專利名稱：一種豬眼肌面積性狀相關蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種豬眼肌面積性狀相關蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及一種豬眼肌面積性狀相關蛋白及其編碼基因與利用該基因檢測豬眼肌面積的方法。
背景技術：
中國是養(yǎng)豬大國，也是豬種資源最豐富的國家，很早就開始將野豬馴化為家豬。經過長期選擇，形成了許多各具特色的地方品種，僅《中國豬品種記》(張仲葛主編，中國地方豬品種志，上海科技出版社，1986)記載的就有48個。與國外的商品豬相比，中國地方品種具有許多突出的優(yōu)點肉質好，產仔數(shù)高，抗逆性好和適應性強等，但卻有著兩個共同的缺點瘦肉率低和增重慢。因此，增加胴體瘦肉率和提高生長速度一直是我國家豬的遺傳改良工作的主要目標。
產肉性狀主要包括以下幾個方面1)飼料轉化率和日增重；2)胴體各組分的度量值，如背膘厚度、眼肌面積、胴體長、小腸長度以及各種內臟重等；3)胴體各組成的重量百分比，如屠宰率、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率和內脂率等。
產肉性狀屬于數(shù)量性狀，由多基因控制、并存在主基因(major gene)效應。在產肉性狀中，大多性狀表現(xiàn)晚且不便活體測量，采用常規(guī)育種方法對其進行選擇周期長，收效慢。分子生物學技術的發(fā)展，使人們可以在DNA水平尋找控制產肉性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標記，在育種過程中用于標記輔助選擇(markerassisted selection，MAS)，以便提高選擇進展，更好地改善豬肉品質，滿足人們的需要，同時獲得較大的經濟效益。
目前，通過候選基因法，已經找到了一些影響豬產肉性狀的基因。位于豬12號染色體上的生長激素基因(Growth Hormon，GH)是神經分泌內生長軸中調控動物生長發(fā)育的核心基因，其產物生長激素具有調節(jié)新陳代謝、促進生長發(fā)育等作用，是與豬的生長和胴體性狀相關的主要候選基因，中外學者對它的基因型與生產性狀的關系進行了廣泛的研究。Knorr等(Knorr C，Moser G，Muller E，Geldermann H.Associations of GH gene variants with performance traits in F2 generationsof European wild boar，Pietrain and Meishan pigs.Anim Genet，1997，28124-128.)發(fā)現(xiàn)梅山豬與皮特蘭豬雜交的F2代群體中，不同的GH基因型與8個胴體性狀顯著相關。李加琪等(李加琪，陳贊謀，劉德武，劉小紅，孫寶麗，凌飛，張豪，陳瑤生.IFG-1基因對長白×藍塘豬資源群生產性能的遺傳效應分析。遺傳學報，2003，30(9)835-839)發(fā)現(xiàn)在長白×藍塘豬構建的資源群體中類胰島素生長因子1(Insulin-like growth factor I，IGF-I)不同基因型對斷奶后日增重、骨率、胴體瘦肉量和皮脂率等性狀有顯著影響。劉桂蘭等(劉桂蘭，蔣思文，熊遠著，鄭嶸，屈彥純.IGF2基因PCR-RFLP多態(tài)性與脂肪沉積相關性狀的關聯(lián)分析。遺傳學報，2003，30(12)1107-1112)分析了類胰島素生長因子2(Insulin-like growth factorII，IGF-II)基因第8內含子兩個NciI酶切位點的多態(tài)性在大白豬×梅山豬構成的F2代中的多態(tài)性分布情況，發(fā)現(xiàn)B位點B1B1基因型的個體顯著比B2B2基因型的個體背膘薄18.28％(P＜0.01)，瘦肉率高8.71％(P＜0.01)。垂體轉錄因子(Pituitantranscription factor 1，PIT1)是生長激素、催乳素和促甲狀腺素重要的調節(jié)因子，Yu等(Yu TP，Tuggle CK，Schmitz CB，Rothschild MF.Association of PIT1polymorphisms with growth and carcass traits in pigs.J Anim Sci，1995，731282-1288)曾報道PIT1與平均背膘厚存在顯著相關，近年來Kuryl等(Kuryl J，Pierzchala M.Association of POU1F1/RsaI genotypes with carcass traits inpigs.J Appl Genet，2001，42309-316.)和Brunsch等(Brunsch C，SternsteinI，Reinecke P，Bieniek J.Analysis of associations of PIT1 genotypes withgrowth，meat quality and carcass composition traits in pigs.J Appl Genet，2002，4385-91)分別在不同的資源家系中檢測到PIT1與數(shù)種胴體性狀相關。其它與胴體性狀相關的候選基因還包括生長激素釋放素(GHRH)、瘦素(Leptin)、生長素(Ghrelin)、肌細胞生成素(Myogenin)、生長激素抑制素(somatostatin，SS)、黑素皮質激素受體4(Melanocortin-4，MC4R)和生長素受體(growth hormonereceptor，GHR)(Xia，et al.