專利名稱：一種新的人分泌蛋白hPAP21的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新的分泌蛋白hPAP21蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
分泌蛋白是一類功能非常重要的蛋白，對(duì)多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。人體中分泌蛋白占人類蛋白質(zhì)組的十分之一，它們參與了信號(hào)途徑、血液凝固、免疫防御、癌癥發(fā)生等多種過程，如消化酶、胞外基質(zhì)與血漿中的很多主要因子，以及激素、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子等都是分泌蛋白。一些分泌蛋白具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，并已在實(shí)際上得到了廣泛的應(yīng)用，如生長(zhǎng)激素、干擾素和白細(xì)胞介素等分泌蛋白是由信號(hào)肽(signal peptide)介導(dǎo)，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后分泌到細(xì)胞外。蛋白質(zhì)分子中的信號(hào)肽研究開始于20世紀(jì)60年代，這方面的工作是在研究分泌蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，當(dāng)時(shí)的研究旨在了解，在核糖體上合成的新生肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^何種途徑被分泌到細(xì)胞外的。德裔美國(guó)科學(xué)家布洛貝爾(G.Blobel)，因?qū)Φ鞍踪|(zhì)分子中信號(hào)肽的開創(chuàng)性研究，獲得了1999年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
分泌蛋白區(qū)別于其他胞質(zhì)蛋白的唯一共同的特征就是氨基末端信號(hào)肽序列。信號(hào)肽在各個(gè)蛋白中都不相同，但有一些較類似的性質(zhì)。起始的甲硫氨酸后是一些多為親水的帶正電荷的殘基，該區(qū)為n區(qū)，然后是7-15個(gè)殘基的疏水區(qū)h區(qū)，該區(qū)富含亮氨酸、丙氨酸和纈氨酸，最后的c區(qū)包含信號(hào)肽蛋白酶的剪切位點(diǎn)。在剪切位點(diǎn)的-1和-3多為傾向?yàn)楸彼峄蚱渌麕Ф虃?cè)鏈的氨基酸，而在-4和-6位則為有助于剪切的脯氨酸。因此針對(duì)信號(hào)肽發(fā)展了許多遺傳算法來進(jìn)行信號(hào)肽的分析預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)信號(hào)肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域近年來得到迅猛發(fā)展，這極大地歸功于機(jī)器學(xué)習(xí)方法的改善和更多的序列信息來訓(xùn)練這些算法。這其中比較有效的模型就是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和隱藏的馬科夫模型。
SignalP是目前最有效的預(yù)測(cè)信號(hào)肽和剪切位點(diǎn)的方法。該軟件綜合了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和隱藏的馬科夫模型，前者預(yù)測(cè)是否含信號(hào)肽蛋白，后者預(yù)測(cè)剪切位點(diǎn)。通過大量的序列樣本進(jìn)行訓(xùn)練(非同源的原核生物蛋白266個(gè)革蘭氏陰性菌序列，141個(gè)革蘭氏陽性菌序列；真核生物蛋白1011個(gè)非同源蛋白序列)，得到較高的準(zhǔn)確性，真核生物準(zhǔn)確性為78％，原核生物為89％。
用SignalP2.0對(duì)人蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)合pSORT分析，初步確定后選基因。RT-PCR獲得目的基因，構(gòu)建到真核表達(dá)載體中使其表達(dá)，WESTERN BLOT驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果，確定基因是否表達(dá)分泌蛋白。
通過上述生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合的方法，獲得了1個(gè)新分泌蛋白hPAP21。而且通過其保守的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，hPAP21可能是一個(gè)新的胞外蛋白酶。通過去糖基化酶、糖鏈抑制劑處理，及定點(diǎn)突變分析進(jìn)一步確定hPAP21是糖蛋白，而且糖鏈對(duì)蛋白的分泌很重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種新的人分泌蛋白hPAP21；本發(fā)明的另一目的在于提供了上述新的人分泌蛋白hPAP21的制備方法；本發(fā)明的再一目的在于提供了與上述新的人分泌蛋白hPAP21特異結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明公開了一種分離的人分泌蛋白hPAP21，所述分泌蛋白包含與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。優(yōu)選的，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
本發(fā)明還公開了一種制備上述的分離的人分泌蛋白hPAP21的方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟(a)將編碼具有人分泌蛋白hPAP21活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hPAP21蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸69-635位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hPAP21蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hPAP21蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hPAP21蛋白活性的多肽。
