專利名稱：一種新的人分泌蛋白hCGI－143的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種新的分泌蛋白hCGI-143蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
分泌蛋白是一類功能非常重要的蛋白，對多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。人體中分泌蛋白占人類蛋白質(zhì)組的十分之一，它們參與了信號途徑、血液凝固、免疫防御、癌癥發(fā)生等多種過程，如消化酶、胞外基質(zhì)與血漿中的很多主要因子，以及激素、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子等都是分泌蛋白。一些分泌蛋白具有潛在的臨床應(yīng)用價值，并已在實際上得到了廣泛的應(yīng)用，如生長激素、干擾素和白細(xì)胞介素等。
分泌蛋白是由信號肽(signal peptide)介導(dǎo)，進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后分泌到細(xì)胞外。蛋白質(zhì)分子中的信號肽研究開始于20世紀(jì)60年代，這方面的工作是在研究分泌蛋白的基礎(chǔ)上進行的，當(dāng)時的研究旨在了解，在核糖體上合成的新生肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^何種途徑被分泌到細(xì)胞外的。德裔美國科學(xué)家布洛貝爾(G.Blobel)，因?qū)Φ鞍踪|(zhì)分子中信號肽的開創(chuàng)性研究，獲得了1999年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。
分泌蛋白區(qū)別于其他胞質(zhì)蛋白的唯一共同的特征就是氨基末端信號肽序列。信號肽在各個蛋白中都不相同，但有一些較類似的性質(zhì)。起始的甲硫氨酸后是一些多為親水的帶正電荷的殘基，該區(qū)為n區(qū)，然后是7-15個殘基的疏水區(qū)h區(qū)，該區(qū)富含亮氨酸、丙氨酸和纈氨酸，最后的c區(qū)包含信號肽蛋白酶的剪切位點。在剪切位點的-1和-3多為傾向為丙氨酸或其他帶短側(cè)鏈的氨基酸，而在-4和-6位則為有助于剪切的脯氨酸。因此針對信號肽發(fā)展了許多遺傳算法來進行信號肽的分析預(yù)測。預(yù)測信號肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域近年來得到迅猛發(fā)展，這極大地歸功于機器學(xué)習(xí)方法的改善和更多的序列信息來訓(xùn)練這些算法。這其中比較有效的模型就是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和隱藏的馬科夫模型。
SignalP是目前最有效的預(yù)測信號肽和剪切位點的方法。該軟件綜合了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和隱藏的馬科夫模型，前者預(yù)測是否含信號肽蛋白，后者預(yù)測剪切位點。通過大量的序列樣本進行訓(xùn)練(非同源的原核生物蛋白266個革蘭氏陰性菌序列，141個革蘭氏陽性菌序列；真核生物蛋白1011個非同源蛋白序列)，得到較高的準(zhǔn)確性，真核生物準(zhǔn)確性為78％，原核生物為89％。
分泌蛋白約占人類蛋白質(zhì)組的十分之一，是一類功能非常重要的蛋白，在多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮著重要作用。發(fā)現(xiàn)與研究新分泌蛋白是目前功能基因組學(xué)研究的熱點之一。
用SignalP2.0對人蛋白數(shù)據(jù)庫進行信號肽預(yù)測，結(jié)合pSORT分析，初步確定候選基因。RT-PCR獲得目的基因，構(gòu)建到真核表達載體中使其表達，WESTERN BLOT驗證生物信息學(xué)分析結(jié)果，確定基因是否表達分泌蛋白。
通過上述生物信息學(xué)預(yù)測與實驗驗證結(jié)合的方法，獲得了1個新分泌蛋白hCGI-143。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種新的人分泌蛋白hCGI-143；本發(fā)明的另一目的在于提供了上述新的人分泌蛋白hCGI-143的制備方法；本發(fā)明的再一目的在于提供了與上述新的人分泌蛋白hCGI-143特異結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明公開了一種分離的人分泌蛋白hCGI-143，所述分泌蛋白包含與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。優(yōu)選的，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
本發(fā)明還公開了一種制備上述的分離的人分泌蛋白hCGI-143的方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟(a)將編碼具有人分泌蛋白hCGI-143活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成hCGI-143蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸102-515位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hCGI-143蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達hCGI-143蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hCGI-143蛋白活性的多肽。
優(yōu)選的，上述步驟(a)中，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸102-515位的核苷酸。
本發(fā)明還公開了能與權(quán)利要求1所述的人分泌蛋白hCGI-143多肽特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明的分泌蛋白hCGI-143是一種功能非常重要的蛋白，在多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。該分泌蛋白具有潛在的臨床應(yīng)用價值。