，2003)、MSTN(Jiang YL，Li N，Plastow G，Liu ZL，Hu XX，Wu CX.Identification of three SNPs in the porcine myostatin gene(MSTN).Anim Biotechnol，2002，13173-178)等基因。位于18號染色體上的瘦素基因(Leptin)被認為是與生長、胴體性狀相關的一個基因(Sasaki S，Clutter AC，PompD.Assignment of the porcine obese(leptin)gene to chromosome 18by linkageanalysis of a new PCR-based polymorphism.Mamm Genome，1996，7471-472)，但Jiang等(Jiang ZH，Gibson JP.Genetic polymorphisms in the leptin gene andtheir association with fatness in four pig breeds.Mamm Genome，1999，10191-193)的研究卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯的關聯(lián)。位于豬9號染色體上的肌細胞生成素(Myogenin)是MyoD基因家族的成員，主要功能是調節(jié)成肌細胞分化為肌纖維。TePas等(Te Pas MF，Soumillion A，Harders FL，Verburg FJ，van den Bosch TJ，Galesloot P，Meuwissen TH.Influences of myogenin genotypes on birth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.JAnim Sci，1999，772352-2356.)在兩個大白豬群中檢測了該基因的多態(tài)性，分析發(fā)現(xiàn)不同基因型的個體在出生重、生長速度和瘦肉量等性狀上有顯著差異。對兩個選擇系肌肉的MyoD基因家族成員mRNA表達水平比較發(fā)現(xiàn)F-系(選擇生長速度)中myogenin、myf-5、MyoD1的mRNA表達水平比L-系(選擇瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚與成肌細胞的表達成負相關(Te Pas MF，Verburg FJ，Gerritsen CL，de GreefKH.Messenger ribonucleic acid expression of the MyoD gene family in muscletissue at slaughter in relation to selection for porcine growth rate.J AnimSci，2000，7869-77)。Kim等(Kim KS，Larsen N，Short T，Plastow G，RothschildMF.A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)geneis associated with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome，2000，11131-135)在5個豬商品系中檢測到MC4R基因遺傳變異與背膘厚顯著相關。劉桂蘭等(劉桂蘭，蔣思文，熊遠著，鄭嶸，屈彥純.豬資源家系MC4R基因掃描及其與脂肪性狀的相關分析。遺傳學報，2002，29(6)497-501)對大白×梅山的F2代174個體檢測發(fā)現(xiàn)MC4R基因多態(tài)性與豬胸腰椎間膘厚(P＜0.05)、臀部膘厚(P＜0.02)、平均背膘厚(P＜0.04)、眼肌寬度(P＜0.003)、眼肌面積(P＜0.05)、皮率(P＜0.02)呈顯著相關。
采用基因組掃描法，研究者們還定位了一些影響胴體性狀的數(shù)量性狀位點(QTL)。影響背膘厚的主基因被定位于第2和7號染色體上(de Koning DJ，JanssLL，Rattink AP，van Oers PA，de Vries BJ，Groenen MA，van der Poel JJ，etal.Detection of quantitative trait loci for backfat thickness andintramuscular fat content in pigs(Sus scrofa).Genetics，1999，1521679-1690)。Paszek等(Paszek AA，Wilkie PJ，F(xiàn)lickinger GH，Miller LM，LouisCF，Rohrer GA，Alexander LJ，Beattie CW，Schook LB.Interval mapping ofcarcass and meat quality traits in a divergent swine cross.Anim Biotechnol，2001，12155-165)利用119個分子標記對116個F2個體的胴體和肉質性狀進行分析后發(fā)現(xiàn)在豬12號染色體上存在影響胴體長、第10肋骨背膘厚、平均背膘厚、板油率、眼肌面積和肌內脂肪含量等多個性狀的QTL。