué)特性Czapek-蔗糖瓊脂中等生長，菌落微紅色并覆蓋點狀黑色孢子形成區(qū)域。
葡萄糖-天冬酰胺瓊脂生長情況被記錄為點狀和凸起的、紅棕色或黑色菌落?？蓴U散性色素微紅。
營養(yǎng)瓊脂中等生長，凸起的、紅棕色或黑色菌落。在培養(yǎng)基中產(chǎn)生紅棕色外色素(exopigment)。
酵母抽提物-麥芽提取物瓊脂(ISP Med.2)生長良好的、凸起的和褶皺的褐色菌落，覆蓋部分黑色孢子形成區(qū)域或“假氣生菌絲體”(看上去象一種有限的發(fā)白的或淺灰色的花)?？扇苄陨爻屎稚虺首丶t色。
無機鹽-淀粉瓊脂(ISP Med.4)中等生長的、紅棕色的、凸起的和褶皺的菌落?？扇苄陨販\紅色。
甘油-天冬酰胺瓊脂(ISP Med.5)痕量生長，偏白或淺桔黃色的扁平菌落，可溶色素淺玫瑰色。
碳源的利用生長良好并且很好地利用L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、D-甘露糖醇、半乳糖醇、甘油和肌醇。利用L-鼠李糖、D-棉子糖和菊粉的生長比在陰性對照培養(yǎng)基上生長得略好些。
氮源的利用利用酵母抽提物和NZ-胺生長良好，不利用或很少利用NaNO3。
其它生理生化特征水解纖維素和淀粉，對牛奶的消化性強。硝酸鹽還原反應(yīng)試驗陰性。在不含碳酸鈣(pH5.8-6.0)的馬鈴薯片上不生長。不產(chǎn)生類黑素。
從Balaton湖(匈牙利)的泥漿樣本中分離了小單孢菌屬的該菌株IDR-P3。
分類學(xué)位置為了弄清該菌株在小單孢菌屬的種中的精確分類學(xué)位置，有必要進一步進行比較系統(tǒng)學(xué)研究?；谝欢ǖ奶卣骰A(chǔ)，IDR-P3代表小單孢菌屬的一個新種似乎并不是不可能。
小單孢菌屬菌株IDR-P4、-P5、-P6和-P7的鑒別特征的描述和鑒定菌株IDR-P4在以上列出的鑒別培養(yǎng)基上，菌落通常生長良好，顏色由桔黃色到桔紅色，紅色，有時為微黃色或玫瑰色。不產(chǎn)生可溶性色素和氣生菌絲體。單體孢子數(shù)較少。它們長在孢子體的末端?；鶅?nèi)菌絲體由完全分支的菌絲組成。沒有氣生菌絲體存在。在D-蜜二糖、棉子糖、甘露糖醇、甘油、乳糖、L-鼠李糖上不生長，但是在D-阿拉伯糖、葡萄糖、D-木糖上生長良好，并且在D-半乳糖和D-果糖上生長微弱?；谶@些常規(guī)的鑒別特征，我們將該菌株鑒定為絳紅小單孢菌(Micromonospora purpurea)(Luedemann和Brodsky，1964)菌種中的一員。
菌株IDR-P5該菌株主要產(chǎn)生單體孢子體和球形深褐色到黑色的孢子(0.8-1.5μm的直徑)，直到成熟前，這些孢子牢固地附著在孢子體上。根據(jù)電子顯微鏡觀察的結(jié)果，在這些孢子的表面上，能觀察到疣狀結(jié)構(gòu)或旁枝(outgrowths)(在伯杰氏細菌分類手冊(Bergey’s Manual ofSyst.Bact.)，Vol.4，1989，2448頁中被稱作“平端刺(bluntspines)”)，疣狀結(jié)構(gòu)是棘孢小單孢菌孢子非常典型的特征。另外，該菌株的培養(yǎng)形態(tài)學(xué)和生理學(xué)鑒別特征也與棘孢小單孢菌的那些非常相似。在標(biāo)準(zhǔn)鑒別培養(yǎng)基上生長良好的菌落的顏色是黃褐色或暗紫色。孢子形成層是黑色或略帶紫色的黑色，光滑。沒有氣生菌絲體存在。不產(chǎn)生黑色素。牛奶消化型。在D-木糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖和蔗糖上生長良好，但在L-鼠李糖、棉子糖、D-半乳糖、D-果糖、D-蜜二糖和甘油上不生長。我們認為該菌株是一種典型的棘孢小單孢菌。
菌株IDR-P6在大多數(shù)鑒別培養(yǎng)基上生長由中等到薄弱。桔黃色或桔紅色的菌落由分支的長絲(大約0.6μm的直徑)和數(shù)量有限的單體、球形、深色的孢子(0.6-1.0μm的直徑)組成。不產(chǎn)生氣生菌絲體。在一些培養(yǎng)基中，形成淺紅色或玫瑰色的可溶性色素。在酪氨酸瓊脂上，不產(chǎn)生類黑素。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，該菌株利用下列碳源D-木糖和D-果糖；只少量利用D-蜜二糖、甘露糖醇和半乳糖，但利用甘油、L-鼠李糖、乳糖和棉子糖沒有觀察到生長或只觀察到偶發(fā)的生長(還參見Kawamoto，I.等農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.)，47，203-215，1983)。菌株IDR-P6表現(xiàn)出與黑孢小單孢菌種(Weinstein，1972)極大的相似性，因此我們認為該菌株是該種中的一員。