圖1是本發(fā)明實施例1的SignalP2.0軟件分析SignalP-NN結(jié)果圖像；圖2是本發(fā)明實施例1的SignalP2.0軟件分析SignalP-HMM結(jié)果圖像；圖3是本發(fā)明實施例1的hCGI-143基因及蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明實施例1的10個代表性的物種的CGI-143基因序列比對結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明實施例1的CGI-143基因進化樹分析結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明實施例1的人hCGI-143與小鼠、大鼠同源基因比較結(jié)果圖；圖7是本發(fā)明實施例2的hCGI-143基因瓊脂糖凝膠電泳圖；圖8是本發(fā)明實施例2的Western blotting驗證hCGI-143基因的分泌特性結(jié)果圖；圖9是本發(fā)明實施例3搜索genecard網(wǎng)站得到的hCGI-143芯片雜交的表達譜；圖10是本發(fā)明實施例3搜索genecard網(wǎng)站得到的hCGI-143電子Northern表達譜；圖11是本發(fā)明實施例3的人類多組織RNA印跡膜對hCGI-143基因的組織分布結(jié)果圖；圖12是本發(fā)明實施例4的免疫熒光顯示hCGI-143蛋白在細(xì)胞中的分布圖像；圖13是本發(fā)明實施例4的hCGI-143蛋白分泌途徑的熒光共定位分析結(jié)果圖；圖14是本發(fā)明實施例5的蛋白電泳結(jié)果圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1hCGI-143基因生物信息學(xué)分析1.序列相似性比對及進化樹分析，采用軟件Alignment，GeneDoc，Treeview。
信號肽、穿膜區(qū)域預(yù)測、亞細(xì)胞定位分析分別采用網(wǎng)上的共享web軟件SignalP http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/，SOSUI http//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html及PSORT http//psort.nibb.ac.jp/。
功能結(jié)構(gòu)域和基元(motif)預(yù)測，采用了PROSITE http//us.expasy.org/prosite/，InterPro Scan http//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html，ProfileScan，http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN以及NCBI的CDART(Conserved Domain Architecture Retrieval Tool)，http//www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml。
修飾位點分析采用了http//au.expasy.org/tools/。
結(jié)果hCGI-143蛋白(NP_057158)在基因組上定位于1q21.2上，由137個氨基酸組成，分子量為14289Da，成熟mRNA共903堿基(見SEQ ID NO.1)。
2.利用SignalP2.0軟件分析該蛋白疏水性，根據(jù)結(jié)果，該蛋白N端序列為信號肽的可能性為99.5％。信號肽剪切位點最可能是20位和21之間。軟件分析的圖像結(jié)果見圖1、圖2，軟件分析的數(shù)據(jù)結(jié)果如下SignalP-NN result#data> length＝70#Measure Position Value Cutoff signal peptide？max. C 35 0.477 0.33 YESmax. Y 21 0.442 0.32 YESmax. S 6 0.947 0.82 YESmean S 1-200.787 0.47 YES#Most likely cleavage site between pos.20 and 21CLC-QGSignalP-HMM result#data>#PredictionSignal peptideSignal peptide probability0.995Signal anchor probability0.000Max cleavage site probability0.345 between pos.20 and 213.從SOSUIsignal Result的結(jié)果來看，hCGI-143的N端有一段長20個氨基酸的信號肽段，沒有穿膜區(qū)域。PSORT軟件分析預(yù)測hCGI-143的分布為44.4％位于細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)，22.2％位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，11.1％位于高爾基體中。11.1％位于液泡，11.1％位于核內(nèi)。
4.對hCGI-143基因成熟mRNA(903bp)BLAST人基因組序列得到基因在基因組上的分布，如圖3A所示基因只有1個外顯子，在5’UTR中間有一個內(nèi)含子，共跨越1,170bp。hCGI-143蛋白結(jié)構(gòu)簡單(圖3B)，N端1-20aa為信號肽區(qū)域，39-104aa為BolA結(jié)構(gòu)域。
5.用PROSITE http//us.expasy.org/prosite/分析HCGI-143，發(fā)現(xiàn)了以下修飾位點，如表1表1

6.以hCGI-143的蛋白序列在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性搜索，得到100條有同源性的基因，選取有10個代表性的物種的同源性較高的基因，進行序列比對，結(jié)果見圖4和表2。采用Alignment與GeneDoc軟件處理。同源區(qū)域主要在BolA結(jié)構(gòu)域。