優(yōu)選的，上述步驟(a)中，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸69-635位的核苷酸。
本發(fā)明還公開了能與權(quán)利要求1所述的人分泌蛋白hPAP21多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的hPAP21可能是一個(gè)新的胞外蛋白酶。通過去糖基化酶、糖鏈抑制劑處理，及定點(diǎn)突變分析進(jìn)一步確定hPAP21是糖蛋白，而且糖鏈對(duì)蛋白的分泌很重要。并且分泌蛋白是一種功能非常重要的蛋白，在多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。該分泌蛋白具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的SignalP2.0(SignalP-NN)分析的信號(hào)肽結(jié)果；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的SignalP2.0(SignalP-HMM)分析的信號(hào)肽結(jié)果；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的hPAP21基因及蛋白基本結(jié)構(gòu)；圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的hPAP21同源蛋白的氨基酸序列比較結(jié)果(黑色為保守區(qū)域，灰色為相似區(qū)域)；圖5是本發(fā)明實(shí)施例1的hPAP21同源蛋白進(jìn)化樹分析結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例2的Q9BHPAP21基因的克隆瓊脂糖凝膠電泳圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例2的Western blotting驗(yàn)證hPAP21基因的分泌特性及糖基化修飾結(jié)果圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例3的Western blotting驗(yàn)證N-糖基化對(duì)hPAP21蛋白分泌特性的影響結(jié)果圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例4搜索genecard網(wǎng)站得到的hPAP21芯片雜交的表達(dá)譜；圖10是本發(fā)明實(shí)施例4搜索genecard網(wǎng)站得到的hPAP21電子Northern表達(dá)譜；圖11是本發(fā)明實(shí)施例4的人類多組織RNA印跡膜對(duì)hPAP21基因的組織分布結(jié)果圖；圖12是本發(fā)明實(shí)施例5的免疫熒光顯示hPAP21蛋白在細(xì)胞中的分布圖像；圖13是本發(fā)明實(shí)施例5的hPAP21蛋白的亞細(xì)胞定位圖像；圖14是本發(fā)明實(shí)施例6的菌落的PCR鑒定。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1人hPAP21蛋白生物信息學(xué)分析序列相似性比對(duì)及進(jìn)化樹分析，采用軟件Alignment，6eneDoc，Treeview。信號(hào)肽、穿膜區(qū)域預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位分析分別采用網(wǎng)上的共享web軟件SignalP http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/，SOSUI http//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html及PSORT http//psort.nibb.ac.jp/。
功能結(jié)構(gòu)域和基元(motif)預(yù)測(cè)，采用了
PROSITE http//us.expasy.org/prosite/，InterPro Scan http//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html，ProfileScan，http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN以及NCBI的CDART(Conserved Domain Architecture Retrieval Tool)，http//www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml。
修飾位點(diǎn)分析采用了http//au.expasy.org/tools/。
結(jié)果1.hPAP21蛋白由C2orf7基因(GenBank accession No.NM032319)編碼，在基因組上定位于2p13.2上，成熟mRNA共1103堿基，翻譯后蛋白由188個(gè)氨基酸組成。
核酸及氨基酸序列見SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，其中，氨基酸序列中，N端1-20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽區(qū)域，65-156個(gè)氨基酸為PA結(jié)構(gòu)域。
2.利用SignalP2.0軟件分析該蛋白疏水性，根據(jù)結(jié)果(圖1和圖2)，該蛋白N端序列為信號(hào)肽的可能性為99.9％。信號(hào)肽剪切位點(diǎn)最可能是20位和21之間，即氨基酸CVA-AH間。軟件計(jì)算結(jié)果如下SignalP-NN result＞Sequence length＝70# Measure Position Value Cutoff signal peptide？max. C 22 0.884 0.33 YESmax. Y 22 0.848 0.32 YESmax. S 11 0.986 0.82 YESmean S 1-210.891 0.47 YES# Most likely cleavage site between pos.21 and 22VAA-HGSignalP-HMM result＞SequencePredictionSignal peptideSignal peptide probability1.000Signal anchor probability0.000Max cleavage site probability0.447 between pos.20 and 21