菌株IDR-P7在Bennett瓊脂、Czapek蔗糖瓊脂、葡萄糖-天冬酰胺瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、燕麥片瓊脂、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂等上生長良好至中度生長。營養(yǎng)菌絲體色素的顏色由紅褐色至紫褐色。在一些培養(yǎng)基上形成了葡萄酒紅色的可擴散色素。在菌落的表面常常產(chǎn)生黑斑點。營養(yǎng)菌絲(平均值經(jīng)0.5μm)大量分支。孢子(1.4-1.7μm的直徑)單體生長，附著在或在短孢子體上并且沿著菌絲的長度生長。生長和孢子的形成是Luedemann的稀疏網(wǎng)狀型(open web type)。下列化合物被該菌株利用作為培養(yǎng)基中的唯一的碳源D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、L-鼠李糖、蔗糖和D-木糖。不利用半乳糖醇、甘油、D-蜜二糖和D-棉子糖。我們將菌株IDR-P7鑒定為屬于典型的薔薇小單孢菌(Horan和Brodsky，1986)。
上述小單孢菌屬菌株被保藏在匈牙利，布達佩斯，國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細胞保藏中心(NCAIM)，其保藏號和保藏日期如下小單孢菌屬的種(Micromonospora sp.)IDR-P3的保藏號為NCAIM(P)B 001268，保藏日期為1998年10月13日；絳紅小單孢菌IDR-P4的保藏號為NCAIM(P)B 001271，保藏日期為1999年4月12日；棘孢小單孢菌棘孢亞種(Micromonospora echinospora ssp.echinospora)IDR-P5的保藏號為NCAIM(P)B 001272，保藏日期為1999年4月12日；黑孢小單孢菌黑色亞種(Micromonosporamegalomicea ssp.nigra)IDR-P6的保藏號為NCAIM(P)B 001273，保藏號為1999年4月12日；薔薇小單孢菌IDR-P7的保藏號為NCAIM(P)B001274，保藏日期為1999年4月12日。
基于上述內(nèi)容，本發(fā)明涉及一種通過浸沒培養(yǎng)在有氧發(fā)酵過程中能夠?qū)νㄊ?II)化合物進行6β-羥基化的菌株并分離和純化在生物轉(zhuǎn)化過程中形成的式(I)化合物，由通式(II)化合物制備式(I)的普伐他汀的新的微生物方法，
其中R代表堿金屬或銨離子，該方法包括以下步驟(a)在25-32℃下利用含有可同化的碳源和氮源以及無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)屬于小單孢菌屬的種的菌株，該菌株能夠在6β-位置上對通式(II)化合物進行羥基化，其中R如上所定義，然后(b)將需要被轉(zhuǎn)化的底物補加到生長好的培養(yǎng)物(developedculture)中，然后(c)對底物進行羥基化直至完成生物轉(zhuǎn)化，然后(d)從培養(yǎng)液中分離式(I)化合物，如果需要，對該化合物進行純化。
本發(fā)明的范圍延伸到能夠?qū)⑺崾矫軐嵕氐拟c鹽羥基化為普伐他汀的屬于小單孢菌屬菌種的野生型菌株和任何突變菌株。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，用選自小單孢菌屬種IDR-P3[NCAIM(P)B 001268]、絳紅小單孢菌IDR-P4[NCAIM(P)B001271]、棘孢小單孢菌IDR-P5[NCAIM(P)B 001272]、黑孢小單孢菌IDR-P6[NCAIM(P)B 001273]和薔薇小單孢菌IDR-P7[NCAIM(P)B001274]的小單孢菌屬菌株制備普伐他汀。
根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案，用小單孢菌屬種菌株IDR-P3[NCAIM(P)B 001268]制備普伐他汀。
可以通過原位(insitu)發(fā)酵方法來實現(xiàn)本發(fā)明，即，通過生長旺盛的小單孢培養(yǎng)物的參與來實現(xiàn)羥基化。
當(dāng)式(II)化合物被加到生長培養(yǎng)基中后，通過采用攪拌如振蕩-搖瓶培養(yǎng)或在發(fā)酵罐中通氣和攪拌來進行羥基化反應(yīng)。這種情況下，可以加入消泡劑。通過采用含有可利用碳源和氮源、無機鹽以及痕量元素的適當(dāng)培養(yǎng)基能夠使該菌株達到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)密度。