表2

7.進化樹分析Treeview軟件讀取Alignment分析的數(shù)據(jù)得到結(jié)果如圖5。
人、小鼠、大鼠基因與果蠅、瘧蚊較為接近，與擬南芥、酵母、血吸蟲、線蟲、及大腸桿菌基因進化關(guān)系較遠(yuǎn)。酵母ScCGI-143蛋白是可能的DNA修復(fù)蛋白；線蟲CeCGI-143基因的RNAi結(jié)果仍是野生型，沒有明顯的表型變化；大腸桿菌EcCGI-143蛋白可能通過參與調(diào)節(jié)胞壁質(zhì)基因表達改變大腸桿菌形態(tài)Santos JM，F(xiàn)reire P，Vicente M，Arraiano CM.Thestationary-phase morphogene bolA from Escherichia coli is induced by stress during early stages ofgrowth.Mol Microbiol.1999 May；32(4)789-98.Induction of a growth-phase-dependent promotertriggers transcription of bolA，an Escherichia coli morphogene.EMBO J.1989 Dec1；8(12)3923-31.。所以在GO分類中把有BolA結(jié)構(gòu)域蛋白的功能歸到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面。
人hCGI-143與小鼠、大鼠同源基因比較見圖6，同源性很高，人與小鼠和大鼠基因的主要區(qū)別在N端的信號肽區(qū)域，SignalP預(yù)測結(jié)果顯示小鼠和大鼠的hCGI-143同源基因沒有信號肽，PSORT預(yù)測小鼠基因亞細(xì)胞分布為52.2％線粒體(mitochondrial)，39.1％細(xì)胞核(nuclear)，4.3％細(xì)胞骨架(cytoskeletal)，4.3％細(xì)胞質(zhì)(cytoplasmic)；預(yù)測大鼠基因亞細(xì)胞分布為52.2％細(xì)胞質(zhì)(cytoplasmic)，13.0％細(xì)胞核(nuclear)，8.7％線粒體(mitochondrial)，4.3％胞外(extracellular)，，包括細(xì)胞壁(cell wall)，4.3％細(xì)胞骨架(cytoskeletal)，4.3％空泡(vacuolar)，4.3％高爾基體(Golgi)，4.3％分泌系統(tǒng)的囊泡(vesicles of secretory system)，4.3％內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum)。
表明雖然人與小鼠和大鼠的序列同源性達82％，但表達蛋白的亞細(xì)胞定位可能不同，也暗示著蛋白功能的不同。
實施例21.人hCGI-143基因的克隆和pcDNA3.1A-hCGI-143真核載體的構(gòu)建1.1設(shè)計引物hCGI-143-pCDNA3.1A-FGGGCTCGAGATGCTGAGTGGGCGGCT(SEQ ID NO.3)(含Xho1限制性內(nèi)切酶切點)hCGI-143-pCDNA3.1A-RGCGAATTCGGGGGTTCCTAGAGTTTTCTTG(SEQ ID NO.4)(含Ecor1限制性內(nèi)切酶切點)1.2PCR反應(yīng)成分 體積模板 0.4ul10×Buffer 1.0ul正向引物(10pmol/ul) 0.5ul反向引物(10pmol/ul) 0.5uldNTP Mix(10mM of each dNTP) 0.2ul
Pfu DNA聚合酶(5U/ul)0.1uldd H2O 7.3ul總體積 10ul從自制的人腦cDNA庫中PCR獲得hCGI-143的全長ORF片段。2％瓊脂糖凝膠電泳圖如圖7。PCR條件94℃ 4min；94℃ 40s，60℃ 45s，72℃ 50min，35 cycle；72℃ 7min。
1.3Xho1 & Ecor1雙酶切PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒成分體積純化PCR產(chǎn)物(1ug)/質(zhì)粒 5ul10×Buffer 21ulXho1(10U/ul)0.5ulEcor1(10U/ul) 0.5uldd H2O 3ul總體積 10ul37℃酶切4hr，70℃熱失活 15min1.4連接成分體積片段雙酶切產(chǎn)物(50ng/ul) 3ul載體雙酶切產(chǎn)物(400ng/ul)0.3ul10×ligase Buffer 0.5ulT4DNAligase(6U/ul) 0.5uldd H2O 0.7ul總體積 5ul16℃連接 16hr。
1.5電轉(zhuǎn)化以參數(shù)電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω進行電轉(zhuǎn)化，將1μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，37℃，250rpm于LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)1hr，涂平板1.6菌落PCR鑒定在長有菌落的LB(Amp)平板上分別挑取多個菌落作PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系與上述PCR的體系相同。
1.7質(zhì)粒提取將經(jīng)PCR鑒定陽性克隆質(zhì)粒hCGI-143-pcDNA3.1，采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)試劑盒抽提。所得質(zhì)粒經(jīng)核酸測序驗證插入片段正確(由申友公司完成)。
