專(zhuān)利名稱(chēng)：一種酶法合成海藻糖的工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海藻糖的制備方法，尤其涉及一種應(yīng)用基因工程、酶工程和發(fā)酵工程合成海藻糖的工藝方法。
背景技術(shù)：
海藻糖(trehalose)是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖，它由兩個(gè)吡喃環(huán)葡萄糖分子與1，1糖苷鍵連結(jié)而成(杉本利行，1994)。海藻糖可以幾種固體形式存在，最常見(jiàn)的是二水化合物，熔點(diǎn)達(dá)97℃，將其加熱至130℃，使其失去結(jié)晶水而成為無(wú)水結(jié)晶體時(shí)，熔點(diǎn)可達(dá)214～216℃。其水溶液性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)色無(wú)嗅，口感略帶甜味，不會(huì)焦糖化。海藻糖的理化性質(zhì)十分穩(wěn)定，不能使斐林試劑還原，也不能被α-糖苷酶水解，但在強(qiáng)酸條件下能被水解為兩個(gè)葡萄糖分子。
現(xiàn)有的生產(chǎn)海藻糖的工藝方法有以下幾種一、從酵母中抽提海藻糖這是最早生產(chǎn)海藻糖的方法，主要是從面包酵母、釀酒酵母中抽提。目前，從酵母中提取海藻糖的工藝已相當(dāng)成熟，但由于制造成本高，其價(jià)格仍然偏高。
二、微生物發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖通過(guò)培養(yǎng)能產(chǎn)生海藻糖的微生物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖也取得了一定的進(jìn)展。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道真菌有20幾個(gè)屬33個(gè)種，均是開(kāi)發(fā)海藻糖的菌種資源。特別值得注意的是某些蘑菇菌，所含海藻糖占其干重的10％～15％。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已把目光放在灰樹(shù)花的開(kāi)發(fā)，其價(jià)值不僅在于灰樹(shù)花含有多糖、雙糖、多種維生素、微量元素及其他有效活性成分，而且海藻糖的含量比香菇、金針菇都要高。采用誘變育種、細(xì)胞融合或基因工程方法選育產(chǎn)海藻糖高的菌株，然后采用高濃度的培養(yǎng)基及高滲發(fā)酵，并在發(fā)酵結(jié)束前讓酵母菌“饑餓”2～3h，可以得到含海藻糖較高的培養(yǎng)物。(羅明典等，1996)三、利用基因工程方法生產(chǎn)海藻糖一是利用海藻糖基因構(gòu)建具有抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物，二是利用工程微生物和酶工程改進(jìn)海藻糖生產(chǎn)。荷蘭的Mogen與Vanderhave公司1992年開(kāi)始設(shè)法提高甜菜和馬鐘薯等農(nóng)作物中海藻糖的含量，現(xiàn)已獲得生產(chǎn)專(zhuān)利(楊琳等，1999)。美國(guó)Calgene公司研究人員將葡萄糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的基因通過(guò)一種細(xì)菌導(dǎo)入植物，構(gòu)建的重組植物具有生產(chǎn)海藻糖能力，并認(rèn)為葡萄糖轉(zhuǎn)化為海藻糖時(shí)完全受有關(guān)酶基因的控制(羅明典等，1996)。
目前生產(chǎn)海藻糖的工藝方法成本都較為昂貴，找到廉價(jià)生產(chǎn)海藻糖的方法將獲得很重大的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種廉價(jià)的，應(yīng)用基因工程、酶工程和發(fā)酵工程酶法合成海藻糖的工藝方法，以獲得重大的經(jīng)濟(jì)效益。
海藻糖是一種有著廣闊應(yīng)用前景的雙糖，目前生產(chǎn)海藻糖的方法成本都較為昂貴，找到廉價(jià)生產(chǎn)海藻糖的方法將獲得很重大的經(jīng)濟(jì)效益。有文獻(xiàn)報(bào)道，在擔(dān)子苗灰樹(shù)花中，海藻糖的干重最高達(dá)到15～17％左右，這說(shuō)明灰樹(shù)花合成海藻糖的能力很強(qiáng)。本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)是擬通過(guò)灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因的克隆和表達(dá)，將基因工程和酶工程結(jié)合，在酶法生產(chǎn)海藻糖方面形成新的技術(shù)和工藝。
灰樹(shù)花海藻糖的合成途徑如下
由上述合成途徑可見(jiàn)，海藻糖合成酶需要D-葡萄糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸作為反應(yīng)底物。而在大腸桿菌中，蔗糖磷酸化酶能將蔗糖分解為果糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸(KOKI SAITO et al，1998)。
本發(fā)明的思路就是將灰樹(shù)花海藻糖合成酶和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶的基因克隆，通過(guò)基因工程和發(fā)酵工程的方法獲得這兩種酶。利用這兩種酶，可以以蔗糖和葡萄糖這兩種廉價(jià)的原料來(lái)工業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)海藻糖。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供的一種酶法合成海藻糖的工藝方法，包括下列步驟a.分別克隆灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因；b.分別構(gòu)建灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體；c.在酵母中分別轉(zhuǎn)化、表達(dá)灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因以及大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體，構(gòu)成重組蛋白，然后對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化；d.在以蔗糖和葡萄糖為主要成分的反應(yīng)液中，分別加入純化的上述重組蛋白合成海藻糖。