例如，葡萄糖、甘油、糊精、淀粉、鼠李糖、木糖、蔗糖和可溶性淀粉被證明是可同化的碳源，而大豆粉、玉米漿、蛋白胨、酵母抽提物、肉膏、檸檬酸銨和硫酸銨為有利的氮源?？梢詫o機鹽如碳酸鈣、磷酸鈉、磷酸鉀等加到培養(yǎng)基中。用于該選定菌株生長的優(yōu)選培養(yǎng)基是實施例中所述的那些培養(yǎng)基。
密實菌素向普伐他汀的生物轉(zhuǎn)化可以通過不同的發(fā)酵技術(shù)，例如分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)來完成。優(yōu)選地，采用一種攪拌式液體浸沒培養(yǎng)。優(yōu)選的培養(yǎng)溫度是大約25℃至37℃，最優(yōu)選地是大約25℃至32℃。
優(yōu)選的pH是大約6.0至9.0，最優(yōu)選地是大約7.0至8.5。優(yōu)選的振蕩條件是大約200rpm至400rpm，最優(yōu)選地是大約250rpm。
本發(fā)明提供了一種將密實菌素酸鈉鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀的方法。密實菌素酸鈉鹽能以任何將導(dǎo)致產(chǎn)生普伐他汀的濃度來加以利用。優(yōu)選地，密實菌素的濃度是0.1至10g/升，更優(yōu)選地是0.3至3.0g/升。
本發(fā)明旨在包括通過小單孢菌屬種的菌株將密實菌素轉(zhuǎn)化為普伐他汀的任何轉(zhuǎn)化百分率，至少是30％，最優(yōu)選地是至少約90％。
在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)液的組分通過高效液相色譜(HPLC)方法來調(diào)控。根據(jù)HPLC方法，培養(yǎng)液樣品用甲醇稀釋兩倍，離心后取上清液來進行分析。用于分析的HPLC系統(tǒng)的參數(shù)是Waters分析用HPLC設(shè)備；柱填料Waters Novapack C185μm；測量在237nm；加樣體積10μl；流速0.6-0.9ml/分鐘線性梯度；采用梯度洗脫，洗脫液溶劑A＝乙腈-0.1M NaH2PO4水溶液(25∶75)，溶劑B＝乙腈-水(用H3PO4將pH調(diào)到2)(70∶30)。
梯度洗脫參數(shù)

滯留時間普伐他汀(鈉鹽)10.6分鐘；密實菌素(酸鈉鹽)19.5分鐘；普伐他汀(內(nèi)酯形式)17.3分鐘；密實菌素(內(nèi)酯形式)23.5分鐘。
任何已知的方法都可以被用于普伐他汀的分離，例如萃取-反復(fù)萃取，陰離子交換層析，沉淀。
為了從培養(yǎng)液中回收所述產(chǎn)物，有利地是要考慮這樣一個事實，即在生物轉(zhuǎn)化過程中，普伐他汀以其酸的形式形成，因此通過其與陰離子交換樹脂柱的吸附可以從濾液中分離出普伐他汀。為了分離所述產(chǎn)物，有利地是采用強堿性陰離子交換樹脂，該樹脂是一種含有季銨活性基團的聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，例如Dowex AI 400(OH-)，Dowex 1×2(OH-)，Dowex 2×4(OH-)，Amberlite IRA900(OH-)樹脂。利用含水乙酸或含氯化鈉的丙酮-水混合物，優(yōu)選地是利用含1％氯化鈉的丙酮-水(1∶1)混合物，可以將吸附在離子交換樹脂上的產(chǎn)物從柱上洗脫下來。將含有普伐他汀的分步收集液混合并真空蒸餾掉洗脫物中的丙酮。用15％的硫酸將濃縮物的pH調(diào)節(jié)到3.5-4.0的范圍并且用乙酸乙酯提取酸化的水溶液。通過1/10和1/20體積比的5％碳酸氫鈉或弱堿水溶液(pH7.5-8.0)從乙酸乙酯提取物中可以提取普伐他汀。經(jīng)驗告訴我們，通過利用非離子吸附樹脂的柱層析從上述獲得的堿性含水提取物中可以回收到純的普伐他汀。一種有利的方法是，首先通過真空蒸餾從堿性含水提取物中除去溶解在水相中的乙酸乙酯，然后將含水提取物上樣到Diaion HP-20柱上。采用含水丙酮洗脫純化吸附在柱上的普伐他汀，其中含水丙酮中的丙酮含量逐漸增加，然后混合只含單一成分普伐他汀的色譜分步收集液并利用真空進行濃縮。用木炭對該濃縮物進行脫色并進行凍干，然后用乙醇-乙酸乙酯混合物進行結(jié)晶，以醫(yī)藥應(yīng)用可接受的質(zhì)量提供普伐他汀。