2.Western blotting驗證hCGI-143基因的分泌特性2.1轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞1)鋪細(xì)胞預(yù)熱DMEM(無血清，無抗生素)培養(yǎng)基和胰酶(0.1％trypsin)，37℃；CHO細(xì)胞接種密度是1-1.5×105/35mm培養(yǎng)皿；37℃，5％CO2培養(yǎng)5-24小時，使細(xì)胞貼壁；2)鋪轉(zhuǎn)染A質(zhì)粒用量1～2ug，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；B脂質(zhì)體Lipofectamine(GibcoBRL公司)3ul-5ul，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；A+B，混勻，室溫靜置15-45min，一般30min；培養(yǎng)細(xì)胞去上清，用DMEM(無血清，無抗生素)洗一次，加800ul DMEM(無血清，無抗生素)，滴入轉(zhuǎn)染混合液，搖勻；如細(xì)胞貼壁性不好或不耐受無血清培養(yǎng)液，可用完全培養(yǎng)基；37℃，5％CO2培養(yǎng)5-24小時，換液為DMEM(10％FCS)，繼續(xù)培養(yǎng)至總轉(zhuǎn)染時間為48-72小時。
2.2Western Blotting1)樣品處理上清處理收集細(xì)胞培養(yǎng)盤中的上清，13000rpm，8min。收集離心上清，取200ul純化。
細(xì)胞處理用PBS(pH7.4)2ml洗盤中細(xì)胞兩次，加200ul裂解緩沖液，冰上20分鐘裂解。然后刮下細(xì)胞，將裂解液于4℃離心12000rpm，8min，回收上清，進行純化。
TALON樹脂預(yù)處理將1體積的TALON樹脂貯存液于5000rpm離心5分鐘，去上清，用1×E/W緩沖液洗兩次，然后加等體積的1×E/W緩沖液得到50％的樹脂混合液。
樣品純化在樣品中加入適量的預(yù)處理過的50％Slurry，加入800ul1×E/W緩沖液，4℃結(jié)合2小時。8000rpm離心5分鐘去上清，用1×E/W緩沖液洗3-4次，去除非特異結(jié)合的蛋白。
2)蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜常規(guī)蛋白電泳分離樣品；15％分離膠，60V 30min，160V 1hr20min。
PVDF膜用甲醇浸濕10min，去離子水沖洗，再轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20分鐘；電泳膠置轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡20分鐘；厚紙墊板也置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。
按下列順序放置轉(zhuǎn)膜儀負(fù)極—墊板—電泳膠—PVDF膜—墊板—正極。
轉(zhuǎn)膜半小時，電壓15伏。
3)膜的封閉3％脫脂牛奶&2％BSA/PBST 50ml，水平搖床，室溫封閉4小時；也可以先室溫封閉若干時間，再放入4℃冰箱，過夜；4)一抗(鼠抗人C-Myc 9E10)用封閉液稀釋一抗，鼠抗人C-myc 9E10(200ng/ul)稀釋倍數(shù)1000倍；將膜完全沒于一抗稀釋液中。水平搖床，室溫2小時，也可過夜。
5)洗滌先用PBST短暫地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗10分鐘；3*10分鐘，室溫洗滌；6)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)用封閉液稀釋二抗，10000倍稀釋；水平搖床，室溫2小時；7)洗滌先用PBST短暫地洗2次；用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗10分鐘；3*10分鐘，室溫洗滌；8)檢測將檢測試劑(ECL plus)從4℃取出，在打開前平衡至室溫；將檢測試劑的A液與B液以40∶1的比例混合，檢測試劑的用量為0.1ml/cm2；膜置于吸水紙上干燥，蛋白面朝上，檢測試劑加在膜上，覆蓋整個膜表面；室溫2分鐘；用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸干多余的檢測試劑；膜用保鮮膜封起，暗室曝光，時間10秒；先用10秒時間多壓幾張，再延長時間壓一張或幾張，延長時間壓片的時候，洗最先壓的片子。結(jié)果見圖8。
實施例3人hCGI-143基因的組織表達譜1.電子Northern表達譜搜索genecard網(wǎng)站http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/，分別得到hCGI-143芯片雜交的表達譜與電子Northern表達譜，見圖9與圖10。
搜索SOURCEhttp//genome-www5.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch，得到unigene的表達信息。
結(jié)果表明hCGI-143在新生胎兒的胰腺中高量表達。
2.Northern印跡材料和試劑隨機引物標(biāo)記試劑盒(random primer DNA labeling kit)購自寶生物工程(大連)有限公司)人類多組織RNA印跡膜和快速雜交液(ExpressHyb hybridization solution)均購自Clontech公司20×SSC(PH＝7.0)NaCl 175.32g檸檬酸鈉88.23g，同位素P32購自PE公司。
洗膜溶液I(wash solution I)2×SSC；0.05％SDS；加水到1000ml20×SSC--------100ml20％SDS--------2.5ml加水到1000ml洗膜溶液II(wash solution II)0.1×SSC；0.1％SDS；加水到1000ml20×SSC--------5ml20％SDS--------5ml加水到1000ml方法步驟(1)雜交膜的預(yù)處理(第一次所用的膜不需要這樣的高溫去探針處理，第二、三次再用同一塊膜時才用此法，第一次僅用膜于2×SSC浸泡10分鐘)在0.5％SDS溶液中處理印跡膜100℃10min，從加熱爐上取下來，室溫冷卻10min。
(2)預(yù)雜交(prehybridization)68℃預(yù)熱ExpressHyb solution。
將膜放入2×SSC中，浸泡10分鐘左右。把濕潤好的膜貼雜交管管壁輕輕移入，避免產(chǎn)生氣泡。
變性sperm DNA(100℃水浴5min，立即放入冰中，5min)。5ml ExpressHyb+50μl spermDNA于15ml管子中充分混勻，然后再倒入雜交管中。
雜交爐中，68℃，10rpm/min，大于2小時。
(3)標(biāo)記探針(labeling primer)探針是cDNA，PCR，切膠，純化cDNA片斷，形成模板。