本發(fā)明可采取如下進(jìn)一步措施在所述步驟a中克隆灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因的方法是利用引物15′CCGAA TTC ATG GCT CCT CCC CAC CAG-3′，引物25′GC TCT AGA TCC CTGCAC ATG CAG TTC-3′，采用RT-PCR方法從灰樹(shù)花總RNA中擴(kuò)增出一個(gè)大約2.2kb左右的片段，將該片段連接到pMD-T載體上；克隆大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的方法是利用引物15′CC GAA TTC ATG AAA CAG AAA ATT ACG-3′，引物25′GC TCT AGA TTT AAT CCA CAT AACCTG-3′，采用RT-PCR方法從大腸桿菌的總DNA中得到大約1.7kb左右的片段，將該片段連接到PMD-T載體上。
在所述步驟b中將灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因用EcoRI和BamHI雙酶切，然后和雙酶切后的pPICZα質(zhì)粒連接；將大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因用EcoRI和XbaI雙酶切，然后和雙酶切后的pPICZα質(zhì)粒連接。如需獲得更多是質(zhì)粒載體，所述步驟b中構(gòu)建的表達(dá)載體還可采用如下方法復(fù)制參照Sambrook方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。
在所述步驟c中將構(gòu)建好的灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體利用電激法，將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)好的畢赤酵母細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后均勻涂于含有Zeocin的YPDS平板中，大約3-4天可看到白色菌落出現(xiàn)。
在所述步驟c中挑取酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種于10mlBMGY中，置于50ml錐形瓶中，30℃，250rpm搖瓶培養(yǎng)至OD600＝2-6左右，離心收集菌體，菌體重懸于50mlBMMY中至OD600＝1；振蕩培養(yǎng)，每隔24小時(shí)加入100％甲醇至終濃度1％進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)量分別為180毫克/升和120毫克/升。
在所述步驟c中利用組氨酸親和柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白純度達(dá)到90％以上。
所述步驟d中在sucrose∶glucose∶Pi＝30∶30∶1mM的反應(yīng)液中，加入溶于MES(pH6.5)緩沖液中濃度為1微克/微升的海藻糖合成酶和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶，兩種酶在反應(yīng)液中的濃度各為1微克/毫升，于37℃反應(yīng)24小時(shí)。
本發(fā)明具有以下有益效果應(yīng)用基因工程、酶工程和發(fā)酵工程合成海藻糖，在酶法生產(chǎn)海藻糖方面形成了新的技術(shù)和工藝，同時(shí)以蔗糖和葡萄糖這兩種廉價(jià)的原料來(lái)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)海藻糖，降低了成本，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益。


下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不以任何形式限制本發(fā)明。
圖1是pPICZα-TR載體構(gòu)建策略圖2是pPICZα-TR的酶切鑒定圖中1、pPICZα-TR為模板的擴(kuò)增結(jié)果2、pPICZα-TR/EcoRI+XbaI3、pPICZα-TR/EcoRI4、pPICZα-TR/EcoRI5、trehalose synthase gene圖3是pPICZα-SUC載體構(gòu)建策略圖4是pPICZα-SUC的酶切鑒定圖中1、pPICZα-SUC為模板的擴(kuò)增結(jié)果2、pPICZ α-SUC/EcoRI+XbaI3、pPICZα-SUC/EcoRI4、pPICZα-TR/EcoRI5、sucrose phosphorylase圖5是畢赤酵母轉(zhuǎn)化的PCR鑒定圖中1-4pPICZα-SUC轉(zhuǎn)化子基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果5-7pPICAα-TR轉(zhuǎn)化子基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果。
圖6是蔗糖磷酸化酶的純化圖中1、低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)樣2、Pichia/pPICZα-SUC轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)4天的發(fā)酵液3、純化的蔗糖磷化酶圖7是海藻糖合成酶的純化圖中1、低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)樣2、Pichia/pPICZα-TR轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)4天的發(fā)酵液3、純化的海藻糖合成酶圖8是紙層析法分析酶反應(yīng)結(jié)果圖中1、海藻糖標(biāo)準(zhǔn)樣品2、海藻糖合成結(jié)果(酶由酵母表達(dá))具體實(shí)施方式
實(shí)施例1灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因的克隆和序列分析根據(jù)基因bank網(wǎng)站記載的灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物引物15′CC GAA TTC ATG GCT CCT CCC CAC CAG-3′，引物25′GC TCT AGA TCCCTG CAC ATG CAG TTC-3′，利用RT-PCR方法從灰樹(shù)花總RNA中擴(kuò)增出了一個(gè)大約2.2kb的片段，將該片段連接到pMD-T載體上(命名為PMD-T-TR)，進(jìn)行測(cè)序。從灰樹(shù)花RNA中擴(kuò)增的片段全長(zhǎng)2199bp，編碼732個(gè)氨基酸，根據(jù)DNASIS軟件分析，同報(bào)道的序列相比，有98.5％的堿基相同，而氨基酸序列則有99.2％的相似性。