完成生物轉(zhuǎn)化后，可以從發(fā)酵液中或從分離了菌絲團后獲得的濾液中提取普伐他汀。菌絲團可以通過過濾或離心來除去，然而，特別是在工業(yè)規(guī)模上，進行全液提取是有利的。提取前，用無機酸，優(yōu)選地用稀釋的硫酸，將發(fā)酵液或發(fā)酵液的過濾液的pH調(diào)節(jié)到3.5-3.7。用含有2-4個碳原子的脂族醇的乙酸酯，優(yōu)選地用乙酸乙酯或乙酸異丁酯進行提取。用水沖洗乙酸乙酯提取物并用無水硫酸鈉進行干燥。然后由普伐他汀制備內(nèi)酯衍生物。內(nèi)酯環(huán)的閉合是在室溫下的干燥乙酸乙酯溶液中，在不斷的攪拌下通過利用催化量的三氟乙酸誘導(dǎo)內(nèi)酯的形成來完成的。通過薄層層析分析(TLC)檢測內(nèi)酯環(huán)的閉合情況。內(nèi)酯形成后，首先用5％的碳酸氫鈉水溶液和然后用水沖洗所述乙酸乙酯溶液，并用無水硫酸鈉進行干燥，然后進行真空蒸發(fā)。剩余物采用硅膠柱層析進行純化，利用其中乙酸乙酯的含量逐漸增加的乙酸乙酯-正己烷混合物作洗脫劑。通過在室溫下利用等量的氫氧化鈉在丙酮中水解普伐他汀內(nèi)酯來制備普伐他汀。當(dāng)形成普伐他汀的鈉鹽后，用丙酮沉淀普伐他汀。然后，將沉淀過濾并用丙酮和正己烷沖洗并進行真空干燥，然后用乙醇-乙酸乙酯混合物進行結(jié)晶。
已發(fā)現(xiàn)，利用Sephadex LH-20凝膠進行層析對于純化普伐他汀是有利的。通過采用該方法，能夠制備出純度超過99.5％(通過HPLC測定)的普伐他汀。
在我們的實驗中，認為存在以下發(fā)明利用仲胺從小單孢菌屬的IDR-P3菌株的培養(yǎng)液或過濾培養(yǎng)液的有機溶劑提取物中，優(yōu)選乙酸乙酯或乙酸異丁酯提取物中，能夠以結(jié)晶鹽的形式將普伐他汀沉淀出來，所述菌株能夠在6β-位置上對通式(II)的化合物進行羥基化。還發(fā)現(xiàn)，含有烷基、環(huán)烷基、芳烷基或芳香基取代基的幾種仲胺適合于所述鹽的形成。合適的非毒性仲胺選自，例如二辛胺、二環(huán)己基胺、二芐胺。有機仲胺鹽中間體(例如二芐胺鹽)的分離是通過加入相當(dāng)于提取物中的普伐他汀含量1.5倍量的二芐胺來完成的，然后通過真空蒸餾將所述提取物濃縮到其初始體積的5％，然后，以相當(dāng)0.2倍的量將另一部分二芐胺加到濃縮物中。二芐胺鹽的結(jié)晶從濃縮物中沉淀出來。將結(jié)晶粗提物過濾并進行真空干燥，并且在甲醇或丙酮溶液中采用木炭進行脫色。然后利用丙酮對脫色產(chǎn)物進行重結(jié)晶從而可以獲得色譜純的普伐他汀二芐胺鹽中間體。
通過氫氧化鈉或醇鈉(優(yōu)選地是乙醇鈉)可以將普伐他汀有機仲胺鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀。
通過仲胺鹽中間體分離普伐他汀是一種比任何已知分離方法簡單的方法。在該過程中不形成矯作物，并且可有利地解決從生物轉(zhuǎn)化的副產(chǎn)物以及從羥基化微生物生物合成的多種代謝產(chǎn)物中分離普伐他汀的問題。
本發(fā)明的方法通過下列實施例進行說明。
實施例實施例1從7-10天齡的小單孢菌屬的IDR-P3[NCAIM(P)B 001268]菌株的可溶性淀粉瓊脂(SM)斜面培養(yǎng)物表面中收集孢子并將孢子懸浮在5ml的無菌蒸餾水中。然后將該懸浮液接種到裝在500ml錐形瓶中的100ml無菌TI接種培養(yǎng)基中。
SM培養(yǎng)基的組成可溶性淀粉 10.0gNa2HPO41.15gKH2PO40.25gKCl 0.2gMgSO4×7H2O 0.2g瓊酯 15.0g溶于1000ml的蒸餾水中滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)到7.0并且在121℃下滅菌25分鐘。
TI培養(yǎng)基的組成可溶性淀粉 20.0g酵母抽提物 10.0g溶于1000ml的自來水中滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)到7.0并且在121℃下滅菌25分鐘。
生長培養(yǎng)物于32℃下在搖床(250rpm；振幅2.5cm)上振蕩培養(yǎng)3天，然后將5ml的各等分培養(yǎng)液分別接種到10個500ml的錐形瓶中，每一錐形瓶裝有100ml的經(jīng)121℃滅菌25分鐘的TT培養(yǎng)基。
TT培養(yǎng)基的組成馬鈴薯淀粉 30.0g大豆粉 30.0gCaCO35.0gCoCl2×6H2O 2.0mg棕櫚油 2.0g溶于1000ml的自來水中加熱滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)到7.0。
在32℃下培養(yǎng)72小時，然后將溶于蒸餾水中的50mg密實菌素酸鈉鹽加到每一個錐形瓶中，再培養(yǎng)96小時。通過HPLC測定密實菌素酸鈉鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀的轉(zhuǎn)化率為82％。