最近，Clop等(Clop A，Ovilo C，Perez-Enciso M，Cercos A，Tomas A，F(xiàn)ernandez A，Coll A，et al.Detection ofQTL affecting fatty acid composition in the pig.Mamm Genome，2003，14650-656)對伊比利亞豬與長白豬構建的F2進行基因組掃描，發(fā)現(xiàn)12號染色體上存在影響不飽和脂肪酸(亞麻酸)含量的QTL。Yue(Yue G，Schroffel JR，Moser G，Bartenschlager H，Reiner G，Geldermann H.Linkage and QTL mapping for Susscrofa chromosome 12.Journal of Animal Breeding and Genetics，2003，12095-102)等以野豬、梅山豬和皮特蘭構成的三個F2群體為研究對象，在12號染色體上發(fā)現(xiàn)了數(shù)個影響13-14肋骨間的背膘厚、瘦肉切割率等性狀的QTL。據(jù)統(tǒng)計，除了SSC16和SSC17外，豬的所有染色體上均發(fā)現(xiàn)了影響背膘厚的QTL(Bidanel JP，Rothschild MF.Current status of quantitative trait locus mapping in pigs.pig news and information，2002，2339N-53N)。
SDHD(Succinate Dehydrogenase Complex，Subunit D，SDHD)是線粒體復合體II(succinateubiquinone oxidoreductase)的重要組成因子，在三羧酸循環(huán)，糖代謝及氧化呼吸鏈的電子傳遞中具有重要的作用，是線粒體內膜的標志酶之一。線粒體復合體II的亞單位的突變所引發(fā)的遺傳紊亂造成的影響主要包括張力減退、生長遲緩、原發(fā)性心肌癥、肌肉疾病、神經疾病、器官功能障礙、新陳代謝紊亂等，在參與三羧酸循環(huán)代謝的酶類中只有線粒體復合體II的各組成因子是由核基因編碼。并遵循孟德爾遺傳規(guī)律。人SDHD基因位于11號染色體上。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。這種變異可能是轉換(C→T，在其互補鏈上則為G→A)，也可能是顛換(C→A，G→T，C→G，A→T)。轉換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。
SNP檢測方法常采用一些已有的成熟技術，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等，也采用根據(jù)DNA列陣的微測序法、動態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及TaqMan系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進行靶序列的擴增，然后才能進行其它檢測。
發(fā)明創(chuàng)造內容本發(fā)明的目的是提供一種豬眼肌面積性狀相關蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的豬眼肌面積性狀相關蛋白，名稱為豬SDHD基因(SuccinateDehydrogenase Complex，Subunit D，SDHD)，來源于豬，具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列或為將SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經過1-10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與豬眼肌面積性狀相關的由SEQ ID №3衍生的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №3由159個氨基酸殘基組成。
上述豬眼肌面積性狀相關蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述豬眼肌面積性狀相關蛋白的編碼基因，它的cDNA序列具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由1320個堿基組成，該cDNA序列的編碼序列為序列表中序列1的自5′端18位-497位堿基。
含有本發(fā)明的豬眼肌面積性狀相關蛋白編碼基因的載體、細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測豬眼肌面積的方法。
本發(fā)明所提供的檢測豬眼肌面積的方法，是用具有序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列的一對引物對待測豬的總DNA進行PCR擴增，然后對PCR擴增產物進行單核苷酸多態(tài)性檢測，確定自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位堿基為G還是T。
如果PCR擴增產物的單核苷酸多態(tài)性檢測結果是自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位堿基，即自序列表中序列1的5′端第461位堿基為G時，其純合體的基因型為GG；自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位堿基，即自序列表中序列1的5′端第461位堿基為T時，其純合體的基因型為TT；它們的雜合體基因型為GT。
