專利名稱：一種用于檢測大腸桿菌o157h7核苷酸片段的引物和探針序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測大腸桿菌O157H7核苷酸片段的引物和探針序列。
背景技術(shù)：
大腸桿菌O157H7是進(jìn)出口食品中常見的致病菌，也是導(dǎo)致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌。該菌可以像通常的致病菌一樣產(chǎn)生細(xì)菌毒素，使感染者出現(xiàn)腹瀉等一系列病癥，并且可能引起病情更為兇險的溶血性尿毒綜合征。牛肉、牛奶、牛肉或牛奶制品、雞肉、豬肉、羊肉、蔬菜、水果、飲料、色拉、水等食品都可能成為其傳染媒介。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局的2002年第25和26號令中明確規(guī)定大腸桿菌O157H7為必檢項目。目前對該菌的檢測，國標(biāo)和行標(biāo)多采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)或酶聯(lián)反應(yīng)(ELISA)的方法，這些方法步驟煩瑣，費(fèi)時費(fèi)力，一般至少要耗時4-6天，且由于多種干擾因素的影響，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性容易降低，給食品的進(jìn)出口帶來了非常不利的影響。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、操作簡便的致病菌檢測方法勢在必行。
目前國內(nèi)外應(yīng)用于食源性病原菌檢測的分子生物學(xué)技術(shù)，主要分為三類普通PCR技術(shù)、熒光PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)?；蛐酒椒z測效率高，但技術(shù)還不成熟，假陽性率和假陰性率都很難控制，而且成本較高，目前還處于研究階段。普通PCR方法技術(shù)成熟，也最早用于食源性病原菌的檢測，但需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行后處理，極易導(dǎo)致PCR產(chǎn)物污染，而且也有一定的非特異性擴(kuò)增。熒光PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實(shí)時監(jiān)測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術(shù)。除了具有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)外，它還具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進(jìn)一步提高靈敏度。(2)全封閉反應(yīng)，在線式實(shí)時監(jiān)測熒光，無須PCR產(chǎn)物的后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性。(3)數(shù)據(jù)分析選在核酸擴(kuò)增的對數(shù)期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點(diǎn)分析法，使得定量更準(zhǔn)確可靠。(4)可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計針對性內(nèi)標(biāo)，監(jiān)控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規(guī)?；?、自動化及聯(lián)網(wǎng)管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測任何細(xì)菌的核酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測大腸桿菌O157H7核苷酸片段的引物和探針序列。
基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案用手檢測大腸桿菌O157H7核苷酸片段的引物和探針序列包括1.由上游引物O157RFBEF序列為TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG和下游引物O157RFBER序列為ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC組成的引物對，以及該引物對的上游引物O157RFBEF位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物O157RFBER位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。探針序列包括由探針O157RFBE-p1序列為TTTCCGAGTACATTGGC向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸4個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
2.由上游引物O157RFBEUF序列為ACTGATGCTATATATGTCAGTGTTGGAA和下游引物O157RFBERR序列為TGGAACGGTTGCTCTTCATTT組成的引物對，以及該引物對的上游引物O157RFBEUF位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物O157RFBERR位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。探針序列包括由探針O157RFBE-p2序列為TAACTTCATCTCCTTCCGATAT向3’端方向延伸1O個堿基和向5’端方向延伸2個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)所吸收，而在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽作用，熒光報告基團(tuán)的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。


圖1利用引物O157RFBEF/O157RFBER和探針O157RFBE-p1檢測大腸桿菌O157H7陽性樣品的熒光PCR擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式
1.引物和探針設(shè)計通過分別對所有已知的大腸桿菌O157H7基因組序列進(jìn)行比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段(大腸桿菌O157H7 rfbE基因，其全序列見附錄)，設(shè)計多對引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內(nèi)無互補(bǔ)序列。最優(yōu)引物、探針組合序列如下(1)上游引物O157RFBEFTCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG下游引物O157RFBERATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC探針O157RFBE-p1TTTCCGAGTACATTGGC(2)上游引物O157RFBEUFACTGATGCTATATATGTCAGTGTTGGAA下游引物O157RFBERRTGGAACGGTTGCTCTTCATTT探針O157RFBE-p2TAACTTCATCTCCTTCCGATAT2.反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化中所采用的靶區(qū)域模板以如下方法獲得取大腸桿菌O157H7標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后培養(yǎng)48小時，取培養(yǎng)液1ml進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6個稀釋度作為系列陽性模板，分別提取基因組核酸，再分別用上述檢測序列區(qū)域中的最長的擴(kuò)增片段的引物和探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并取其中Ct值24-27之間者作為以后反應(yīng)體系優(yōu)化時的模板。