發(fā)酵結(jié)束后，合并所有培養(yǎng)物，按照下列步驟從所獲得的合并的發(fā)酵液中分離普伐他汀，所述發(fā)酵液中含有410mg的普伐他汀以2500rpm將所述發(fā)酵液離心20分鐘。分離上清液和菌絲團，然后將菌絲團重新懸浮在250ml的水中并且將所得到的懸浮液攪拌1小時并過濾。用15％的硫酸將混合的離心液和濾液的pH調(diào)到4.0，然后采用3×300ml的乙酸乙酯對該酸性濾液進行提取。用300ml的水洗滌合并的乙酸乙酯提取物，用無水硫酸鈉干燥該提取物并將其體積真空濃縮到100ml。然后，通過在室溫下加入催化量的三氟乙酸并同時不停地攪拌來由普伐他汀制備普伐他汀內(nèi)酯。普伐他汀內(nèi)酯的形成由TLC方法調(diào)控吸附劑Kieselgel 60 F254DC(Merck)鋁箔；展開劑丙酮-苯-乙酸(50∶50∶1.5)混合物；檢測磷鉬酸試劑。普伐他汀內(nèi)酯的Rf值為0.7。所述內(nèi)酯的形成后，用2×20ml的5％碳酸氫鈉水溶液洗滌乙酸乙酯然后再用20ml的水洗滌，用無水硫酸鈉干燥并進行真空蒸發(fā)。獲得0.5g的脫水殘留物，利用填充了10g的Kieselgel60吸附劑的柱(柱的直徑1.2cm，吸附床的高度17cm)對所述殘留物進行色譜分離。用乙酸乙酯-正己烷混合物進行洗脫，其中該混合物中的乙酸乙酯的含量逐漸增加。用60％的乙酸乙酯-40％的正己烷混合物從柱上洗脫普伐他汀內(nèi)酯。將含有普伐他汀內(nèi)酯的分步收集液合并起來并進行真空脫水。獲得的含有230mg的普伐他汀內(nèi)酯的殘留物被溶解在5ml的丙酮中，然后在攪拌下加入1M乙醇溶液中的110摩爾％的氫氧化鈉。在室溫下對溶液的攪拌持續(xù)半小時。接著，將所述溶液體積濃縮到2ml并向該濃縮物中加入4ml的丙酮。該混合物在+5℃下過夜。沉淀進行過濾，用2ml的丙酮沖洗，然后再用2ml的正己烷沖洗并在室溫下真空干燥。將得到的粗制普伐他汀溶解在乙醇中，通過木炭脫色，然后用乙醇-乙酸乙酯的混合物進行結(jié)晶。以這種方法獲得了170mg的普伐他汀。
熔點170-173℃(裂解(decomp.))。
D2＝+156°(c＝0，5，水中)。
紫外吸收光譜(20μg/ml，在甲醇中)λmax＝231，237，245nm(logε＝4.263；4.311；4.136)。
紅外吸收光譜(KBr)νOH3415，νCH2965，νC＝O 1730，νCOO-1575cm-1。
1H-NMR光譜(D2O，δ，ppm)0.86，d，3H(2-CH3)；5.92，dd，J＝10.0和5.4Hz，1H(3-H)；5.99，d，J＝10.0Hz，1H(4-H)；5.52，br，1H(5-H)；4.24，m，1H(6-H)；5.34，br，1H(8-H)；4.06，m，1H(β-H)，3.65，m，1H(δ-H)；1.05，d，3H(2’-CH3)；0.82，t，3H(4’-H3)。
13C-NMR光譜(D2O，δ，ppm)15.3，q(2-CH3)；139.5，d(C-3)，129.5，d(C-4)，138.1，s(C-4a)，127.7，d(C-5)；66.6，d(C-6)；70.1，d(C-8)；182.6，s(COO-)；72.6，d(C-β)；73.0，d(C-δ)；182.0，s(C-1’)；18.8，q(2’-CH3)；13.7，q(C-4’)。
正FAB質(zhì)譜(特征離子)[M+Na]+469；[M+H]+447。
負FAB質(zhì)譜(特征離子)[M-H]-445；[M-Na]-423，mlz101[2-甲基-丁酸-H]-。
實施例2在10個含有100ml的無菌MT1生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中接種上實施例1中所制備的接種培養(yǎng)物，然后在28℃培養(yǎng)96小時并且將溶于蒸餾水中的50mg的密實菌素酸鈉鹽加到每個錐形瓶中，然后進行72小時的羥基化反應(yīng)，將溶于蒸餾水中的50-50mg的另一部分底物加到培養(yǎng)物中后繼續(xù)發(fā)酵72小時。
MT1生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成馬鈴薯淀粉 10.0g葡萄糖 20.0g大豆粉 10.0g酵母抽提物 10.0gCaCO35.0g向日葵油 2.0g溶于1000ml的自來水中滅菌前將生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的pH調(diào)到7.0?；旌衔镌?21℃下滅菌25分鐘。