其中，GG基因型個體的眼肌面積極顯著地高于GT基因型和TT基因型的個體。
所述單核苷酸多態(tài)性檢測可采用DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)、根據(jù)DNA列陣的微測序法、動態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及TaqMan系統(tǒng)等進行檢測。
實驗證明，本發(fā)明的豬眼肌面積性狀相關蛋白及其編碼基因可用于檢測豬眼肌面積，為豬的分子育種提供了一個新的遺傳標記，將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。


圖1a為Sfi IA和Sfi IB接頭序列圖1b為pBluescript II SK(-)的物理圖譜圖1c為豬SDHD基因的定位示意2為豬血液基因組總DNA的PCR擴增產物電泳圖譜圖3為PCR擴增產物的測序峰圖具體實施方式
實施例1、豬SDHD的cDNA基因的獲得利用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit和改造的pBluescript II SK克隆載體(pBluescript II SK的改造載體，具體為將pBluescriptII SK(-)的EcoR I和Not I之間的序列改造為Sfi IA和Sfi IB接頭序列，利用Sfi IA和Sfi IB酶切后可定向插入cDNA片斷(Sfi IA→Sfi IB)。Sfi IA和Sfi IB接頭序列和pBluescript II SK(-)的物理圖譜分別如圖1a和圖1b所示)，用豬胚胎發(fā)育第55天的骨骼肌組織的mRNA，按照常規(guī)方法構建了全長cDNA文庫。通過對文庫克隆子的測序獲得了大量的在骨骼肌組織中表達的基因。
利用比較功能基因組學原理和方法，利用BLAST在NCBI的數(shù)據(jù)庫中進行比對發(fā)現(xiàn)了其中測序結果中的一條序列與人SDHD基因具有88％的同源性，將其命名為豬SDHD基因，它具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，其編碼序列表中序列3的氨基酸序列。
通過比較豬，小鼠和人SDHD基因cDNA序列的同源性，根據(jù)豬cDNA序列設計豬特異的引物PrimerL5′-ATTGGACAAGTCGTTACTGA-3′PrimerR5′-CAACTCTCTAGGTATTAGCT-3′。
以RH克隆板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，ImpRH)中的豬×倉鼠雜種體細胞的DNA(購自法國農業(yè)科學院，Laboratoire de GénétiqueCellulaire，INRA)為模板進行PCR擴增。擴增條件為95℃變性3min，94℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s，35個循環(huán)。最后在72℃延伸3min。其中的反應體系組成如表1所示。
表1.PCR的反應體系

擴增片段經2％的瓊脂糖凝膠電泳進行PCR擴增片段分型。其中，陽性結果的為1，陰性結果的為0。結果為0000100100010001000000000010000000001011100000000110000010010010000010001000010011110000110011001010000001110000010010，將該結果提交到IMpRH數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析服務器(http//www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/RH/IMpRH.html/)上進行分析，得到如表2的結果表2. PCR擴增片段分型的分析結果

比較作圖分析結果表明人SDHD基因位于Hsap11號染色體上，該染色體與豬Sscr9號染色體有大區(qū)段的同源片段(圖1c)。
實施例2、豬SDHD的部分DNA序列的單核苷酸多態(tài)性的檢測1、引物設計用豬SDHD基因的全長cDNA(序列1)為信息探針，獲得豬SDHD基因的UniGene編號Ssc.2586。利用DNAStar分析工具分析在該基因的外顯子區(qū)域中的突變位點。根據(jù)豬全長cDNA序列以及分析獲得的突變位點信息設計擴增引物。序列如下正向引物5’-GGGGCATTGGACAAGTCG-3’(序列表中的SEQ ID №4)反向引物5’-GAGCAGAGGCAAGGAGGT-3’(序列表中的SEQ ID №5)2、PCR擴增及其產物的純化、克隆和測序分別以純繁通城豬62頭、純繁長白豬22頭、長白♂×(大白×通城)♀24頭和大白♂×(長白×通城)♀21頭三元雜交組合豬的豬血液基因組的總DNA為模板進行PCR擴增。其中，反應體系ddH2O(19.25μl)，10×Buffer(含Mg2+)(2.5μl)，10mM正向引物(0.75μl)，10mM反向引物(0.75μl)，10mMdNTP(0.5μl)，Taq聚合酶5U/ul(0.25μl)，總DNA(1μl)。反應體系共為25μl。反應程序采用降落PCR程序(總循環(huán)數(shù)為34)①95℃變性3分鐘；②以退火溫度66℃進行三個循環(huán)的擴增(94℃變性15秒，66℃退火15秒，72℃延伸10秒)；③以退火溫度64℃進行三個循環(huán)的擴增(94℃變性15秒，64℃退火15秒，72℃延伸10秒)；④以退火溫度60℃進行28個循環(huán)的擴增(94℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸10秒)；⑤72℃下延伸3分鐘。