實(shí)施例2大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的克隆和序列分析提取大腸桿菌的總DNA，利用引物15′CC GAA TTC ATG AAA CAG AAAATT ACG-3′，引物25′GC TCT AGA TTT AAT CCA CAT AACCTG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大約1.7kb的片段，將其連接到PMD-T載體上(命名為PMD-T-SUC)，進(jìn)行測(cè)序。該基因全長(zhǎng)1680bp，編碼559個(gè)氨基酸，根據(jù)DNASIS軟件分析，測(cè)序結(jié)果與基因BANK中大腸桿菌蔗糖磷酸化酶的序列相比，完全相同。
實(shí)施例3灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建如圖1所示，將PMD-T-TR載體上的海藻糖合成酶基因用EcoRI和BamHI雙酶切，和雙酶切后的pPICZα質(zhì)粒連接，連接后的質(zhì)粒命名為pPICZα-TR。如圖2所示，單酶切結(jié)果和雙酶切結(jié)果都表明，海藻糖合成酶基因已和載體相連。以載體為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，也擴(kuò)增出了目的片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序結(jié)果表明和以前測(cè)序結(jié)果相同。
實(shí)施例4大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建如圖3所示，將PMD-T-SUC上的大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因用EcoRI和XbaI雙酶切，和雙酶切后的pPICZα質(zhì)粒連接，連接后的質(zhì)粒命名為pPICZα-SUC。如圖4所示，單酶切結(jié)果和雙酶切結(jié)果都表明，大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因已和載體相連。以載體為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，也擴(kuò)增出了目的片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序結(jié)果表明和以前測(cè)序結(jié)果相同。
實(shí)施例5畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的鑒定將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒利用電激法，將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后均勻涂于含有Zeocin的YPDS平板中，大約3-4天可看到白色菌落出現(xiàn)。挑取適當(dāng)數(shù)目的菌落，培養(yǎng)過(guò)夜，取適量菌液，采用煮沸法提取基因組DNA作為PCR模板(劉秋云，2001)。通過(guò)PCR檢測(cè)目的基因。如圖5所示，從電泳圖譜中可以看出，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了目的片段，說(shuō)明蔗糖磷酸化酶基因和海藻糖合成酶基因已經(jīng)整合到酵母基因組中，擴(kuò)增出的目的片段連接到T載體上進(jìn)行測(cè)序，同以前的測(cè)序結(jié)果相比是相同的。
實(shí)施例6海藻糖合成酶基因和蔗糖磷酸化酶基因在酵母中的表達(dá)挑取酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種于10mlBMGY中，置于50ml錐形瓶中，30℃，250rpm搖瓶培養(yǎng)至OD600＝2-6左右，離心收集菌體，菌體重懸于50mlBMMY中(裝于500毫升三角瓶中)至OD600＝1；振蕩培養(yǎng)，每隔24小時(shí)加入100％甲醇至終濃度1％進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)量分別為180毫克/升和120毫克/升。每隔12小時(shí)取樣做菌濃度分析，每24小時(shí)取樣做蛋白檢測(cè)。
實(shí)施例7海藻糖合成酶和蔗糖磷酸化酶的純化用畢赤酵母表達(dá)的蛋白C末端有6個(gè)組氨酸(pPICZα載體上所帶)，使用組氨酸親和柱，可將蛋白快速純化。純化后的重組蛋白純度達(dá)到90％以上(見(jiàn)圖6和圖7)。
實(shí)施例8海藻糖的合成試驗(yàn)在1毫升的反應(yīng)液(300mM sucrose，300mM glucose，10mMPi)中，加入溶于MES(pH6.5)緩沖液中的海藻糖合成酶和蔗糖磷酸化酶各1微升(濃度約為1微克/微升)，于37℃反應(yīng)24小時(shí)，取30微升做紙層析分析，通過(guò)紙層析定性分析，如圖8所示，在反應(yīng)液中都檢測(cè)到了海藻糖的存在。證明在酵母和細(xì)菌中表達(dá)的海藻糖合成酶和蔗糖磷酸化酶都具有酶活性。而且說(shuō)明利用重組表達(dá)的海藻糖合成酶和蔗糖磷酸化酶合成海藻糖的方法是可行的。
另外，如需獲得更多是質(zhì)粒載體，所述步驟b中構(gòu)建的表達(dá)載體還可采用如下方法復(fù)制參照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring HarborLabroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。
將上述實(shí)施例6、實(shí)施例7的規(guī)模放大便可實(shí)現(xiàn)通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明專(zhuān)利的技術(shù)達(dá)到應(yīng)用較廉價(jià)的原料來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的目的。
權(quán)利要求
