專利名稱：一種從蛇毒中分離l－氨基酸氧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種L-氨基酸氧化酶，具體地說(shuō)涉及一種L-氨基酸氧化酶的分離方法。
背景技術(shù)：
L-氨基酸氧化酶能催化L-氨基酸的脫氨基作用，生成相應(yīng)的α-酮酸，氨和過(guò)氧化氫。在工業(yè)生產(chǎn)上，L-氨基酸氧化酶被用來(lái)生產(chǎn)α-酮酸；在L-氨基酸和D-氨基酸混和物中能降解L-氨基酸，從而分離出D-氨基酸。L-氨基酸氧化酶還可用來(lái)制備測(cè)定L-氨基酸的酶電極。蛇毒是L-氨基酸氧化酶的主要來(lái)源之一。蛇毒的黃色就是L-氨基酸氧化酶產(chǎn)生的。目前已經(jīng)從蛇毒中分離到多個(gè)L-氨基酸氧化酶，并對(duì)它們的理化性質(zhì)以及生理活性進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)L-氨基酸氧化酶有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抑制或者誘導(dǎo)血小板聚集等活性，這些活性直接或者間接與其酶反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫有關(guān)。
蛇毒L-氨基酸氧化酶具有許多共同特征它們都是由兩個(gè)相同亞基構(gòu)成，表觀分子量在120kD左右；每個(gè)亞基在60kD左右；都含有兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的輔基FAD或者FMN。研究表明冷凍和pH變化使輔基脫離而導(dǎo)致酶活性的降低甚至喪失。目前報(bào)道的L-氨基酸氧化酶分離工藝中，大多數(shù)都包括濃縮和透析換緩沖體系的步驟，這必然造成對(duì)該酶活性的影響，從而影響對(duì)該酶酶學(xué)性質(zhì)和生理活性的研究以及在工業(yè)上的應(yīng)用。因此，尋找一種能夠在較短時(shí)間內(nèi)，沒(méi)有濃縮和緩沖體系變化的L-氨基酸氧化酶分離方法對(duì)于該酶的深入研究和開(kāi)發(fā)利用有著極為重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有L-氨基酸氧化酶分離技術(shù)中包括濃縮和透析換緩沖體系，從而對(duì)L-氨基酸氧化酶酶活性造成影響的問(wèn)題，提供一種沒(méi)有濃縮和透析換緩沖體系的L-氨基酸氧化酶分離方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種從白眉蝮蛇蛇毒中分離L-氨基酸氧化酶的方法，其特點(diǎn)在于通過(guò)親和層析和離子交換層析兩步層析法實(shí)現(xiàn)。
其中，上述的親和層析為肝素親和層析；上述的離子交換層析為陰離子交換層析。
上述的肝素親和層析包括如下步驟(1)樣品處理將蛇毒溶解于Tris-HCl緩沖液中，離心，取上清液；(2)裝柱流動(dòng)相A液為Tris-HCl緩沖液，B液為含有NaCl的A液；填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)過(guò)上述樣品處理的蛇毒樣品上清液；(3)洗脫先用A液洗脫，再用0％B-100％B線形梯度洗脫，然后用100％B洗層析柱；流速為0.5～3mL/min；
(4)收集檢測(cè)收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測(cè)洗脫液。上述的肝素親和層析具體包括如下步驟(1)樣品處理將蛇毒溶解于25mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH＝8.5，在4℃條件下，10000r/min離心10min，取上清液；(2)裝柱色譜柱體積25ml，填料為Heparin-Sepharose FastFlow，流動(dòng)相A液為25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L的NaCl的A液，先用A液充分平衡到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)樣品處理的蛇毒樣品；(3)洗脫先用50mL A液洗脫后，再以0％B-100％B線形梯度洗脫250mL，然后用100％B洗柱50mL，流速為2mL/min；(4)收集檢測(cè)用分步收集器收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。
上述的陰離子交換層析包括如下步驟(1)裝柱流動(dòng)相A液為Tris-HCl緩沖液，B液為含有NaCl的A液；填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)過(guò)權(quán)利要求(4)所述親和層析的蛇毒樣品；(2)洗脫先用A液洗脫，再用0％B-100％B線形梯度洗脫，然后用100％B洗層析柱；流速為0.5～3mL/min；(3)檢測(cè)收集收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測(cè)洗脫液，收集含L-氨基酸氧化酶的洗脫液上述的陰離子交換層析具體包括如下步驟(1)裝柱流動(dòng)相A液為25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L NaCl的A液，填料為Heparin-SepharoseFast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)過(guò)親和層析的蛇毒樣品；(2)洗脫先用100mL A液洗脫后，再以0％B-100％B線形梯度洗脫500mL，然后用100％B洗柱100mL，流速為2mL/min；(3)檢測(cè)收集用部分收集器收集洗脫液，在波長(zhǎng)為280nm下檢測(cè)洗脫液，收集含L-氨基酸氧化酶的洗脫液。
上述的肝素親和層析和陰離子交換層析都是在AKTA Prime設(shè)備上進(jìn)行。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過(guò)肝素親和層析和陰離子交換層析兩步柱層析法從蛇毒中分離出L-氨基酸氧化酶。所分離的L-氨基酸氧化酶在SDS-PAGE電泳圖中呈現(xiàn)一條帶，分子量約為58000。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、回收率高，并且無(wú)濃縮和緩沖體系變換的步驟，有效避免了冰凍和pH變化對(duì)酶活性的影響，便于推廣，可線形放大到生產(chǎn)工藝中。


圖1為蛇毒樣品在Heparin-Sepharose Fast Flow上的分離圖；圖2為L(zhǎng)AO活性峰在Q-Sepharose High Performace上的分離圖譜；圖3為L(zhǎng)AO在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳圖譜。
其中，圖1中，L-氨基酸氧化酶活性在穿透峰中；圖3中，1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，2為白眉蝮蛇粗毒，3為Heparin-Sepharose Fast Flow下穿透峰，4為Q-Sepharose High Performace分離后的活性峰，SDS-PAGE凝膠濃度為12.5％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、肝素親和層析(1)樣品處理稱取白眉蝮蛇蛇毒200mg，溶解于5mL 25mmol/LTris-HCl緩沖液中(pH8.5)中，在4℃條件下，10000r/min離心10min。取上清液。