生物轉(zhuǎn)化期結(jié)束后，合并所有培養(yǎng)物，按照下列方法從合并的發(fā)酵液中分離普伐他汀將通過HPLC測定的含有750mg普伐他汀的合并發(fā)酵液以2500rpm離心20分鐘。向分離的菌絲團中加入250ml水后攪拌1小時，然后過濾。將離心液和濾液混合后用15％的硫酸將所得溶液的pH調(diào)到3.5-4.0，然后采用3×300ml的乙酸乙酯對該溶液進行提取。將相對普伐他汀含量的150摩爾％的二芐胺加到乙酸乙酯提取物中。該乙酸乙酯提取物被蒸發(fā)濃縮到大約30ml的體積并且將該懸浮液保持在0-5℃下過夜。密實菌素酸二芐胺鹽沉淀被過濾出來并在濾器上用冷卻的乙酸乙酯和正己烷沖洗，最后進行真空干燥。將1.1g的粗制密實菌素酸二芐胺鹽溶解在33ml的62-66℃的丙酮中，并用0.1g的木炭將該溶液脫色半小時。過濾除去溶液中的木炭。將從脫色液中沉淀出來的結(jié)晶在上述溫度下再度溶解，然后該溶液被保持在+5℃下過夜。過濾出沉淀，并用冷卻的丙酮和正己烷進行沖洗，然后真空干燥。得到的密實菌素酸二芐胺鹽(0.7g)被懸浮在10ml的乙醇中，然后通過補加1M的水溶液向該溶液中加入110摩爾％的氫氧化鈉。在室溫下將該堿性溶液持續(xù)攪拌半小時。鈉鹽形成后加入30ml的水并中和該溶液的pH值，然后真空蒸發(fā)掉乙醇。利用填充了50ml的Diaion HP 20樹脂的色譜柱(柱直徑1.5cm，樹脂床高度28cm)對含水濃縮物進行色譜分離。用丙酮-去離子水混合物洗脫柱子，其中混合物中的丙酮濃度以5％的梯度增加。用含有15％丙酮的丙酮-去離子水混合物能從柱中洗脫出普伐他汀。通過實施例1中給出的TLC方法分析分步收集液。普伐他汀的Rf值為0.5。將含有普伐他汀的分步收集液合并起來并真空蒸發(fā)掉丙酮成分。通過凍干含水的殘留物，獲得了390mg的色普純普伐他汀。
實施例3將實驗室用發(fā)酵罐中的4.5升的TT/2培養(yǎng)基在121℃下滅菌45分鐘，然后接種上500ml的如實施例1中制備的接種振蕩培養(yǎng)物，然后在32℃下、以250l/h的流速通入無菌空氣并通過扁平葉片攪拌器以300rpm進行攪拌。培養(yǎng)進行72小時并將2.5g的密實菌素酸鈉鹽加到培養(yǎng)物中。生物轉(zhuǎn)化48小時后發(fā)酵液中的密實菌素底物被全部消耗，然后再向培養(yǎng)物中另外加入2.5g的密實菌素酸鈉鹽。第二次加入的密實菌素在24小時內(nèi)被消耗。在生物轉(zhuǎn)化過程中，密實菌素酸鈉鹽轉(zhuǎn)化為普伐他汀的轉(zhuǎn)化率大約為90％。
TT/2生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成葡萄糖 75.0g可溶性淀粉 50.0g
大豆粉 50.0g酵母抽提物 50.0g蛋白胨 5.0gNaNO320.0gCaCO325.0g溶于4500ml的自來水中實施例4將實驗室用發(fā)酵罐中的4.5升的TT/1培養(yǎng)基在121℃下滅菌45分鐘，然后接種上500ml的如實施例1中制備的接種振蕩培養(yǎng)物，然后在28℃下、以200l/h的流速通入無菌空氣并通過扁平葉片攪拌器以400rpm進行攪拌。
TT/1生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成葡萄糖 125.0g馬鈴薯淀粉 25.0g大豆粉 50.0g酵母抽提物(Gistex) 50.0g蛋白胨 50.0gCoCl2×6H2O10.0mg向日葵油 10.0g溶于4500ml的自來水中滅菌前將生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的pH調(diào)到7.0。
培養(yǎng)在28℃下進行96小時。這時將溶解在過濾除菌水中的2.5g密實菌素酸鈉鹽加到培養(yǎng)物中。發(fā)酵的第5天，發(fā)酵液中的密實菌素酸鈉鹽被全部消耗。然后每天以2.5g/天的量重復(fù)補加底物，持續(xù)3天。密實菌素酸鈉鹽在4天內(nèi)被逐漸消耗而完全轉(zhuǎn)化為普伐他汀。根據(jù)HPLC測定的結(jié)果，發(fā)酵結(jié)束后由10g的密實菌素底物產(chǎn)生了9g的普伐他汀。
生物轉(zhuǎn)化結(jié)束后，按照下面的方法分離形成的濃度為1800μg/ml的普伐他汀