PCR擴增產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖2所示，表明獲得的PCR產物大小約為200bp左右。圖2中，Marker為DNA分子量標記(100-1000bp ladder)；2-3泳道為通城豬，4-5泳道為長白豬，6泳道為杜洛克豬血液基因組的總DNA的PCR擴增產物。然后按照如下方法進行PCR產物的純化、克隆和測序(1)PCR產物的純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產物純化試劑盒(Promega)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟是在每300μl融化的凝膠中加入1ml樹脂(Resin)，混勻20s，將Resin/DNA混合物裝入注射器，使?jié){液通過微柱(Minicolumn)擠出。再在注射器中加入80％的異丙醇2ml，輕推活塞使異丙醇通過Minicolumn擠出，取下Minicolumn裝入1.5ml Ependorff管中，10,000g離心2min以干燥Resin，將Minicolumn裝入另一個干凈的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl無菌水，靜置1min，10,000g離心20s，以洗脫DNA存于Ependorff管中。
(2)連接反應將純化的PCR產物與pGEM-T easy載體連接，連接反應總體積是5μl，其中包括2.5μl 2×緩沖液，0.5μl的T載體，1.5μl的純化PCR產物，0.5μl的T4DNA連接酶，置16℃水浴過夜。
(3)感受態(tài)細胞的制備從37℃培養(yǎng)了16-20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，轉接1ml菌液于含有30ml LB的搖瓶中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達到0.3-0.4時將搖瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15min，然后將菌液轉入離心管中于4℃ 4,000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復4℃ 4,000g離心10min一次，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)轉化無菌狀態(tài)下取100-120μl感受態(tài)細胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。
(5)質粒的小量制備挑取平板上的單菌落，接種于2-3ml LB中，37℃ 300r/min培養(yǎng)過夜。用1.5ml EP管12000r/min離心數(shù)秒收集菌體。每管加入100μl用冰預冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))，渦旋振蕩至菌體充分懸浮。加入新配制的溶液II
200μl，快速顛倒混勻，冰浴5min，然后加入預冷的溶液III(5M乙酸鉀，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)150μl，混勻后冰浴5min，12000r/min離心5min，將上清轉至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶異戊醇500μl，渦旋振蕩，離心后小心吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min離心5min，沉淀用70％乙醇洗滌2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
(6)重組質粒的酶切鑒定取3μl質粒DNA與雙蒸水混勻，使其總體積為10μl，加入5U限制性內酶EcoRI及1μl相應的10×限制性內切酶反應緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置37℃水浴1-2小時，取2-3μl反應液于瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到酶切結果與預計完全相同的目的重組質粒。
(7)測序重組質粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進行測序，序列測定由上海博亞生物技術有限公司完成。測序結果表明該PCR產物的長度為220bp，自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位堿基，即自序列表中序列2的5′端第461位堿基處存在T、G兩個等位基因(圖3)。圖3中，箭頭所指的是多態(tài)位點。
實施例3、檢測豬眼肌面積以61頭純繁通城豬、22頭純繁長白豬、24頭長白♂×(大白×通城)♀和21頭大白♂×(長白×通城)♀三元雜交組合豬，共128個個體為實驗對象進行性狀關聯(lián)分析，具體方法如下1、按照實施例2中步驟2的方法，分別以上述129頭豬的豬血液基因組的總DNA為模板，在引物5’-GGGGCATTGGACAAGTCG-3’(正向)(序列表中的SEQ ID №5)和5’-GAGCAGAGGCAAGGAGGT-3’(反向)(序列表中的SEQ ID №6)的引導下進行PCR擴增，對擴增產物進行測序。如測序結果表明自序列表中SEQ ID NO3的5′端第131位堿基，即自序列表中序列2的5′端第461位堿基為G時，其純合體的基因型為GG；自序列表中SEQ ID NO3的5′端第131位堿基，即自序列表中序列2的5′端第461位堿基為T時，其純合體的基因型為TT；它們的雜合體基因型為GT。