3.從SOSUIsignal Result的結(jié)果來看，hPAP21的N端有一段長(zhǎng)20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽段，沒有穿膜區(qū)域。用PSORT軟件分析預(yù)測(cè)HPAP21的分布為66.7％位于細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)，22.2％位于液泡，11.1％位于線粒體中。
4對(duì)hPAP21基因成熟mRNA(907bp)BLAST人基因組序列得到基因在基因組上的分布，如圖3A所示基因有5個(gè)外顯子，共跨越5,222bp。hPAP21蛋白結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(圖3B)，N端1-20aa為信號(hào)肽區(qū)域，65-156aa為PA結(jié)構(gòu)域。
5.以hPAP21的蛋白序列在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性搜索，發(fā)現(xiàn)在小鼠中有一同源性達(dá)到97％的同源蛋白(序列號(hào)XP_132652)但是該蛋白也是功能未知的。另外還有一些同源性較低的蛋白，分別有來自非洲爪蟾，果蠅，瘧蚊和線蟲等，見表1。
表1hPAP21的同源蛋白

這些同源蛋白的序列比對(duì)采軟件Alignment，經(jīng)GeneDoc軟件處理后，結(jié)果如圖4。
進(jìn)化樹分析顯示人與小鼠、爪蟾的進(jìn)化關(guān)系最近，其次是線蟲，最后才是果蠅和瘧蚊。雖然果蠅和瘧蚊的序列同源性較線蟲更高。結(jié)果見圖5。
6.用PROSITE http//us.expasy.org/prosite/分析hPAP21，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)N糖基化位點(diǎn)分別在121、171位；1個(gè)0糖基化位點(diǎn)在186位；9個(gè)磷酸化位點(diǎn)分別在36、42、47、60、125、132、133、150、155位；2個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)分別在54、160位。
實(shí)施例21hPAP21基因的克隆和hPAP21-pcDNA3.1A-真核載體的構(gòu)建1.1設(shè)計(jì)引物hPAP21-pCDNA3.1A-FCCGGATCCATGGTCCCCGGCGC(SEQ ID NO.3)(含BamHI限制性內(nèi)切酶切點(diǎn))hPAP21-pCDA3.1A-RCCAAGCTTCCAGAAGGTCCAGGGC(SEQ ID NO.4)(含HindIII限制性內(nèi)切酶切點(diǎn))
1.2PCR反應(yīng)

從國(guó)家人類基因組南方研究中心構(gòu)建的Q9BHPAP21克隆載體中擴(kuò)增Q9BHPAP21基因全長(zhǎng)ORF片段，擴(kuò)增出的片段大小為581bp。2％瓊脂糖凝膠電泳圖如圖6所示。
PCR條件94℃5min；94℃45s，42℃45s，72℃1min，35cycle；72℃7min.
1.3BamHI&HindIII雙酶切PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒

37℃酶切5hr，70℃熱失活15min1.4連接

16℃連接16hr。
1.5電轉(zhuǎn)化以參數(shù)電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，將1μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，37℃，250rpm于LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)1hr，涂平板。
菌落PCR鑒定在長(zhǎng)有菌落的LB(Amp)平板上分別挑取多個(gè)菌落作PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系與上述PCR的體系相同。
質(zhì)粒提取將經(jīng)PCR鑒定陽性克隆質(zhì)粒hPAP21-pcDNA3.1A，采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)試劑盒抽提。所得質(zhì)粒經(jīng)核酸測(cè)序驗(yàn)證插入片段正確(由申友公司完成)。
2Western blotting驗(yàn)證hPAP21基因的分泌特性及糖基化修飾2.1轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞1)鋪細(xì)胞預(yù)熱DMEM(無血清，無抗生素)培養(yǎng)基和胰酶(0.1％trypsin)，37℃；COS-7細(xì)胞接種密度是1-1.5×105/35mm培養(yǎng)皿；37℃，5％CO2培養(yǎng)5-24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁；2)轉(zhuǎn)染A質(zhì)粒用量1~2ug，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；B脂質(zhì)體Lipofectamine(GibcoBRL公司)3ul-5ul，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；A+B，混勻，室溫靜置15-45min，一般30min；培養(yǎng)細(xì)胞去上清，用DMEM(無血清，無抗生素)洗一次，加800ul DMEM(無血清，無抗生素)，滴入轉(zhuǎn)染混合液，搖勻；如細(xì)胞貼壁性不好或不耐受無血清培養(yǎng)液，可用完全培養(yǎng)基；37℃，5％CO2培養(yǎng)5-24小時(shí)，換液為DMEM(10％FCS)，繼續(xù)培養(yǎng)至總轉(zhuǎn)染時(shí)間為48-72小時(shí)。
2.2Western Blotting1)樣品處理上清處理收集細(xì)胞培養(yǎng)盤中的上清，13000rpm，8min。收集離心上清，取200ul純化。