2.1引物濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中，將大腸桿菌O157H7的引物濃度分別從0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測，通過試驗結(jié)果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.2μmol/L。
2.2鎂離子濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中其它條件不變的前提下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L遞增，經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗選定2.5mmol/L為試劑盒反應(yīng)體系中的鎂離子濃度。
2.3Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優(yōu)化 通過比較Taq酶用量(以單位Unit計)的優(yōu)化實(shí)驗結(jié)果，選定2U作為試劑盒反應(yīng)體系中Taq酶的用量。
2.4dNTPs濃度的優(yōu)化 通過使用不同濃度的dNTPs進(jìn)行檢測，綜合評估后選0.2mmol/L作為試劑盒反應(yīng)體系中dNTPs的使用量。
2.5探針濃度的優(yōu)化 在反應(yīng)體系中，將大腸桿菌O157H7的探針濃度分別從0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比連續(xù)稀釋后進(jìn)行檢測，通過試驗結(jié)果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.1μmol/L。
利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的熒光PCR反應(yīng)體系為40μl體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見表1。
表1 優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系

注a.在熒光PCR反應(yīng)體積不同時，各試劑應(yīng)按比例調(diào)整。
b.使用的儀器不同，應(yīng)將反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。
3.儀器檢測通道的選擇在進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時，應(yīng)對所用儀器中反應(yīng)管熒光信號的收集進(jìn)行設(shè)置，選擇的熒光檢測通道與探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光報告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說明書。
4.PCR條件選擇如下95℃2min，1個循環(huán)；95℃5sec，60℃40sec，40個循環(huán)。
5.檢測步驟(1)選取引物和探針；(2)制備待測模板，可采用酚-氯仿法提取各種來源樣品中大腸桿菌O157H7的基因組DNA；(3)反應(yīng)體系的建立a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；c、確定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；d、確定dNTPs濃度；e、確定探針濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；(5)上機(jī)檢測。
6.實(shí)施例選取引物對O157RFBEF/O157RFBER和探針O157-p1，將待檢的大腸桿菌O157H7培養(yǎng)液用酚-氯仿法抽提基因組DNA。具體步驟如下(1)將待檢的大腸桿菌O157H7增菌液(約1ml)加入1.5ml的離心管中，12000rpm離心5分鐘，去上清。
(2)加入DNA裂解液700ul，充分混勻重懸，水浴煮沸5分鐘。
(3)加入等體積的酚-氯仿(V/V＝1∶1)溶液，充分混勻后離心，13000rpm離心5分鐘。
(4)將上清液移入另一個1.5ml的離心管中，加入等體積的氯仿，混勻，13000rpm離心5分鐘。
(5)將上清液移入另一個1.5ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心5分鐘。
(6)棄上清后用70％乙醇沖洗，13000rpm離心5分鐘，小心吸棄上清，倒置晾干。
(7)在干燥后的離心管中加入50ul DNA溶解液充分混勻，作為DNA模板待用。
在40ul熒光PCR反應(yīng)體系中，加入以上提取的大腸桿菌O157H7基因組DNA 2ul，根據(jù)前述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR檢測。經(jīng)檢測，若待檢培養(yǎng)液中含有大腸桿菌O157H7則顯示陽性擴(kuò)增曲線，其檢測靈敏度可達(dá)到1000個拷貝/ml；若待檢培養(yǎng)液中不含有大腸桿菌O157H7則均無擴(kuò)增信號，提示上述引物對和探針具有良好的靈敏度和特異性。
7.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度可達(dá)1000個拷貝/ml，說明其具有良好的靈敏度。
(2)本發(fā)明提供的引物和探針對于不含有大腸桿菌O157H7的檢測樣本均無擴(kuò)增信號，說明其具有良好的特異性。
(3)由于本發(fā)明采用大腸桿菌O157H7的內(nèi)源基因rfbE基因作為擴(kuò)增的目的基因，避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。
(4)由于本發(fā)明采用熒光PCR技術(shù)作為檢測方法，整個反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，避免了其他核酸檢測方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽性結(jié)果；由于對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，大大節(jié)省了監(jiān)測時間，節(jié)約了人力物力。
