專利名稱：一種用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的引物和探針序列。
背景技術：
空腸彎曲菌是進出口食品中常見的致病菌，是導致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌。該菌的內毒素能侵襲小腸和大腸粘膜引起急性腸炎，亦可引起腹瀉的暴發(fā)流行或集體食物中毒。其潛伏期一般為3～5天，對人的致病部位是空腸、回腸及結腸，主要癥狀為腹瀉和腹痛，有時發(fā)熱，偶有嘔吐和脫水。細菌有時可通過腸粘膜入血流引起敗血癥和其他臟器感染，如腦膜炎、關節(jié)炎、腎盂腎炎等。孕婦感染本菌可導致流產，早產，而且可使新生兒受染。國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局的2002年第25和26號令中明確規(guī)定空腸彎曲菌為必檢項目。目前對該菌的檢測，國標和行標多采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)或酶聯(lián)反應(ELISA)的方法，這些方法步驟煩瑣，費時費力，一般至少要耗時4-6天，且由于多種干擾因素的影響，檢測結果的準確性容易降低，給食品的進出口帶來了非常不利的影響。因此，建立一種更加快速、準確、操作簡便的致病菌檢測方法勢在必行。
目前國內外應用于食源性病原菌檢測的分子生物學技術，主要分為三類普通PCR技術、熒光PCR技術和基因芯片技術。基因芯片方法檢測效率高，但技術還不成熟，假陽性率和假陰性率都很難控制，而且成本較高，目前還處于研究階段。普通PCR方法技術成熟，也最早用于食源性病原菌的檢測，但需要對PCR產物進行后處理，極易導致PCR產物污染，而且也有一定的非特異性擴增。熒光PCR是在普通PCR的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監(jiān)測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術。除了具有普通PCR的優(yōu)點外，它還具有以下優(yōu)點(1)特異性更強，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度。(2)全封閉反應，在線式實時監(jiān)測熒光，無須PCR產物的后處理，避免污染，保證了結果的可靠性。(3)數(shù)據(jù)分析選在核酸擴增的對數(shù)期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法，使得定量更準確可靠。(4)可實現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設計針對性內標，監(jiān)控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規(guī)?；?、自動化及聯(lián)網管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測任何細菌的核酸。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的引物和探針序列。
基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的引物和探針序列包括1.由上游引物CJU序列為TTGGTATGGCTATAGGAACTCTTATAGCT和下游引物CJR序列為CACACCTGAAGTATGAAGTGGTCTAAGT組成的引物對，以及該引物對的上游引物CJU位置向5’端方向延伸10個堿基，向3’端方向延伸10個堿基，下游引物CJR位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內得到的引物序列。探針序列包括由探針CJ-p1序列為ATGGCATATCCTAATTTA向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸5個堿基區(qū)域范圍內得到的探針序列。
2.由上游引物CJUF序列為TTCACGGCGAATTCCAATAAG和下游引物CJRR序列為TCTTTGTTTATGGGTGTGACTACATCT組成的引物對，以及該引物對的上游引物CJUF位置向5’端方向延伸10個堿基，向3’端方向延伸10個堿基，下游引物CJUR位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內得到的引物序列。探針序列包括由探針CJ-p2序列為TAAAACCCAAACAAGAACA向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內得到的探針序列。
本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應用PCR技術實現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴增。所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團所吸收，而在PCR擴增過程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，熒光報告基團的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比，從而判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。


圖1利用引物對CJU/CJR和探針CJ-p1檢測空腸彎曲菌陽性樣品的熒光PCR擴增圖。
具體實施例方式