2、用如下最小二乘模型分析胴體性狀(屠宰體重，胴體重，屠宰率，瘦肉重，脂肪重，骨重，平均膘厚，眼肌面積)和肉質性狀(肌間脂肪含量，pH值，失水率，大理石紋評分，肉色，滴水損失)yij＝μ+GENOTYPEi+GROUPj+GENOTYPEi×GROUPj+εij，其中，yij是性狀觀察值，μ為總體均數(shù)，GENOTYPEi為基因型效應，GROUPj為不同雜交組合的效應，GENOTYPEi×GROUPj為這兩者的互作效應，εij為隨機誤差，假定服從N(0，σ2)分布。
結果表明在所檢測的群體中，GG基因型的個體有11頭，GT基因型的個體有43頭，TT基因型的個體有74頭。不同基因型之間的性狀顯著差異的結果(最小二乘均數(shù)和標準誤分析)如表3，其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。表3表明，在眼肌面積中，具有GG基因型的個體眼肌面積比GT和TT基因型個體大，并且達到極顯著水平(P＜0.01)；在具有相關趨勢的大理石紋中，GT基因型個體比TT基因型個體評分顯著(P＜0.05)。而且進一步發(fā)現(xiàn)眼肌面積與大理石紋評分呈一定的正相關關系。
表3.豬SDHD基因461位點不同基因型與眼肌面積性狀的關聯(lián)分析

**表示在0.01水平上差異極顯著。
序列表<160>5<210>1<211>1320<212>DNA<213>野豬屬豬(Sus scrofa domestica Brisson)<220>
<221>misc-feature<222>(461)<223>n＝t或g<400>1gagccttcag gaaagacatg gcgactctct ggaggctcag tgttctttgc ggtgcccgag 60gaggaggagc tctggtcctc cggacctcag tggtcagacc tgctcatgtc tcagcatttc120tccaggaccg acataccccg ggatggtgtg gagtacagca cattcacctg tcacccagcc180accaggctag ttccaaggct gcatctctcc actggactgg tgagagggtt gtcagtgttt240tgctcctggg cctacttcca gccgcttatt tgaatccttg ttctgcgatg gactactccc300tggccgcagc cctcactctc catggtcact ggggcattgg acaagtcgtt actgactacg360tgcgagggga tgcactgcag aaagctgcca aggcaggcct tttggcgctc tcggctttca420cctttgctgg gctttgttat ttcaactatc atgatgtggg natctgcaaa gctgttgcca480tgttgtggaa gctctgagct tttagagcta ataccttgag agttgattgt acacctcctt540gcctctgctc tgtcatgcca ttcagctcac agtaagaagg aaataataga taagtccatt600ggtgagacaa acctcttctc ctaatcagtg ggttattttt ggaatttaat ctttgaggaa660agatttgaga ggaatcgtat ccaagaaatt gtgagactga gctctcacaa gactcagtgt720ctctcagctt ttcacgagac tcggtgtaac taagcattac atatgagctt ttgccttttc780atttatcaga cttttaaagg gaattcagct ttattactct cagtatctgc tcacacttct840gtatttgtcc taggatgatg gagaaaggga aagaccatta attcctaagg aaagactttg900tggaagagta ggcagtgttt cgtttttaca gacttcccct ctctgttcag ttgataccag960ttactgatgg ttacatgtcc tggggaaatc agaaaattag aaatgctgat atttcatatt 1020actcatttct aaatcccagg aagaggagcc tggagagttt ctgaataaag agaagttcca 1080tgtagggaag aggtcccatt atagatgttt caagttgtta cagattctaa actgagactt 1140aatcttcaca tgcgtttatt ttacttgttg aaaataatct gtccccaaat ataaaattat 1200
aagtaataag ttgttgtttt cctgctgtgg gatctctaat gtgaaaatgt attctacgaa 1260gataaagttt tttaaaaaaa taaaatgctg tataattaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320<210>2<211>220<212>DNA<213>野豬屬豬(Sus scrofa domestica Brisson)<220>