1.一種酶法合成海藻糖的工藝方法，包括下列步驟a.分別克隆灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因；b.分別構(gòu)建灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體；c.在酵母中分別轉(zhuǎn)化、表達(dá)灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因以及大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體，構(gòu)成重組蛋白，然后對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化；d.在以蔗糖和葡萄糖為主要成分的反應(yīng)液中，分別加入純化的上述重組蛋白合成海藻糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法合成海藻糖的工藝方法，在所述步驟a中克隆灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因的方法是利用引物15′CC GAA TTC ATG GCT CCTCCC CAC CAG-3′，引物25′GC TCTAGA TCC CTG CAC ATG CAG TTC-3′，采用RT-PCR方法從灰樹(shù)花總RNA中擴(kuò)增出一個(gè)大約2.2kb左右的片段，將該片段連接到pMD-T載體上；克隆大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的方法是利用引物15′CC GAA TTC ATG AAA CAG AAA ATT ACG-3′，引物25′GC TCT AGA TTT AATCCA CAT AACCTG-3′，采用RT-PCR方法從大腸桿菌的總DNA中得到大約1.7kb左右的片段，將該片段連接到PMD-T載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法合成海藻糖的工藝方法，在所述步驟b中將灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因用EcoRI和BamHI雙酶切，然后和雙酶切后的pPICZα質(zhì)粒連接；將大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因用EcoRI和XbaI雙酶切，然后和雙酶切后的pPICZα質(zhì)粒連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法合成海藻糖的工藝方法，所述步驟b中構(gòu)建的表達(dá)載體還可采用如下方法復(fù)制參照Sambrook方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法合成海藻糖的工藝方法，在所述步驟c中將構(gòu)建好的灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體利用電激法，將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)好的畢赤酵母細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后均勻涂于含有Zeocin的YPDS平板中，大約3-4天可看到白色菌落出現(xiàn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法合成海藻糖的工藝方法，在所述步驟c中挑取酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種于10mlBMGY中，置于50ml錐形瓶中，30℃，250rpm搖瓶培養(yǎng)至OD600＝2-6左右，離心收集菌體，菌體重懸于50mlBMMY中OD600＝1；振蕩培養(yǎng)，每隔24小時(shí)加入100％甲醇至終濃度1％進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)量分別為180毫克/升和120毫克/升。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法合成海藻糖的工藝方法，在所述步驟c中利用組氨酸親和柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白純度達(dá)到90％以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法合成海藻糖的工藝方法，所述步驟d中在sucrose∶glucose∶Pi＝30∶30∶1mM的反應(yīng)液中，加入溶于MES(pH6.5)緩沖液中濃度為1微克/微升的海藻糖合成酶和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶，兩種酶在反應(yīng)液中的濃度各為1微克/毫升，于37℃反應(yīng)24小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種酶法合成海藻糖的工藝方法，包括下列步驟a.分別克隆灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因；b.分別構(gòu)建灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因和大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體；c.在酵母中分別轉(zhuǎn)化、表達(dá)灰樹(shù)花海藻糖合成酶基因以及大腸桿菌蔗糖磷酸化酶基因的表達(dá)載體，構(gòu)成重組蛋白，然后對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化；d.在以蔗糖和葡萄糖為主要成分的反應(yīng)液中，分別加入純化的上述重組蛋白合成海藻糖。本發(fā)明應(yīng)用基因工程、酶工程和發(fā)酵工程合成海藻糖，在酶法生產(chǎn)海藻糖方面形成了新的技術(shù)和工藝，同時(shí)以蔗糖和葡萄糖這兩種廉價(jià)的原料來(lái)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)海藻糖，降低了成本，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12P19/12GK1740323SQ200410051199
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者李寶健, 徐志祥 申請(qǐng)人:李寶健