1.引物和探針設計通過分別對所有已知的空腸彎曲菌基因組序列進行比較分析，選擇無二級結構且高度保守的區(qū)段(空腸彎曲菌開放閱讀框C序列，其全序列見附錄)，設計多對引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內無互補序列。最優(yōu)引物、探針序列組合如下(1)上游引物CJUTTGGTATGGCTATAGGAACTCTTATAGCT下游引物CJRCACACCTGAAGTATGAAGTGGTCTAAGT探針CJ-p1ATGGCATATCCTAATTTA(2)上游引物CJUFTTCACGGCGAATTCCAATAAG下游引物CJRRTCTTTGTTTATGGGTGTGACTACATCT探針CJ-p2TAAAACCCAAACAAGAACA2.反應體系的建立和優(yōu)化反應體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域模板以如下方法獲得取空腸彎曲菌標準菌株復蘇后培養(yǎng)48小時，取培養(yǎng)液1ml進行10倍梯度稀釋，選取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6個稀釋度作為系列陽性模板，分別提取基因組核酸，再分別用上述檢測序列區(qū)域中的最長的擴增片段的引物和探針進行PCR擴增，并取其中Ct值24-27之間者作為以后反應體系優(yōu)化時的模板。
2.1引物濃度的優(yōu)化 在反應體系中，將空腸彎曲菌的引物濃度分別從0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.2μmol/L。
2.2鎂離子濃度的優(yōu)化 在反應體系中其它條件不變的前提下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增，經過多次重復實驗選定2.5mmol/L為試劑盒反應體系中的鎂離子濃度。
2.3Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化 通過比較Taq酶用量(以單位Unit計)的優(yōu)化實驗結果，選定2U作為試劑盒反應體系中Taq酶的用量。
2.4dNTPs濃度的優(yōu)化通 過使用不同濃度的dNTPs進行檢測，綜合評估后選0.2mmol/L作為試劑盒反應體系中dNTPs的使用量。
2.5探針濃度的優(yōu)化 在反應體系中，將空腸彎曲菌的探針濃度分別從0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.1μmol/L。
利用上述引物和探針進行反應體系的建立，最后確定采用的熒光PCR反應體系為40μl體系，所需各組分及相應濃度見表1。
表1 優(yōu)化后的PCR反應體系

注a.在熒光PCR反應體積不同時，各試劑應按比例調整。
b.使用的儀器不同，應將反應參數(shù)作適當調整。
3.儀器檢測通道的選擇在進行熒光PCR反應時，應對所用儀器中反應管熒光信號的收集進行設置，選擇的熒光檢測通道與探針所標記的熒光報告基團一致。具體設置方法因儀器而異，應參照儀器使用說明書。
4.PCR條件選擇如下95℃2min，1個循環(huán)；95℃5sec，60℃40sec，40個循環(huán)。
5.檢測步驟(1)選取引物和探針；(2)制備待測模板，可采用酚-氯仿法提取各種來源樣品中空腸彎曲菌的基因組DNA；(3)反應體系的建立a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；c、確定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；d、確定dNTPs濃度；e、確定探針濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；(5)上機檢測。
6.實施例選取引物對CJU/CJR和探針CJ-p1，將待檢的空腸彎曲菌培養(yǎng)液用酚-氯仿法抽提基因組DNA。具體步驟如下(1)將待檢的空腸彎曲菌增菌液(約1ml)加入1.5ml的離心管中，12000rpm離心5分鐘，去上清。
(2)加入DNA裂解液700ul，充分混勻重懸，水浴煮沸5分鐘。
(3)加入等體積的酚-氯仿(V/V＝1∶1)溶液，充分混勻后離心，13000rpm離心5分鐘。
(4)將上清液移入另一個1.5ml的離心管中，加入等體積的氯仿，混勻，13000rpm離心5分鐘。
(5)將上清液移入另一個1.5ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心5分鐘。
(6)棄上清后用70％乙醇沖洗，13000rpm離心5分鐘，小心吸棄上清，倒置晾干。
(7)在干燥后的離心管中加入50ul DNA溶解液充分混勻，作為DNA模板待用。
在40ul熒光PCR反應體系中，加入以上提取的空腸彎曲菌基因組DNA 2ul，根據(jù)前述PCR反應條件進行熒光PCR檢測。經檢測，若待檢培養(yǎng)液中含有空腸彎曲菌則顯示陽性擴增曲線，其檢測靈敏度可達到1000個拷貝/ml；若待檢培養(yǎng)液中不含有空腸彎曲菌則無擴增信號，提示上述引物對和探針具有良好的靈敏度和特異性。
7.本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可達1000個拷貝/ml，說明其具有良好的靈敏度。
(2)本發(fā)明提供的引物和探針對于不含有空腸彎曲菌的檢測樣本均無擴增信號，說明其具有良好的特異性。
(3)由于本發(fā)明采用空腸彎曲菌的內源基因開放閱讀框C序列作為擴增的目的基因，避免了假陰性結果的產生。
(4)由于本發(fā)明采用熒光PCR技術作為檢測方法，整個反應均在封閉的反應管內進行，避免了其他核酸檢測方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性結果；由于對PCR產物進行實時監(jiān)測，大大節(jié)省了監(jiān)測時間，節(jié)約了人力物力。