細(xì)胞處理用PBS(pH7.4)2ml洗盤中細(xì)胞兩次，加200ul裂解緩沖液，冰上20分鐘裂解。然后刮下細(xì)胞，將裂解液于4℃離心12000rpm，8min，回收上清，進(jìn)行純化。
TALON樹脂預(yù)處理將1體積的TALON樹脂貯存液于5000rpm離心5分鐘，去上清，用1×E/W緩沖液洗兩次，然后加等體積的1×E/W緩沖液得到50％的樹脂混合液。
樣品純化在樣品中加入適量的預(yù)處理過的50％Slurry，加入800ul1×E/W緩沖液，4℃結(jié)合2小時(shí)。8000rpm離心5分鐘去上清，用1×E/W緩沖液洗3-4次，去除非特異結(jié)合的蛋白。
2)蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜常規(guī)蛋白電泳分離樣品；15％分離膠，60V 30min，160V 1hr20min。PVDF膜用甲醇浸濕10min，去離子水沖洗，再轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20分鐘；電泳膠置轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20分鐘；厚紙墊板也置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。按下列順序放置轉(zhuǎn)膜儀負(fù)極—墊板—電泳膠—PVDF膜—墊板—正極。轉(zhuǎn)膜半小時(shí)，電壓15伏。
3)膜的封閉3％脫脂牛奶&2％BSA/PBST 50ml，水平搖床，室溫封閉4小時(shí)；也可以先室溫封閉若干時(shí)間，再放入4℃冰箱，過夜；4)一抗(鼠抗人C-Myc 9E10)用封閉液稀釋一抗，鼠抗人C-myc 9E10(200ng/ul)稀釋倍數(shù)1000倍；將膜完全沒于一抗稀釋液中。水平搖床，室溫2小時(shí)，也可過夜。
5)洗滌先用PBST短暫地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗10分鐘；3*10分鐘，室溫洗滌；6)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)用封閉液稀釋二抗，10000倍稀釋；水平搖床，室溫2小時(shí)。
7)洗滌先用PBST短暫地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗10分鐘；3*10分鐘，室溫洗滌；8)檢測(cè)將檢測(cè)試劑(ECL plus)從4℃取出，在打開前平衡至室溫；將檢測(cè)試劑的A液與B液以40∶1的比例混合，檢測(cè)試劑的用量為0.1ml/cm2；膜置于吸水紙上干燥，蛋白面朝上，檢測(cè)試劑加在膜上，覆蓋整個(gè)膜表面；室溫2分鐘；用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸干多余的檢測(cè)試劑；膜用保鮮膜封起，暗室曝光，時(shí)間10秒；先用10秒時(shí)間多壓幾張，再延長(zhǎng)時(shí)間壓一張或幾張，延長(zhǎng)時(shí)間壓片的時(shí)候，洗最先壓的片子。
2.3去糖基化分析2.3.1肽N-糖苷酶F(PNGase F)(New England Biolabs)酶切1)蛋白樣品處理見Western Blot樣品處理方法；2)在1×糖蛋白變性緩沖液中100℃煮沸10分鐘，使糖蛋白變性；3)加1/10體積的10×G7緩沖液及10％NP-40；4)加入1ulPNGase F，37℃，過夜；5)電泳，Western Blot檢測(cè)。
2.3.2糖苷內(nèi)切酶H(Endo H)(New England Biolabs)酶切1)蛋白樣品處理見Western Blot樣品處理方法；2)在1×糖蛋白變性緩沖液中100℃煮沸10分鐘，使糖蛋白變性；3)加入1/10體積的10×G5緩沖液；4)加入1ul Endo H，37℃，過夜；5)電泳，Western Blot檢測(cè)。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。
如圖所示，CL表示為細(xì)胞裂解液；CM表示細(xì)胞培養(yǎng)上清?？梢猿醪脚袛酁榉置诘鞍?，但分子量較預(yù)測(cè)的大，可能是因?yàn)榉g后修飾，特別是N-糖基化。為證實(shí)這一猜測(cè)，選擇C2orf7蛋白穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞株A3進(jìn)行分析。細(xì)胞分盤培養(yǎng)3天，長(zhǎng)到80-90％滿，收細(xì)胞與培養(yǎng)上清，蛋白純化、電泳、去糖基化酶處理，western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示蛋白的確被N-糖基化，而且糖基化程度在胞內(nèi)與胞外的狀態(tài)不同。胞內(nèi)蛋白主要以高甘露糖鏈存在(c箭頭所示)能被肽-N糖苷酶F與糖苷內(nèi)切酶H完全切下，蛋白條帶遷移變快，至d箭頭位置；少量的以新合成的未被糖基化蛋白形式存在(d箭頭所示)。胞外分泌型蛋白主要以復(fù)雜糖鏈存在(a，b箭頭所示)只能被肽-N糖苷酶F切下；少量的以高甘露糖鏈存在(c箭頭所示)，能被肽-N糖苷酶F與糖苷內(nèi)切酶H完全切下。
實(shí)施例3N-糖基化對(duì)hPAP21蛋白分泌特性的影響3.1衣霉素(tunicamycin)(TM)處理1)二甲基亞砜(DMSO)溶解衣霉素成5mg/ml；2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株以5×105/35mm培養(yǎng)皿密度接種；2)培養(yǎng)24小時(shí)后，培養(yǎng)細(xì)胞去上清，PBS(pH7.4)洗一次，換液為加有2ug/ml的衣霉素的DMEM/10％FCS培養(yǎng)基；陰性對(duì)照，換液為加有相同體積的DMSO的DMEM/10％FCS培養(yǎng)基；3)培養(yǎng)24小時(shí)后，收蛋白，Western Blot檢測(cè)。蛋白樣品處理見Western Blot樣品處理方法。
3.2突變體構(gòu)建采用基于重疊PCR的定點(diǎn)突變方法。設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)序列居中的正向與反向引物(mutant F-P，mutant R-P)，以野生型基因序列為模板，mutant F-P與野生型(wild type)R-P；wild type F-P與mutant R-P為引物，分別PCR。電泳，割膠純化PCR產(chǎn)物，等量混合作為第二次PCR的模板，以wild type F-P與wild type R-P為引物，二次PCR，得到突變體PCR產(chǎn)物。構(gòu)建到合適載體中。突變體蛋白結(jié)構(gòu)示意圖見圖3B。
