專利名稱：一種人白細胞介素28a的生產(chǎn)方法及重組il－28a工程菌的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說涉及一種人白細胞介素的生產(chǎn)方法及其重組工程菌。
背景技術(shù)：
人白細胞介素28A(IL-28A)是由一些病毒或雙鏈RNA(dsRNA)活化人的多種細胞如外周血單核細胞(PMBC)、樹突狀細胞(DC)和HeLa細胞等產(chǎn)生的細胞因子(Sheppard，P et al，2003，NatureImmunology，4(1)63-68)。IL-28A與干擾素(IFN)及IL-10有低水平同源性，IL-28A與IL-28B有96％同源性；染色體定位19q13.13。IL-28A同干擾素類似，通過誘導細胞產(chǎn)生多種細胞內(nèi)蛋白，這些蛋白質(zhì)介導其生物學活性，而且能選擇性地作用不同類型的靶細胞。因此，IL-28A可作為IFN的替代品，用于腫瘤、病毒性疾病等的治療，在臨床應用上有潛在的應用前景。但是目前對于IL-28A的生產(chǎn)普遍存在產(chǎn)物生物活性低、表達量小等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有IL-28A生產(chǎn)方法普遍存在產(chǎn)物生物活性低、表達量小的問題，提供一種人白細胞介素IL-28A的生產(chǎn)方法，利用該方法可以高效表達IL-28A，所得產(chǎn)物IL-28A多肽活性高、表達量大。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組IL-28A工程菌。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明采用基因工程方法生產(chǎn)人白細胞介素(IL)-28A，具體方法包括如下步驟(1)合成PCR引物，在合成的引物中導入LIC粘性末端，IL-28A上、下游引物的序列分別為5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-33-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCAC-5；(2)PCR擴增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-28A基因片段；(3)將上述PCR擴增得到的IL-28A基因片段與pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)建重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A；(4)將重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建重組IL-28A工程菌；(5)培養(yǎng)構(gòu)建的重組IL-28A工程菌，誘導其表達生產(chǎn)IL-28A。
其中，pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒的獲得見李明才，何韶衡.人白細胞介素(IL)-28和IL-29基因的克隆及序列分析.細胞與分子免疫學雜志，2004，20(5)635-637。在上述步驟(3)中可將PCR方法擴增得到的IL-28A基因片段的終止密碼子TGA轉(zhuǎn)換成大腸桿菌偏愛的密碼子TAA，然后和pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)建重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A；接著將載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建重組IL-28A工程菌，再用IPTG誘導其表達生產(chǎn)IL-28A。
上述PCR擴增的反應條件為①95℃變性15min；②94℃ 45s，72℃ 30s，退火溫度每循環(huán)降低1.0℃，72℃ 45s，5個循環(huán)；③94℃ 45s，設置退火溫度梯度從68℃到70℃ 30s，72℃45s，30個循環(huán)；④72℃延伸10min。
在上述生產(chǎn)人白細胞介素(IL)-28A的方法中，本發(fā)明構(gòu)建了一種重組IL-28A的工程菌，其特征在于由如下步驟構(gòu)建而成(1)合成PCR引物，并在合成的引物中導入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCAC-5；(2)PCR擴增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-28A基因片段；(3)將上述PCR擴增得到的IL-28A基因片段和pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)建重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A；(4)將重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建重組IL-28A工程菌；其中，在上述步驟(3)中可將PCR方法擴增得到的IL-28A基因片段的終止密碼子TGA轉(zhuǎn)換成大腸桿菌偏愛的密碼子TAA，然后和pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)建重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A；接著將載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建重組IL-28A工程菌。
上述所構(gòu)建重組IL-28A工程菌的培養(yǎng)基為(1)LB液體培養(yǎng)基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉，PH7.0；(2)LB固體培養(yǎng)基在上述LB液體培養(yǎng)基加1.5％(W/V)的瓊脂粉。