隨機引物標(biāo)記采用標(biāo)記試劑盒，操作如表3。
表3


加EDTA終止反應(yīng)(終濃度30mM)室溫，1min。附0.5M EDTA用量在1.5-3.0μl。
(4)純化探針，用G25(或G50)柱子，原理凝膠過濾柱子平衡混勻柱子中的平衡液，掰掉柱子的封閉端，將柱子置于一新的離心管中，3000rpm，2min。倒掉平衡液在室內(nèi)的自來水池中，3000rpm，再離心1min。
柱子置于一新的離心管中，加入標(biāo)記好的探針液，3000rpm，2min，收集探針于1.5ml離心管中。從而去除掉未標(biāo)記的[α-32P]dCTP，小片斷(小于300bp)，留下較大片斷約500bp。
(5)雜交純化后的探針應(yīng)立即變性100℃，5分鐘，立即冰上5分鐘。
把收集后的探針(25μl左右)加入到雜交管中的預(yù)雜交液中，切記勿將探針直接加到膜上，輕輕混勻，把雜交管再移入雜交爐中。68℃，2hours，10rpm.
(6)洗膜低嚴(yán)緊度洗膜室溫，SDS 0.05％(wash solution I)A把雜交液倒入廢液缸中，用wash solution I洗膜1次(3×50ml)，全部倒入廢液缸中，再快速洗二次，廢液均倒入廢液缸中。
B室溫，40min，3×50ml，continuous agitation，洗液用自來水沖盡。
高嚴(yán)緊度洗膜50℃，SDS 0.1％(wash solution II)洗液用自來水沖盡。50℃，每次40min，于搖床中洗，換液5次。
注意在洗膜的過程中，要經(jīng)常測一測同位素含量，只要劑量達到300左右或以下，就可以停止洗膜。
(6)封膜，壓片(保證膜在整個實驗過程中都是濕潤的)，用保鮮膜封膜，盡量無氣泡，以保證膜處在濕潤狀態(tài)。膜放于磷屏上。(注意磷屏要事先消磁半小時)，壓12小時左右即可。電腦掃描信號，使用的程序是arraytool-MCD-scan control.
采用Clontech公司的人類多組織RNA印跡膜對該基因的組織分布進行研究。該印跡膜含12種組織，腦、心、骨骼肌、結(jié)腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺、外周血白細(xì)胞。
結(jié)果見圖11。
實施例41hCGI-143蛋白的亞細(xì)胞定位1.1原理及目的將帶有外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染單層培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，外源基因以融合或非融合的形式在細(xì)胞中表達，用針對融合或非融合蛋白的抗體處理細(xì)胞，再用FITC標(biāo)記的二抗處理，隨后在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)結(jié)合有熒光二抗的部分會在單色光的激發(fā)下，發(fā)出熒光，從而可以判斷表達的蛋白在細(xì)胞中的分布。
1.2材料及試劑COS-7細(xì)胞或Hela細(xì)胞，100×PLA(多聚賴氨酸)一抗Tag抗體(mouse-anti-human c-myc 9E10)或特異抗體，1∶50-1∶200稀釋(PBS/5％BSA)，二抗FITC-goat-anti-mouse IgG，驢抗兔CyTM2IgG，1∶50稀釋(PBS/5％BSA)PBS(pH7.4)、BSA、Tween-20、Tritonx-100、8％PFA(多聚甲醛)無色指甲油、固定液(mounting solution sigma)35mm dish、蓋玻片(corninglabware&equipment 22mm seq.)蠟筆(pappen polysciences co.)1.3方法步驟(1)鋪細(xì)胞蓋玻片可浸在酒精中，用時在酒精燈上燒去乙醇，鋪在35mm培養(yǎng)皿中，加入2ml 1×PLL(H2O)稀釋，(可以先在每個dish中加入無菌水980ul，再加入20ul 100×PLA)，放37℃培養(yǎng)箱，30min；35mm培養(yǎng)皿用無菌水洗2次；接種細(xì)胞，對于COS-7，接種密度為1.0-1.5×105/35mm培養(yǎng)皿；37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜。
(2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染2ug pcDNA3.1A-hCGI-143質(zhì)粒(3)熒光抗體染色轉(zhuǎn)染48-60h后，取出培養(yǎng)皿，置冰上5min，用PBS(pH7.4)洗2次，每次2ml；加入2％PFA(w/v)/0.1％Triton-X-100/PBS 1ml，冰上30min固定；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；Blocking，PBS/5％BSA，1ml/dish，室溫，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2(可省略)；吸去dish中的洗滌液，用鑷子取出蓋玻片，有細(xì)胞的一面朝上，放在吸水紙上；用蠟筆沿蓋玻片的四周劃一個方框，并沿玻片的中心線劃一條線，使左右兩半大小相當(dāng)；擦干原dish，將蓋玻片放回，玻片的一半加40-50ul PBS/5％BSA，另一半加一抗稀釋液；置濕盒內(nèi)，4℃，過夜，或4℃，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；玻片的兩半都加二抗稀釋液，4℃，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；取干凈的載玻片一塊，作上標(biāo)記，滴一滴mounting solution，約15-20ul；用鑷子取出蓋玻片，邊緣搭在紙巾上吸去多余液體，細(xì)胞面朝下，貼在載玻片上，不要有氣泡；蓋玻片的邊緣四周刷上無色指甲油，待干；擦去蓋玻片上表面析出的PBS鹽份(optional)；避光保存在干燥的容器內(nèi)。
免疫熒光顯示hCGI-143蛋白分布在除細(xì)胞核以外的細(xì)胞質(zhì)中(圖12)。