(2)裝柱色譜柱體積25ml，填料為Heparin-Sepharose Fast Flow。流動(dòng)相A液為25mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)，B液為含有1mol/L的NaCl的A液。用A液充分平衡到電導(dǎo)值不變化時(shí)，上蛇毒樣品。
(3)洗脫A液50mL后，以0％B-100％B線形梯度洗脫250mL，再用100％B洗柱50mL；流速為2mL/min。
(4)收集檢測(cè)用分步收集器收集洗脫液，每管收集3mL，在280nm的光吸收下檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。整個(gè)層析過(guò)程在AKTA Prime設(shè)備上進(jìn)行。
2、陰離子交換層析，(1)裝柱色譜柱體積為75ml，流動(dòng)相A液為25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L NaCl的A液，填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)過(guò)親和層析的蛇毒樣品；
(2)洗脫先用100mL A液洗脫后，再以0％B-100％B線形梯度洗脫500mL，然后用100％B洗柱100mL，流速為2mL/min；(3)檢測(cè)收集用部分收集器收集洗脫液，每管收集4ml，在波長(zhǎng)為280nm下檢測(cè)洗脫液，收集含L-氨基酸氧化酶的洗脫液。整個(gè)層析過(guò)程在AKTA Prime設(shè)備上進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種從蛇毒中分離L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于包括如下步驟(1)親和層析；(2)離子交換層析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中分離L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于步驟(1)所述的親和層析為肝素親和層析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛇毒中分離L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于步驟(2)所述的離子交換層析為陰離子交換層析。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從蛇毒中分離L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于所述的肝素親和層析具體包括如下步驟(1)樣品處理將蛇毒溶解于Tris-HCl緩沖液中，離心，取上清液；(2)裝柱流動(dòng)相A液為Tris-HCl緩沖液，B液為含有NaCl的A液；填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)過(guò)上述樣品處理的蛇毒樣品上清液；(3)洗脫先用A液洗脫，再用0％B-100％B線形梯度洗脫，然后用100％B洗層析柱；流速為0.5～3mL/min；(4)收集檢測(cè)收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測(cè)洗脫液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從蛇毒中分離L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于所述的陰離子交換層析具體包括如下步驟(1)裝柱流動(dòng)相A液為Tris-HCl緩沖液，B液為含有NaCl的A液；填料為Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)過(guò)親和層析的蛇毒樣品；(2)洗脫先用A液洗脫，再用0％B-100％B線形梯度洗脫，然后用100％B洗層析柱；流速為0.5～3mL/min；(3)檢測(cè)收集收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測(cè)洗脫液，收集含L-氨基酸氧化酶的洗脫液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的從蛇毒中分離L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于所述的肝素親和層析具體包括如下步驟(1)樣品處理將蛇毒溶解于25mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH＝8.5，在4℃條件下，10000r/min離心10min，取上清液；(2)裝柱色譜柱體積25ml，填料為Heparin-Sepharose FastFlow，流動(dòng)相A液為25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L的NaCl的A液，先用A液充分平衡到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)樣品處理的蛇毒樣品；(3)洗脫先用50mL A液洗脫后，再以0％B-100％B線形梯度洗脫250mL，然后用100％B洗柱50mL，流速為2mL/min；(4)收集檢測(cè)用分步收集器收集洗脫液，在280nm的光吸收下檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從蛇毒中分離L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于所述的陰離子交換層析具體包括如下步驟(1)裝柱流動(dòng)相A液為25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH＝8.5，B液為含有1mol/L NaCl的A液，填料為Heparin-SepharoseFast Flow；先用A液充分平衡層析柱到電導(dǎo)值不變化時(shí)，再上經(jīng)過(guò)親和層析的蛇毒樣品；(2)洗脫先用100mL A液洗脫后，再以0％B-100％B線形梯度洗脫500mL，然后用100％B洗柱100mL，流速為2mL/min；(3)檢測(cè)收集用部分收集器收集洗脫液，在波長(zhǎng)為280nm下檢測(cè)洗脫液，收集含L-氨基酸氧化酶活性的洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從白眉蝮蛇蛇毒中分離L－氨基酸氧化酶的方法。本發(fā)明的特點(diǎn)是通過(guò)Heparin－Sepherose Fast Flow和QSepherose Fast Flow兩步柱層析法從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中分離純化出L－氨基酸氧化酶。該方法中不含有濃縮和緩沖體系變換的步驟，有效避免了冰凍和pH變化對(duì)酶活性的影響。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、回收率高，便于推廣。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1614012SQ200410052289
公開(kāi)日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者何韶衡, 魏繼福 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院