本發(fā)明的有益效果(1)采用含有不依賴連接反應的引物，準確獲得IL-28A基因的成熟肽cDNA片段，并克隆到IPTG誘導的pET載體上；(2)使用大腸桿菌偏愛的終止密碼子，提高表達效率；(3)擴大培養(yǎng)后的菌體產(chǎn)量高；(4)由于表達量可溶性成分高，用S蛋白親和柱使得一步純化即可獲得很純的產(chǎn)品。


圖1為重組質(zhì)粒pET-44-IL-28A構(gòu)建圖譜；圖2為克隆和轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒酶切圖譜圖3為IL-28A表達量SDS-PAGE圖譜；圖4為純化后IL-28A的SDS-PAGE圖譜；其中，圖2中，1為DNA標準，2為Xho I酶切IL-28A質(zhì)粒。圖3中，M為蛋白標準分子量，1為破菌后IL-28A上清總蛋白，2為未誘導細菌總蛋白，3為誘導后細菌總蛋白，4為破菌后細菌IL-28A沉淀總蛋白；圖4中，M為蛋白標準分子量，1為未誘導細菌總蛋白，2為誘導后細菌總蛋白，3為破菌后細菌沉淀總蛋白，4為破菌后上清總蛋白，5為純化后的IL-28A。
具體實施例方式
實施例(1)合成PCR引物根據(jù)GenBank中人白細胞介素IL-28A cDNA基因序列和pET-44 Ek/LIC載體上的LIC位點序列(見Novagen公司的說明書Cat 711433)，采用Omiga 2.0軟件設計如下引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-33-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCAC-5(2)PCR擴增在MJ Research PTC-200梯度PCR擴增儀上，采用熱啟動(hotstart)PCR擴增。以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒為模板。設置退火溫度梯度，循環(huán)條件為①95℃變性15min；②94℃ 45s，72℃ 30s，退火溫度每循環(huán)降低1.0℃，72℃ 45s，5個循環(huán)；③94℃ 45s，設置退火溫度梯度從68℃到70℃ 30s，72℃ 45s，30個循環(huán)；④72℃延伸10min。1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。上述pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒的獲得見李明才，何韶衡.人白細胞介素(IL)-28和IL-29基因的克隆及序列分析.細胞與分子免疫學雜志，2004，20(5)635-637。
(3)PCR產(chǎn)物與pET-44 Ek/LIC載體連接將上述PCR方法擴增得到的IL-28A基因片段和pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)成重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A，連接在0.5ml塑料離心管中進行，具體方法見pET-44 Ek/LIC載體的說明書(Novagen Cat 711433，可從商業(yè)渠道購得)。重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A的構(gòu)建圖譜如圖1所示。
(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化NovaBlue感受態(tài)菌上述連接產(chǎn)物混勻后，加到感受態(tài)的大腸桿菌NovaBlue中，放在冰浴中5分鐘，再于42℃水浴30秒，冰上放置2分鐘，加入250μl SOC培養(yǎng)液(不含抗菌素)，37℃保溫1小時，涂布于含有LB固體培養(yǎng)基(內(nèi)含氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)過夜，取陽性克隆的大腸桿菌菌落，進行菌落PCR、酶切鑒定和基因測序，結(jié)果與文獻報道的一致?？寺『娃D(zhuǎn)化后的質(zhì)粒酶切圖譜如圖2所示。
(5)轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)菌提取鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒，采用以上同樣方法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選，得陽性克隆的大腸桿菌即為工程菌。
(6)化學誘導表達經(jīng)篩選后的大腸桿菌接種于含有氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日按1.5％的比例擴大培養(yǎng)，37℃震蕩培養(yǎng)2～3小時，至OD600達到0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，22℃劇烈(210轉(zhuǎn)/分)震蕩培養(yǎng)6小時，收集菌體。
(7)SDS電泳超聲破細菌細胞，離心得到細胞上清，進行SDS-PAGE測定表明，IL-28A蛋白占菌體可溶蛋白的30％以上，占包含體蛋白的50％以上。IL-28A表達量的SDS-PAGE圖譜如圖3所示。