2.hCGI-143蛋白的分泌途徑分泌蛋白的一般分泌途徑有兩種經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器然后分泌；不經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器，直接分泌。為分析hCGI-143蛋白的分泌途徑，將pcDNA3.1-hCGI-143-Myc和pEYFP-Golgi(Clontech)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到CHO細(xì)胞中，進行熒光共定位分析(圖13)(方法同上，二抗使用驢抗兔CyTM5 IgG)。pEYFP-Golgi質(zhì)粒有高爾基細(xì)胞器膜定位信號，使表達的融合蛋白定位在高爾基體上，通過共聚焦熒光顯微鏡分析判斷hCGI-143蛋白是否定位在高爾基體內(nèi)。A圖表示pEYFP-Golgi的YFP融合蛋白的細(xì)胞定位情況(綠色)，B圖表示標(biāo)有Cy5的二抗對目的基因的亞細(xì)胞定位的檢測(紅色)，C圖表示A與B圖的重疊。在C圖中黃色表示A、B圖中的蛋白共定位。如圖所示hGH，P28分別做為陽性和陰性對照。P28蛋白已知定位于細(xì)胞核內(nèi)，沒有黃色顯現(xiàn)，人生長激素(hGH)是通過高爾基細(xì)胞器分泌的分泌蛋白。所以hCGI-143蛋白的確部分定位在高爾基體內(nèi)，說明hCGI-143蛋白的分泌途徑是典型的或是依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基細(xì)胞器的分泌。
實施例5人hCGI-143基因原核細(xì)胞表達和純化在該實施例中，將全長的人HCGI-143編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1基因片段的克隆1.1材料表達載體pGEX-5x-1Pharmacia公司產(chǎn)品，全長4969bp，為含谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(glutathione S-transferase，GST)的融合表達載體。含Ptac啟動子，氨芐青霉素抗性，GST后接多克隆位點，含三個讀框的終止碼，GST與目的基因之間有Factor Xa識別位點。
合成引物正向引物GGGAATTCCCGGTGGAGGCCGCC(SEQ ID NO.5) 酶切位點EcoRI反向引物CCCCTCGAGTCAGGGGGTTCCTAGAGTTTTC(SEQ ID NO.6) 酶切位點XhoI以上引物均由上海申友公司合成菌株E.coli DH5α1.2方法直接以先前構(gòu)建的pcDNA3.1A-HCGI-143質(zhì)粒為模板，設(shè)計合適引物擴增基因片段，設(shè)計引物時使擴增出的片段去掉編碼信號肽的一段。這樣通過原核細(xì)胞表達出的蛋白才與真核細(xì)胞中分泌到胞外的蛋白相同。終止密碼子采用基因本身的終止密碼子。
(1)PCR反應(yīng)采用相應(yīng)引物根據(jù)下列組分進行PCR反應(yīng)成分體積10×PCR Buffer 5ulpcDNA3.1A-HCGI-143質(zhì)粒模板 0.2ulPrimer(Forward，10pmol) 1ulPrimer(Reverse，10pmol) 1uldNTP Mix(10mM of each dNTP) 1ulpfu DNA polymerase(5U/ul) 1ulddH2O 40.8ul總體積 50ul94℃3min；94℃變性30s，54℃退火40sec，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃總延伸7min。
(2)膠回收采用QIAGEN公司的Gel Extraction Kit參照操作手冊割膠回收。
(3)酶切載體片段和擴增片段根據(jù)下列組分進行酶切反應(yīng)成分 體積基因片段的回收產(chǎn)物(1ug) 16ul10×NEB Buffer 3 32ulNotI(10U/ul) 1ulEcoRI(12U/ul) 1ul總體積20ul37℃酶切12hr，70℃熱失活 15min(4)連接酶切好的載體和擴增片段根據(jù)下列組分進行連接反應(yīng)成分 體積pGEX-5x-1DNA(250ng/ul) 0.5ul插入片段(50ng/ul) 2ul10×連接buffer 1ulT4 DNA連接酶(6U/ul)1ulddH2O 0.5ul總體積 5ul16℃連接12hr。
(5)轉(zhuǎn)化參見分子克隆實驗指南(6)菌落的PCR鑒定在長有菌落的LB(Amp)平板上分別挑取多個菌落作PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系與上述PCR的體系相同。
(7)質(zhì)粒小抽采用VIOGENE公司的Plasmid DNA Miniprep System(Mini-M)參照產(chǎn)品操作手冊抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒測序，插入片段正確。
2hCGI-143蛋白的原核表達和純化2.1材料Glutathione Sepharose 4B購買自Pharmacia公司；Factor Xa購買自Pharmacia公司；E.coli BL21；上述構(gòu)建好的pGEX5x-HCGI-143質(zhì)粒。
2.2方法(1)小量表達構(gòu)建的表達菌種接種于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的飽和菌1∶50接種于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6。不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)3-5hr。8000rpm離心10min，去上清，加500ml1×PBS，重懸菌體。取出20ul走SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
(2)大量表達及樣品處理根據(jù)小量表達的條件放大，菌體重懸。加入1M DTT至最終濃度為5mM，PMSF至最終濃度為100ug/ml。冰浴超聲裂解細(xì)胞成勻漿。加20％Triton X-100至終濃度1％，冰浴30min。12000rpm離心10min，分裝上清，-20℃儲存。