一般分泌蛋白的糖基化對(duì)蛋白的分泌很重要。這里為分析N-糖基化是否會(huì)影響蛋白分泌，首先在培養(yǎng)液中加入衣霉素(2μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，收蛋白，western blot檢測(cè)(圖8A)。衣霉素可抑制N-糖鏈形成，加入衣霉素，hPAP21蛋白的分泌被抑制，蛋白穩(wěn)定表達(dá)降低。初步證明了N-糖基化對(duì)分泌及表達(dá)的重要性。
為更進(jìn)一步分析N-糖基化對(duì)分泌的影響，把糖基化位點(diǎn)Asn-Xaa-Ser/Thr中的Asn突變?yōu)镚ln，構(gòu)建了突變體。野生型與突變體分別瞬轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞，western blot檢測(cè)(圖8B)。突變體-1(Asn121Gln)的蛋白條帶與野生型的遷移一致，說明121位在野生型中沒有被糖基化。突變體-2(Asn171Gln)與突變體-3(Asn121Gln & Asn171Gln)的蛋白條帶遷移一致，而且較野生型遷移快，遷移位置與野生型蛋白被肽-N糖苷酶F處理后的一致，說明171位被糖基化，又一次證明了121位沒有被糖基化。突變體都能分泌，但分泌效率有差異，灰度掃描后量化野生型及各突變體的分泌效率(圖8B)，與野生型相比，突變體-2(Asn171Gln)與突變體-3(Asn121Gln & Asn171Gln)降低了約40％，說明N-糖基化對(duì)hPAP21蛋白的分泌的確很重要，至少是對(duì)蛋白的高效分泌是必要的。另一方面，突變體-2(Asn171Gln)與突變體-3(Asn121Gln & Asn171Gln)的蛋白穩(wěn)定表達(dá)量也有顯著的降低。
實(shí)施例4人hPAP21基因的組織表達(dá)譜4.1電子Northern表達(dá)譜4.1.1搜索genecard網(wǎng)站http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/，分別得到hPAP21芯片雜交的表達(dá)譜(圖9)與電子Northern表達(dá)譜(圖10)。
4.1.2搜索SOURCEhttp//genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch，可得到unigene的表達(dá)信息。
4.2Northern印跡4.2.1材料和試劑隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(random primer DNA labeling kit)購自寶生物工程(大連)有限公司)；人類多組織RNA印跡膜和快速雜交液(ExpressHyb hybridization solution)均購自Clontech公司；20×SSC(PH＝7.0)NaCl 175.32g檸檬酸鈉88.23g，同位素P32購自PE公司。
洗膜溶液wash solution I2×SSC；0.05％SDS；加水到1000ml20×SSC--------100ml20％SDS--------2.5ml加水到1000mlwash solution II0.1×SSC；0.1％SDS；加水到1000ml20×SSC--------5ml20％SDS--------5ml加水到1000ml采用Clontech公司的人類多組織RNA印跡膜對(duì)該基因的組織分布進(jìn)行研究。該印跡膜含12種組織，腦、心、骨骼肌、結(jié)腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺、外周血白細(xì)胞。
由Northern印跡結(jié)果(圖11)，可以看出該基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)較為廣泛，各個(gè)組織中均有一定表達(dá)，在骨骼肌、心臟和肝臟中表達(dá)最高。
實(shí)施例51hPAP21蛋白的亞細(xì)胞定位將帶有外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染單層培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，外源基因以融合或非融合的形式在細(xì)胞中表達(dá)，用針對(duì)融合或非融合蛋白的抗體處理細(xì)胞，再用FITC標(biāo)記的二抗處理，隨后在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)結(jié)合有熒光二抗的部分會(huì)在單色光的激發(fā)下，發(fā)出熒光，從而可以判斷表達(dá)的蛋白在細(xì)胞中的分布。
材料選取COS-7細(xì)胞或Hela細(xì)胞，100×PLA(多聚賴氨酸)一抗Tag抗體(mouse-anti-human c-myc 9E10)或特異抗體，1∶50-1∶200稀釋(PBS/5％BSA)，二抗驢抗兔CyTM2IgG，1∶50稀釋(PBS/5％BSA)結(jié)果見圖12，免疫熒光顯示hPAP21蛋白分布在除細(xì)胞核以外的細(xì)胞質(zhì)中。
2hPAP21蛋白的分泌途徑分泌蛋白的一般分泌途徑有兩種經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器然后分泌；不經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器，直接分泌。為分析hPAP21蛋白的分泌途徑，將pcDNA3.1-hPAP21-Myc和pEYFP-Golgi(Clontech)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到CHO細(xì)胞中，進(jìn)行熒光共定位分析(圖13)(方法同上，二抗使用驢抗兔CyTM5 IgG)。pEYFP-Golgi質(zhì)粒有高爾基細(xì)胞器膜定位信號(hào)，使表達(dá)的融合蛋白定位在高爾基體上，通過共聚焦熒光顯微鏡分析判斷hPAP21蛋白是否定位在高爾基體內(nèi)。圖A表示pEYFP-Golgi的YFP融合蛋白的細(xì)胞定位情況(綠色)，B圖表示標(biāo)有Cy5的二抗對(duì)目的基因的亞細(xì)胞定位的檢測(cè)(紅色)，C圖表示A與B圖的重疊。在C圖中黃色表示A、B圖中的蛋白共定位。如圖所示hGH，P28分別做為陽性和陰性對(duì)照。P28蛋白已知定位于細(xì)胞核內(nèi)，沒有黃色顯現(xiàn)，人生長(zhǎng)激素(hGH)是通過高爾基細(xì)胞器分泌的分泌蛋白。所以hPAP21蛋白的確部分定位在高爾基體內(nèi)，說明hPAP21蛋白的分泌途徑是典型的或是依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器的分泌。