(8)表達產(chǎn)物的分離純化具體方法見S-Tag ThrombinPurification Kit的說明書(Novagen Cat 692323，可從商業(yè)渠道購得)。按Novagen公司的S蛋白柱純化，可得含量98％以上的IL-28A蛋白。純化后IL-28A表達量的SDS-PAGE圖譜如圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種人白細胞介素28A的生產(chǎn)方法，其特征在于采用基因工程方法生產(chǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述的人白細胞介素28A的生產(chǎn)方法，其特征在于所述基因工程方法包括如下步驟(1)合成PCR引物，并在合成的引物中導入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCAC-5；(2)PCR擴增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-28A基因片段；(3)將上述PCR擴增得到的IL-28A基因片段與pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)建重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A；(4)將重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建重組IL-28A工程菌；(5)培養(yǎng)構(gòu)建的重組IL-28A工程菌，誘導其表達生產(chǎn)IL-28A。
3.如權(quán)利要求2所述的人白細胞介素28A的生產(chǎn)方法，其特征在于所述基因工程方法包括如下步驟(1)合成PCR引物，并在合成的引物中導入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCAC-5；(2)PCR擴增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-28A基因片段；(3)將上述PCR方法擴增得到的IL-28A基因片段的終止密碼子TGA轉(zhuǎn)換成TAA，然后和pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)建重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A；(4)將重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建重組IL-28A工程菌；(5)培養(yǎng)構(gòu)建的重組IL-28A工程菌，誘導其表達生產(chǎn)IL-28A。
4.如權(quán)利要求2或3所述的人白細胞介素28A的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(2)所述PCR擴增的反應條件為①95℃變性15min；②94℃ 45s，72℃ 30s，退火溫度每循環(huán)降低1.0℃，72℃ 45s，5個循環(huán)；③94℃ 45s，設置退火溫度梯度從68℃到70℃ 30s，72℃ 45s，30個循環(huán)；④72℃延伸10min。
5.如權(quán)利要求2或3所述的人白細胞介素28A的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(5)是采用IPTG誘導重組IL-28A工程菌表達生產(chǎn)的。
6.一種重組IL-28A的工程菌，其特征在于由如下步驟構(gòu)建而成(1)合成PCR引物，并在合成的引物中導入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCAC-5；(2)PCR擴增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-28A基因片段；(3)將上述PCR擴增得到的IL-28A基因片段和pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)建重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A；(4)將重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建重組IL-28A工程菌；
7.如權(quán)利要求6所述的重組IL-28A的工程菌，其特征在于由如下步驟構(gòu)建而成(1)合成PCR引物，并在合成的引物中導入LIC粘性末端，上游引物5-GACGACGACAAGATTCCTGTCGCCAGGCTC-3下游引物3-GAGGAGAAGCCCGGTTTAGACACACAGGTCCCCAC-5；(2)PCR擴增以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-IL-28A質(zhì)粒為模板，通過PCR基因擴增，獲得IL-28A基因片段；(3)將上述PCR方法擴增得到的IL-28A基因片段的終止密碼子TGA轉(zhuǎn)換成TAA，然后和pET-44 Ek/LIC載體連接，構(gòu)建重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A；(4)將重組載體pET-44 Ek/LIC-IL-28A轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建重組IL-28A工程菌；
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人白細胞介素28A的生產(chǎn)方法及重組IL－28A工程菌。本發(fā)明包括人工合成引物；PCR擴增IL－28A成熟肽編碼區(qū)；IL－28A原核表達載體pET44－IL－28A的構(gòu)建；轉(zhuǎn)化入大腸桿菌構(gòu)建重組IL－28A工程菌；培養(yǎng)工程菌高效表達IL－28A；IL－28A的純化。本發(fā)明由于采用不依賴連接反應的克隆方法(LIC)，準確、快速獲得IL－28A基因的成熟肽編碼區(qū)；使用大腸桿菌偏愛的終止密碼子提高表達效率，表達量高，用S蛋白親和層析柱一步純化即可獲得很純的產(chǎn)品。IL－28A的制備，對臨床用于治療和預防感染性疾病及非感染性疾病具有重要的前景。
文檔編號C12N15/09GK1693458SQ20041005229
公開日2005年11月9日 申請日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者何韶衡, 李明才 申請人:汕頭大學醫(yī)學院