附錄空腸彎曲菌 開放閱讀框C序列5’-CACCATTTACCCATTCCAGTAACAAAATAAGTTGGTACTTCCATGTTGTTAAAAAGATAAAGCATAGCTATACCTAAAAATGTAGCTATATAATACCATAGAGAAATATAAAGGGTTTTTTCACGGCGAATTCCAATCJUFAAGTCCAAAAATACTTACACCCCATAAAACCCAAACAAGAACAACAAGAATATCTAAAGGCCACTCAAGCCJ-p2TCTGCATATTCTTTAGATGTAGTCACACCCATAAACAAAGATATAACAGCTAAAACCATAGTAAGCATATCJRRAAAGCCAAAAATGAAGCTTACCAACAGCCATTAAAAATCTTGACTCAGCCATACTCACTTTAAGAACACGCTGACCTATATAATACCAAGTTGCCCAAATCCCTGAAAGCATAAAACCAAAAATCACACCTGAAGTATGACJRAGTGGTCTAAGTCTTGAAAAAGTGGCATATTCTCCTGCTAAATAATTTAAATTAGGATATGCCATTTGAACJ-p1AAGCTATAAGAGTTCCTATAGCCATACCAACAATGCCAAACAATATGGTCGCAAACATAAAATATCTTGCCJUAACCGTATAGTCGTAATTTAATACATTACCTGGATGCATCGACTTTCTCCTTAAAATTTTTGATAACAAGAGAATATTATAGAATATTAATTATACATTTTTTCTTAAAAATGATAATTTTGTTAATCATTTGTTATGTTTTATATTTTAAGGCTAAATCAGTCTTATTTATTGATATTTATCTTATAACCTAAACTTGGCACATTTTTTATAAAATCTTCACCCACTTTATCTCTTACTCTTTTTATAAAAGTTCTAACAGCAGTATCGCTCACATGTTCAC-3’
權利要求
1.一種用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物CJU序列為TTGGTATGGCTATAGGAACTCTTATAGCT和下游引物CJR序列為CACACCTGAAGTATGAAGTGGTCTAAGT組成的引物對，以及該引物對的上游引物CJU位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物CJR位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內得到的引物序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物CJU序列為TTGGTATGGCTATAGGAACTCTTATAGCT和下游引物CJR序列為CACACCTGAAGTATGAAGTGGTCTAAGT。
3.一種用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針CJ-p1序列為ATGGCATATCCTAATTTA向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸5個堿基區(qū)域范圍內得到的探針序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針CJ-p1序列為ATGGCATATCCTAATTTA。
5.一種用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物CJUF序列為TTCACGGCGAATTCCAATAAG和下游引物CJRR序列為TCTTTGTTTATGGGTGTGACTACATCT組成的引物對，以及該引物對的上游引物CJUF位置向5’端方向延伸10個堿基，向3’端方向延伸10個堿基，下游引物CJRR位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內得到的引物序列。
6.根據(jù)權利要求5所述的用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物CJUF序列為TTCACGGCGAATTCCAATAAG和下游引物CJRR序列為TCTTTGTTTATGGGTGTGACTACATCT。
7.一種用于空腸彎曲菌熒光PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針CJ-p2序列為TAAAACCCAAACAAGAACA向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內得到的探針序列。
8.根據(jù)權利要求7所述的用于檢測空腸彎曲菌核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針CJ-p2序列為TAAAACCCAAACAAGAACA。
全文摘要
一種用于空腸彎曲菌核苷酸片段的PCR擴增引物和探針序列。引物序列包括由上游引物CJU序列為TTGGTATGGCTATAGGAACTCTTATAGCT和下游引物CJR序列為CACACCTGAAGTATGAAGTGGTCTAAGT組成的引物對，以及該引物對的上游引物CJU向5’端方向延伸10個堿基，向3’端方向延伸10個堿基，下游引物CJR向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內得到的引物序列。探針序列包括由探針CJ－p1序列為ATGGCATATCCTAATTTA向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸5個堿基區(qū)域范圍內得到的探針序列。
文檔編號C12Q1/68GK1749412SQ20041005120
公開日2006年3月22日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權日2004年8月20日
發(fā)明者肖性龍, 林鏡中 申請人:深圳太太基因工程有限公司