以2500rpm將5升的培養(yǎng)液離心20分鐘。然后將2升的水加到分離的菌絲團中并將懸浮液攪拌1小時并過濾。合并這兩種過濾液并以500ml/小時的流速通過填充了300g(540ml)的Dowex AI 400(OH-)樹脂的色譜柱(柱直徑4cm，樹脂床高度43cm)，然后用1升的去離子水沖洗樹脂床。其后用含有10g的氯化鈉的1升丙酮-水(1∶1)混合物洗脫柱子，以50ml的量分步收集洗脫液。采用實施例1中的TLC方法分析分步收集洗脫液。合并含有所述產(chǎn)物的分步收集洗脫液并真空蒸餾掉丙酮。用15％的硫酸將得到的濃縮物的pH調(diào)到3.5-4.0，然后通過3×250ml的乙酸乙酯進行提取。將40ml的去離子水加到合并的乙酸乙酯提取物中，然后用1M的氫氧化鈉將pH調(diào)到7.5-8.0。攪拌15分鐘后，水相和乙酸乙酯相被分開，然后按照上述方法用2×40ml的去離子水提取乙酸乙酯溶液。合并后的堿性水溶液被濃縮到50ml的體積并利用填充了600ml的Diaion HP 20(Mitsubishi Co.，日本)非離子吸附樹脂的色譜柱(柱直徑3.8cm，樹脂床高度53cm)對該濃縮物進行色譜分離。用600ml去離子水沖洗該色譜柱，然后用丙酮-去離子水混合物洗脫柱子，其中丙酮的濃度以5％的梯度增加，以50ml的量分步收集洗脫液。通過實施例1中給出的TLC方法分析洗脫物。用含15％丙酮的丙酮-去離子水混合物將普伐他汀從柱子中洗脫出來。合并含有作為單一成分的普伐他汀的分步收集液并且將該溶液真空濃縮到150ml的體積。接下來，將0.6g的木炭加至該濃縮的水溶液中并在室溫下將普伐他汀脫色1小時。然后過濾除去木炭并對濾液進行凍干。得到的6.5g的凍干普伐他汀用乙醇和乙酸乙酯的混合物結(jié)晶兩次。過濾出沉淀并用20ml的乙酸乙酯和20ml的正己烷沖洗，并在室溫下真空干燥。由此獲得了4.6g的色譜純普伐他汀。
實施例5用5ml的無菌蒸餾水按照實施例1所述由10天齡的棘孢小單孢棘孢亞種IDR-P5[NCAIM(P)B 001272]菌株的可溶性淀粉瓊脂斜面培養(yǎng)物的表面制備孢子懸浮液，所述菌株能夠?qū)γ軐嵕厮徕c鹽進行6β-羥基化，然后將獲得的孢子懸浮液接種到500ml錐形瓶中的100ml無菌TI接種培養(yǎng)基中。TI培養(yǎng)基的組成如實施例1所述。接種后的培養(yǎng)基在28℃下利用搖床振蕩(250rpm，2.5cm振幅)培養(yǎng)3天，然后將長好的培養(yǎng)物以5ml的等分分別轉(zhuǎn)移到500ml錐形瓶中的100-100ml無菌TT/1生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基已在121℃下滅菌25分鐘。TT1培養(yǎng)基的組成如實施例4所述。錐形瓶在25℃下利用搖床振蕩(250rpm，2.5cm振幅)培養(yǎng)3天，然后以無菌過濾水溶液的形式將10-10mg的密實菌素底物(密實菌素酸鈉鹽)加到所述培養(yǎng)物中，然后繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)168小時。
生物轉(zhuǎn)化結(jié)束后，利用HPLC方法測定發(fā)酵液中的普伐他汀的含量。這時普伐他汀的平均濃度為40μg/ml。
實施例6采用黑孢小單孢菌黑色亞種的IDR-P6[NCAIM(P)B 001273]菌株按照實施例5所述的方法進行發(fā)酵、底物的添加以及生物轉(zhuǎn)化。利用HPLC方法測定發(fā)酵液中的普伐他汀的含量。生物轉(zhuǎn)化結(jié)束后，發(fā)酵液中的普伐他汀含量為50μg/ml。
實施例7將按照實施例1的方法制備的絳紅小單孢菌IDR-P4[NCAIM(P)B001271]菌株接種培養(yǎng)物以5ml的等分量分別接種到500ml錐形瓶中經(jīng)121℃下滅菌25分鐘的100-100ml無菌TT/14培養(yǎng)基中。
TT/14培養(yǎng)基的組成馬鈴薯淀粉 5.0g葡萄糖 25.0g酵母抽提物(GISTEX) 15.0g蛋白胨 15.0gCaCO31.0g溶于1000ml的自來水中滅菌前將生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的pH調(diào)到7.0。
錐形瓶利用搖床振蕩(250rpm，2.5cm振幅)培養(yǎng)3天。按照實施例5所述的方法進行底物的添加、生物轉(zhuǎn)化以及普伐他汀含量的測定。生物轉(zhuǎn)化結(jié)束后，發(fā)酵液中的普伐他汀含量為40μg/ml。
實施例8按照實施例1的方法利用薔薇小單孢菌的IDR-P7[NCAIM(P)B001274]菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)、底物的添加和生物轉(zhuǎn)化。生物轉(zhuǎn)化結(jié)束后，利用HPLC方法測得發(fā)酵液中的普伐他汀含量為350μg/ml。
權(quán)利要求