附錄大腸桿菌O157H7 rfbE基因全序列5’-CAATTCCACCGCCCCACTCGTAAAATCCATCTGAATTCAACGCAATTTTCATGAATGACCTTTACAATATTTTAGGCTATTTATCACTATAAAATTCGTTAATAGATTCACAAATATAAATAACTTGCTCATTCGATAGGCTGGGGAAACTAGGTAAATTAATTCCACGCCAACCAAGATCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTGATO157RFBEFATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGGACAGGGTAAAAAACTGGCCTTGTTTCGATGAGTTTATCTGO157RFBE-p1 O157RFBERCAAGGTGATTCCTTAATTCCTCTCTTTCCTCTGCGGTCCTAGTTAGAATTGAGACCATCCAATAAGTGTGAAAAACATCTTTACTTTCCTTGTGGACTTGTACAAGACTGTTGATATTTTTTTTATAAATATCAGCAATTTCACGTTTTCGTGATATAAAATCATCAGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCTATAGCAGCGCAGATATTTGTCATCCTATAATTGTAGCCTATAACGTCATGCCAATATTGCCTATGTACAGCTAATCCTTGGCCTTTAAAATGTAAACAACGGTCATAAAGTGTTTTGTCATTCGTGACAACCATTCCACCTTCACCTGTAGTAATAGTTTTATTTCCAAAAAAGCTAAAAGTAGAAATATCTCCAAATGTTCCCACATATTTACCTTTATATTTAGAACCAAAGGCTTCAGCGCAATCTTCAATTACAAACAAATTTCTACTTTTGGCCAGTTCTACAATTTGTTCCATATCACATGGATGTCCGTATAAATGGACACACATAATAGCTTTAGTTTTATTAGTGATTTTTTGTTCTATGTCACTAACAGACATTTGCCAAGTTTCATTATCTGAATCAACGAAAATGGGGGTGGCTCCTGTGTATTTTATAGCATTAACTGATGCTATATATGTCAGTGTTGGAACAATAACTTCATCTCCTTCCGATAO157RFBEUFO157RFBE-2TACCTAACGCTAACAAAGCTAAATGAAGAGCAACCGTTCCATTACTTACAGTAGTTGCATATTGCACATO157RFBERRGGTTTTGTTCCGCAAATTTATTTTCAAACTTCTGAATATAGTTTCCTTTTGATGAAATCCACGTTGAGTCCAGACATTCATTTACATATTCTTTTTCTTTTCCTGTCAATGACGGTTGGTAAACTGGTATATATTTCATTTTCATCCTCTTATATTTAACTGTCTATCGATATGTTTTTTAAAACTACATTTATACCATATAAAGTAATTTACAATATATATAAAAATGAAG-3’
權(quán)利要求
1.一種用于檢測大腸桿菌0157H7核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物0157RFBEF序列為TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG和下游引物0157RFBER序列為ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC組成的引物對，以及該引物對的上游引物0157RFBEF位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物0157RFBER位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157H7核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列為上游引物0157RFBEF序列為TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG，下游引物0157RFBER序列為ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC。
3.一種用于檢測大腸桿菌0157H7核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針0157RFBE-p1序列為TTTCCGAGTACATTGGC向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸4個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測大腸桿菌0157H7核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針0157RFBE-p1序列為TTCCGAGTACATTGGC。
5.一種用于檢測大腸桿菌0157H7核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物0157RFBEUF序列為ACTGATGCTATATATGTCAGTGTTGGAA和下游引物0157RFBERR序列為TGGAACGGTTGCTCTTCATTT組成的引物對，以及該引物對的上游引物0157RFBEUF位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物0157RFBERR位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測大腸桿菌0157H7核苷酸片段的引物序列，其特征在于所述的引物序列為上游引物0157RFBEUF序列為ACTGATGCTATATATGTCAGTGTTGGAA和下游引物0157RFBERR序列為TGGAACGGTTGCTCTTCATTT。
7.一種用于檢測大腸桿菌0157H7核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針0157RFBE-p2序列為TAACTTCATCTCCTTCCGATAT向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸2個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測大腸桿菌0157H7核苷酸片段的探針序列，其特征在于所述的探針0157RFBE-p2序列為TAACTTCATCTCCTTCCGATAT。
全文摘要
一種用于檢測大腸桿菌O157H7核苷酸片段的引物和探針序列。引物序列包括由上游引物O157RFBEF序列為TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG和下游引物O157RFBER序列為ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC組成的引物對，以及該引物對的上游引物O157RFBEF位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物O157RFBER位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的引物序列。探針序列包括由探針O157RFBE－p1序列為TTTCCGAGTACATTGGC向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸4個堿基區(qū)域范圍內(nèi)得到的探針序列。
文檔編號C12Q1/68GK1749414SQ200410051210
公開日2006年3月22日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月20日
發(fā)明者肖性龍, 林鏡中 申請人:深圳太太基因工程有限公司