實(shí)施例6人hPAP21基因原核細(xì)胞表達(dá)、純化及抗體制備與純化在該實(shí)施例中，將全長(zhǎng)的人hPAP21編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
1基因片段的克隆1.1材料表達(dá)載體pGEX-5x-1Pharmacia公司產(chǎn)品，全長(zhǎng)4969bp，為含谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathione S-transferase，GST)的融合表達(dá)載體。含Ptac啟動(dòng)子，氨芐青霉素抗性，GST后接多克隆位點(diǎn)，含三個(gè)讀框的終止碼，GST與目的基因之間有Factor Xa識(shí)別位點(diǎn)。
合成引物正向引物CCGAATTCGCCCACGGCTTCCGTAT(SEQ ID NO.5)，含酶切位點(diǎn)EcoRI；反向引物CGGCTCGAGCTACCAGAAGGTCCAGGGC(SEQ ID NO.6)，酶切位點(diǎn)XhoI。以上引物均由上海申友公司合成。
菌株E.coli DH5α1.2方法直接以先前構(gòu)建的pcDNA3.1A-hPAP21質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)合適引物擴(kuò)增基因片段，設(shè)計(jì)引物時(shí)使擴(kuò)增出的片段去掉編碼信號(hào)肽的一段。這樣通過原核細(xì)胞表達(dá)出的蛋白才與真核細(xì)胞中分泌到胞外的蛋白相同。終止密碼子采用基因本身的終止密碼子。
(1)PCR反應(yīng)
采用相應(yīng)引物根據(jù)下列組分進(jìn)行PCR反應(yīng)成分 體積

94℃3min；94℃變性30s，54℃退火40sec，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸7min。
(2)膠回收采用QIAGEN公司的Gel Extraction Kit參照操作手冊(cè)割膠回收。
(3)酶切載體片段和擴(kuò)增片段根據(jù)下列組分進(jìn)行酶切反應(yīng)成分體積

37℃酶切12hr，70℃熱失活15min(4)連接酶切好的載體和擴(kuò)增片段根據(jù)下列組分進(jìn)行連接反應(yīng)成分 體積

16℃連接12hr。
(5)轉(zhuǎn)化參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(6)菌落的PCR鑒定在長(zhǎng)有菌落的LB(Amp)平板上分別挑取多個(gè)菌落作PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系與上述PCR的體系相同。電泳圖像見圖14。
(7)質(zhì)粒小抽采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)參照產(chǎn)品操作手冊(cè)抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒測(cè)序，插入片段正確。
2hPAP21蛋白的原核表達(dá)和純化2.1材料Glutathione Sepharose 4B購買自Pharmacia公司；Factor Xa購買自Pharmacia公司；E.coli BL21；上述構(gòu)建好的pGEX5x-hPAP21質(zhì)粒。
2.2方法(1)小量表達(dá)構(gòu)建的表達(dá)菌種接種于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的飽和菌1∶50接種于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6。不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)3-5hr。8000rpm離心10min，去上清，加500ml1×PBS，重懸菌體。取出20ul走SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
(2)大量表達(dá)及樣品處理根據(jù)小量表達(dá)的條件放大，菌體重懸。加入1M DTT至最終濃度為5mM，PMSF至最終濃度為100ug/ml。冰浴超聲裂解細(xì)胞成勻漿。加20％Triton X-100至終濃度1％，冰浴30min。12000rpm離心10min，分裝上清，-20℃儲(chǔ)存。
(3)純化將凍存細(xì)胞上清13000rpm，4℃，離心10分鐘，取上清。加入適量50％GlutathioneSepharose 4B Slurry，4℃搖動(dòng)混勻2hr。Glutathione Sepharose 4B的預(yù)處理方法見該試劑盒的操作手冊(cè)。3000rpm離心5分鐘，去上清，重懸于PBS中，重復(fù)洗滌四次，上柱。用PBS洗滌至所測(cè)OD值接近空白對(duì)照PBS。換用GST Elution buffer洗脫，測(cè)每一收集管的OD值。收集洗脫后的蛋白，裝入透析帶透析，期間適當(dāng)換透析液1×PBS。透析后收集袋內(nèi)液體，測(cè)蛋白濃度，并用蛋白電泳檢測(cè)。
3hPAP21蛋白的抗體制備和純化3.1材料Protein A Sepharose CL-4B購自Pharmacia公司3.2方法(1)所得蛋白免疫兔子，制多克隆抗體。此部分工作由上海生物工程中心動(dòng)物房完成(2)收集的免疫后兔子血離心收集上清，得到抗血清，Western檢測(cè)所得抗體的效果和特異性。
(3)用Protein A Sepharose CL-4B純化所得抗血清，并用結(jié)合有GST蛋白的Glutathione Sepharose 4B出去其中的抗GST抗體。