1.一種通過浸沒培養(yǎng)在有氧條件下能夠?qū)κ?II)化合物進行6β-羥基化的小單孢菌屬菌株并分離和純化在生物轉(zhuǎn)化過程中形成的式(I)化合物，由通式(II)的化合物制備式(I)化合物的微生物方法， 其中R代表堿金屬或銨離子，該方法包括以下步驟(a)在25-32℃下在一種含有可利用的碳源和氮源以及無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)小單孢菌屬菌株，該菌株能夠?qū)κ?II)化合物進行6β-羥基化，其中R如上所定義，然后(b)將需要被轉(zhuǎn)化的底物添加到生長中的培養(yǎng)物中，然后(c)對底物進行羥基化直至完成生物轉(zhuǎn)化，然后(d)從培養(yǎng)液中分離式(I)化合物，如果需要，純化該化合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用保藏在匈牙利布達佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細胞保藏中心的、保藏號為NCAIM(P)B001268的小單孢菌屬菌株IDR-P3或其能夠?qū)νㄊ?II)化合物進行6β-羥基化的突變株。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用保藏在匈牙利布達佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細胞保藏中心的、保藏號為NCAIM(P)B001271的絳紅小單孢菌菌株IDR-P4或其能夠?qū)νㄊ?II)化合物進行6β-羥基化的突變株。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用保藏在匈牙利布達佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細胞保藏中心的、保藏號為NCAIM(P)B001272的棘孢小單孢菌棘孢亞種菌株IDR-P5或其能夠?qū)νㄊ?II)化合物進行6β-羥基化的突變株。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用保藏在匈牙利布達佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細胞保藏中心的、保藏號為NCAIM(P)B001273的黑孢小單孢菌黑色亞種菌株IDR-P6或其能夠?qū)νㄊ?II)化合物進行6β-羥基化的突變株。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用保藏在匈牙利布達佩斯國立農(nóng)業(yè)和工業(yè)微生物和細胞保藏中心的、保藏號為NCAIM(P)B001274的薔薇小單孢菌菌株IDR-P7或其能夠?qū)νㄊ?II)化合物進行6β-羥基化的突變株。
7.一種如權(quán)利要求1至6之任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中通過如下方式從培養(yǎng)液中分離在發(fā)酵過程中形成的式(I)化合物利用陰離子交換樹脂進行吸附或利用與水不相溶的有機溶劑進行提取，然后制備作為中間體的式(I)化合物的內(nèi)酯衍生物或其仲胺鹽，或采用非離子吸附樹脂的色譜分離方法純化從所述發(fā)酵液的有機溶劑提取物中獲得的堿性含水提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過浸沒培養(yǎng)在有氧條件下能夠?qū)κ?II)化合物進行6β－羥基化的菌株并分離和純化在生物轉(zhuǎn)化過程中形成的式(I)化合物，由通式(II)的化合物制備式(I)化合物的新微生物方法，其中R代表堿金屬或銨離子。所述方法包括以下步驟在25－32℃下在一種含有可利用的碳源和氮源以及無機鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)小單孢菌屬菌株，該菌株能夠?qū)νㄊ?II)化合物進行6β－羥基化，其中R如上所定義，然后將需要被轉(zhuǎn)化的底物添加到生長的培養(yǎng)物中，然后對底物進行羥基化直至完成生物轉(zhuǎn)化，然后從培養(yǎng)液中分離式(I)化合物，如果需要，純化該化合物。
文檔編號C12R1/29GK1590555SQ20041004935
公開日2005年3月9日 申請日期2000年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月12日
發(fā)明者A·杰克爾, G·阿姆布魯斯, E·伊爾克伊, I·霍瓦斯, A·孔亞, I·M·斯扎博, Z·納吉, G·霍瓦斯, J·默澤斯, I·巴塔, G·索莫格伊, J·薩拉特, S·伯羅斯 申請人:伊瓦克斯藥品研究院有限公司