(3)純化將凍存細(xì)胞上清13000rpm，4℃，離心10分鐘，取上清。加入適量50％GlutathioneSepharose 4B Slurry，4℃搖動混勻2hr。Glutathione Sepharose 4B的預(yù)處理方法見該試劑盒的操作手冊。3000rpm離心5分鐘，去上清，重懸于PBS中，重復(fù)洗滌四次，上柱。用PBS洗滌至所測OD值接近空白對照PBS。換用GST Elution buffer洗脫，測每一收集管的OD值收集洗脫后的蛋白，裝入透析帶透析，期間適當(dāng)換透析液1×PBS。透析后收集袋內(nèi)液體，測蛋白濃度，并用蛋白電泳檢測，蛋白電泳結(jié)果見圖14。
3hCGI-143蛋白的抗體制備和純化3.1材料Protein A Sepharose CL-4B購自Pharmacia公司3.2方法(1)所得蛋白免疫兔子，制多克隆抗體。
此部分工作由上海生物工程中心動物房完成(2)收集的免疫后兔子血離心收集上清，得到抗血清，Western檢測所得抗體的效果和特異性。
(3)用Protein A Sepharose CL-4B純化所得抗血清，并用結(jié)合有GST蛋白的GlutathioneSepharose 4B出去其中的抗GST抗體。
預(yù)處理Protein A Sepharose CL-4B，見產(chǎn)品說明；用Wash/binding buffer(20mM磷酸鈉溶液，150mM NaCl，pH＝7.4)配制50％的Slurry；樣品準(zhǔn)備，血清樣品用Wash/bindingbuffer 1∶1稀釋；將平衡好的50％ Slurry倒入柱子填充，使樹脂在重力作用下自然沉降；用10倍柱體積的Wash/binding buffer平衡柱子；上樣，樣品加至樹脂頂部。流出液重復(fù)上柱三遍；用10倍柱體積的Wash/binding buffer洗，直到280nm的光吸收接近空白；用4倍柱體積的Elution Buffer(100mM Glycine-HCl，pH＝3.0)洗脫，收集流出液，每管200ul，測定280OD值。直至無蛋白洗出；再生柱子，4倍Elution Buffer繼續(xù)洗脫后用Wash/bindingbuffer大量洗。
實施例6CHO hCGI-143蛋白穩(wěn)定表達細(xì)胞株構(gòu)建2μg真核表達質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞(35mm培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)48小時；消化至100mm培養(yǎng)皿，加G418至終濃度1000μg/ml(CHO)培養(yǎng)2-3星期直至有克隆形成；去培養(yǎng)皿內(nèi)的培液，PBS洗兩次，胰酶浸泡過的無菌濾紙片覆蓋于克隆上，消化數(shù)分鐘后轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)；Western blot鑒定表達目的蛋白的克隆。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>一種新的人分泌蛋白hCGI-143<130>NP-1346<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>903<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(102)..(515)<220>
<221>sig_peptide<222>(102)..(161)<220>
<221>polyA_signal<222>(816)..(821)<400>1ccagagtcct ggccctgagc gggaatcgca gtggccgagg ctgagcggca ggcggatcgc 60cccgaccctc actcctggcg tctgagtctc tggcgtagcc c atg ctg agt ggg cgg 116Met Leu Ser Gly Arg1 5ctg gtc ctg ggt ctg gtc tcc atg gct ggc cgc gtt tgt ttg tgc cag 164Leu Val Leu Gly Leu Val Ser Met Ala Gly Arg Val Cys Leu Cys Gln10 15 20ggc agc gcg gga tcc ggg gcc atc ggt ccg gtg gag gcc gcc att cgc 212Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ala Ile Gly Pro Val Glu Ala Ala Ile Arg25 30 35acg aag ttg gag gag gcc ctg agc ccc gag gtg cta gag ctt cgc aac 260
Thr Lys Leu Glu Glu Ala Leu Ser Pro Glu Val Leu Glu Leu Arg Asn40 45 50gag agc ggt ggc cac gcg gtc ccg cct ggc agt gag act cac ttc cgc308Glu Ser Gly Gly His Ala Val Pro Pro Gly Ser Glu Thr His Phe Arg55 60 65gtg gct gtg gtg agc tct cgt ttc gag gga ctg agc ccc cta caa cga356Val Ala Val Val Ser Ser Arg Phe Glu Gly Leu Ser Pro Leu Gln Arg70 75 80 85cac cgg ctg gtc cac gca gcg ctg gcc gag gag ctg gga ggt ccg gtc404His Arg Leu Val His Ala Ala Leu Ala Glu Glu Leu Gly Gly Pro Val90 95 100cat gcg ctg gcc atc cag gca cgg acc ccc gcc cag tgg aga gag aac452His Ala Leu Ala Ile Gln Ala Arg Thr Pro Ala Gln Trp Arg Glu Asn105 110 115tct cag ctg gac act agc ccc cca tgc ctg ggt ggg aac aag aaa act500Ser Gln Leu Asp Thr Ser Pro Pro Cys Leu Gly Gly Asn Lys Lys Thr120 125 130cta gga acc ccc