預(yù)處理Protein A Sepharose CL-4B，見產(chǎn)品說明。用Wash/binding buffer(20mM磷酸鈉溶液，150mM NaCl，pH＝7.4)配制50％的Slurry。樣品準(zhǔn)備，血清樣品用Wash/binding buffer 1∶1稀釋。將平衡好的50％Slurry倒入柱子填充，使樹脂在重力作用下自然沉降。用10倍柱體積的Wash/binding buffer平衡柱子。上樣，樣品加至樹脂頂部。流出液重復(fù)上柱三遍。用10倍柱體積的Wash/binding buffer洗，直到280nm的光吸收接近空白。用4倍柱體積的Elution Buffer(100mM Glycine-HCl，pH＝3.0)洗脫，收集流出液，每管200ul，測(cè)定280OD值。直至無蛋白洗出。再生柱子，4倍Elution Buffer繼續(xù)洗脫后用Wash/binding buffer大量洗。
實(shí)施例7CHO hPAP21蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建2μg真核表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞(35mm培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)48小時(shí)；消化至100mm培養(yǎng)皿，加G418至終濃度1000μg/ml(CHO)培養(yǎng)2-3星期直至有克隆形成；去培養(yǎng)皿內(nèi)的培液，PBS洗兩次，胰酶浸泡過的無菌濾紙片覆蓋于克隆上，消化數(shù)分鐘后轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)；Western blot鑒定表達(dá)目的蛋白的克隆。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>一種新的人分泌蛋白hPAP21<130>NP-1348<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1103<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(69)..(635)<220>
<221>sig_peptide<222>(69)..(128)<220>
<221>polyA_signal<222>(1033)..(1038)<220>
<221>polyA_signal<222>(1058)..(1063)<400>1gtcctgcgag cgacgcgcgg cggggcggcg agaggaaacg cggcgccggg ccgggcccgg 60ccctggag atg gtc ccc ggc gcc gcg ggc tgg tgt tgt ctc gtg ctc tgg 110Met Val Pro Gly Ala Ala Gly Trp Cys Cys Leu Val Leu Trp1 5 10ctc ccc gcg tgc gtc gcg gcc cac ggc ttc cgt atc cat gat tat ttg158Leu Pro Ala Cys Val Ala Ala His Gly Phe Arg Ile His Asp Tyr Leu15 20 25 30tac ttt caa gtg ctg agt cct ggg gac att cga tac atc ttc aca gcc206
Tyr Phe Gln Val Leu Ser Pro Gly Asp Ile Arg Tyr Ile Phe Thr Ala35 40 45aca cct gcc aag gac ttt ggt ggt atc ttt cac aca agg tat gag cag 254Thr Pro Ala Lys Asp Phe Gly Gly Ile Phe His Thr Arg Tyr Glu Gln50 55 60att cac ctt gtc ccc gct gaa cct cca gag gcc tgc ggg gaa ctc agc 302Ile His Leu Val Pro Ala Glu Pro Pro Glu Ala Cys Gly Glu Leu Ser65 70 75aac ggt ttc ttc atc cag gac cag att gct ctg gtg gag agg ggg ggc 350Asn Gly Phe Phe Ile Gln Asp Gln Ile Ala Leu Val Glu Arg Gly Gly80 85 90tgc tcc ttc ctc tcc aag act cgg gtg gtc cag gag cac ggc ggg cgg 398Cys Ser Phe Leu Ser Lys Thr Arg Val Val Gln Glu His Gly Gly Arg95 100 105 110gcg gtg atc atc tct gac aac gca gtt gac aat gac agc ttc tac gtg 446Ala Val Ile Ile Ser Asp Asn Ala Val Asp Asn Asp Ser Phe Tyr Val115 120 125gag atg atc cag gac agt acc cag cgc aca gct gac atc ccc gcc ctc 494Glu Met Ile Gln Asp Ser Thr Gln Arg Thr Ala Asp Ile Pro Ala Leu130 135 140ttc ctg ctc ggc cga gac ggc tac atg atc cgc cgc tct ctg gaa cag 542Phe Leu Leu Gly Arg Asp Gly Tyr Met Ile Arg Arg Ser Leu Glu Gln145 150 155cat ggg ctg cca tgg gcc atc att tcc atc cca gtc aat gtc acc agc 590His Gly Leu Pro Trp Ala Ile Ile Ser Ile Pro Val Asn Val Thr Ser160 165 170atc ccc acc ttt gag ctg ctg caa ccg ccc tgg acc ttc tgg tag 635Ile Pro Thr Phe Glu Leu Leu Gln Pro Pro Trp Thr Phe Trp175 180 185aagagtttgt cccacattcc agccataagt gactctgagc tgggaagggg aaacccagga 695attttgctac ttggaatttg gagatagcat ctggggacaa gtggagccag gtagaggaaa 755agggtttggg cgttgctagg ctgaaaggga agccacacca ctggccttcc cttccccagg 815gcccccaagg gtgtctcatg ctacaagaag aggcaagaga caggccccag ggcttctggc 875
tagaacccga aacaaaagga gctgaaggca ggtggcctga gagccatctg tgacctgtca935cactcacctg gctccagcct cccctaccca gggtctctgc acagtgacct tcacagcagt995tgttggagtg gtttaaagag ctggtgtttg gggactcaat aaaccctcac tgacttttta1055gcaataaagc ttctcatcag ggttgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1103<210>2<211>188<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Val Pro Gly Ala Ala Gly Trp Cys Cys Leu Val Leu Trp Leu Pro1 5 10 15Ala Cys Val Ala Ala His Gly Phe Arg Ile His Asp Tyr Leu Tyr Phe20 25 30Gln Val Leu Ser Pro Gly Asp Ile Arg Tyr Ile Phe Thr Ala Thr Pro35 40 45Ala Lys Asp Phe Gly Gly Ile Phe His Thr Arg Tyr Glu Gln Ile His50 55 60Leu Val Pro Ala Glu Pro Pro Glu Ala Cys Gly Glu Leu Ser Asn Gly65 70 75 80Phe Phe Ile Gln Asp Gln Ile Ala Leu Val Glu Arg Gly Gly Cys Ser85 90 95Phe Leu Ser Lys Thr Arg Val Val Gln Glu His Gly Gly Arg Ala Val100 105 110Ile Ile Ser Asp Asn Ala Val Asp Asn Asp Ser Phe Tyr Val Glu Met
115 120 125Ile Gln Asp Ser Thr Gln Arg Thr Ala Asp Ile Pro Ala Leu Phe Leu130 135 140Leu Gly Arg Asp Gly Tyr Met Ile Arg Arg Ser Leu Glu Gln His Gly145 150 155 160Leu Pro Trp Ala Ile Ile Ser Ile Pro Val Asn Val Thr Ser Ile Pro165 170 175Thr Phe Glu Leu Leu Gln Pro Pro Trp Thr Phe Trp180 185<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ccggatccat ggtccccggc gc 22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ccaagcttcc agaaggtcca gggc24
<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5ccgaattcgc ccacggcttc cgtat25<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6cggctcgagc taccagaagg tccagggc 28
權(quán)利要求
1.一種分離的人分泌蛋白hPAP21，其特征在于，所述分泌蛋白包含與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的人分泌蛋白hPAP21，其特征在于，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
3.一種制備權(quán)利要求1的分離的人分泌蛋白hPAP21的方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟(a)將編碼具有人分泌蛋白hPAP21活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hPAP21蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸69-635位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hPAP21蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hPAP21蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hPAP21蛋白活性的多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的一種制備人分泌蛋白hPAP21的方法，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸69-635位的核苷酸。
5.一種抗體，其特征在于，所述抗體是能與權(quán)利要求1所述的人分泌蛋白hPAP21多肽特異性結(jié)合的抗體。
6.一種含有權(quán)利要求1的人分泌蛋白hPAP21的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類新的分泌蛋白hPAP21。本發(fā)明的hPAP21可能是一個(gè)新的胞外蛋白酶。通過去糖基化酶、糖鏈抑制劑處理，及定點(diǎn)突變分析進(jìn)一步確定hPAP21是糖蛋白，而且糖鏈對(duì)蛋白的分泌很重要。分泌蛋白是一種功能非常重要的蛋白，在多細(xì)胞生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。該分泌蛋白具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1721534SQ20041005284
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者周宇波, 朱智東, 朱弘, 黃健, 韓澤廣 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心