tga accccaagag agggaggacc aggatccgaa tgggctgggt555Leu Gly Thr Pro135gagcacgaat taccgaggcc ttccctttga tacagtccag gatttgtaag ggatgaagac 615ccctgggccc cattctgttg gggtccatac atactctccg aagatagcaa cttgcttcag 675gtcaaagtga acccgagaaa agagaagaat cactcactac tgctcttgcc ctggactatt 735caggaagggc agcccggatg ttccatgtta aatcgtgaca gaattgcacc agacctgatg 795agttggaaac aatcctatac attaaaagaa attacactat gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 855aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 903<210>2<211>137<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2
Met Leu Ser Gly Arg Leu Val Leu Gly Leu Val Ser Met Ala Gly Arg1 5 10 15Val Cys Leu Cys Gln Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ala Ile Gly Pro Val20 25 30Glu Ala Ala Ile Arg Thr Lys Leu Glu Glu Ala Leu Ser Pro Glu Val35 40 45Leu Glu Leu Arg Asn Glu Ser Gly Gly His Ala Val Pro Pro Gly Ser50 55 60Glu Thr His Phe Arg Val Ala Val Val Ser Ser Arg Phe Glu Gly Leu65 70 75 80Ser Pro Leu Gln Arg His Arg Leu Val His Ala Ala Leu Ala Glu Glu85 90 95Leu Gly Gly Pro Val His Ala Leu Ala Ile Gln Ala Arg Thr Pro Ala100 105 110Gln Trp Arg Glu Asn Ser Gln Leu Asp Thr Ser Pro Pro Cys Leu Gly115 120 125Gly Asn Lys Lys Thr Leu Gly Thr Pro130 135<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>3gggctcgaga tgctgagtgg gcggct26<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gcgaattcgg gggttcctag agttttcttg30<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5gggaattccc ggtggaggcc gcc 23<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6cccctcgagt cagggggttc ctagagtttt c 3權(quán)利要求
1.一種分離的人分泌蛋白hCGI-143，其特征在于，所述分泌蛋白包含與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的人分泌蛋白hCGI-143，其特征在于，所述分泌蛋白含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
3.一種制備權(quán)利要求1的分離的人分泌蛋白hCGI-143的方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟(a)將編碼具有人分泌蛋白hCGI-143活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成hCGI-143蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸102-515位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hCGI-143蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達hCGI-143蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hCGI-143蛋白活性的多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的一種制備人分泌蛋白hCGI-143的方法，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸102-515位的核苷酸。
5.一種抗體，其特征在于，所述抗體是能與權(quán)利要求1所述的人分泌蛋白hCGI-143多肽特異性結(jié)合的抗體。
6.一種含有權(quán)利要求1的人分泌蛋白hCGI-143的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類新的分泌蛋白hCGI－143。本發(fā)明的分泌蛋白是一種功能非常重要的蛋白，在多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、凋亡、細(xì)胞通訊、信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。該分泌蛋白具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/12GK1721438SQ200410052848
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月14日
發(fā)明者周宇波, 朱智東, 朱弘, 黃健, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心