<221>misc-feature<222>(131)<223>n＝t或g<400>2ggggcattgg acaagtcgtt actgactacg tgcgagggga tgcactgcag aaagctgcca60aggcaggcct tttggcgctc tcggctttca cctttgctgg gctttgttat ttcaactatc 120atgatgtggg natctgcaaa gctgttgcca tgttgtggaa gctctgagct tttagagcta 180ataccttgag agttgattgt acacctcett gcctctgctc 220<210>3<211>159<212>PRT<213>野豬屬豬(Sus scrofa domestica Brisson)<400>3Met Ala Thr Leu Trp Arg Leu Ser Val Leu Cys Gly Ala Arg Gly Gly1 5 10 15Gly Ala Leu Val Leu Arg Thr Ser Val Val Arg Pro Ala His Val Ser20 25 30Ala Phe Leu Gln Asp Arg His Thr Pro Gly Trp Cys Gly Val Gln His35 40 45Ile His Leu Ser Pro Ser His Gln Ala Ser Ser Lys Ala Ala Ser Leu50 55 60His Trp Thr Gly Glu Arg Val Val Ser Val Leu Leu Leu Gly Leu Leu65 70 75 80
Pro Ala Ala Tyr Leu Asn Pro Cys Ser Ala Met Asp Tyr Ser Leu Ala85 90 95Ala Ala Leu Thr Leu His Gly His Trp Gly Ile Gly Gln Val Val Thr100 105 110Asp Tyr Val Arg Gly Asp Ala Leu Gln Lys Ala Ala Lys Ala Gly Leu115 120 125Leu Ala Leu Ser Ala Phe Thr Phe Ala Gly Leu Cys Tyr Phe Asn Tyr130 135 140His Asp Val Gly Ile Cys Lys Ala Val Ala Met Leu Trp Lys Leu145 150 155<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4ggggcattgg acaagtcg 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5gagcagaggc aaggaggt 18
權利要求
1.豬眼肌面積性狀相關蛋白，具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列或為將SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經過1-10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與豬眼肌面積性狀相關的由SEQ ID №3衍生的蛋白質。
2.豬眼肌面積性狀相關蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的基因，其特征在于所述豬眼肌面積性狀相關蛋白的編碼基因的cDNA序列具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的基因，其特征在于所述cDNA序列的編碼序列為序列表中序列1的自5′端18-497位堿基。
5.含有權利要求2-4中任一所述的豬眼肌面積性狀相關蛋白編碼基因的載體。
6.含有權利要求2-4中任一所述的豬眼肌面積性狀相關蛋白編碼基因的細胞系。
7.含有權利要求2-4中任一所述的豬眼肌面積性狀相關蛋白編碼基因的宿主菌。
8.一種檢測豬眼肌面積的方法，是用具有序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列的一對引物對待測豬的總DNA進行PCR擴增，然后對PCR擴增產物進行單核苷酸多態(tài)性檢測，確定自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位堿基為G還是T。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬眼肌面積性狀相關蛋白及其編碼基因與應用，目的是提供一種豬眼肌面積性狀相關蛋白及其編碼基因與利用該基因檢測豬眼肌面積的方法。本發(fā)明所提供的豬眼肌面積性狀相關蛋白，具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列或為將SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經過1－10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與豬眼肌面積性狀相關的由SEQ ID №3衍生的蛋白質。本發(fā)明的豬眼肌面積性狀相關蛋白及其編碼基因將在豬的育種中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N5/10GK1737138SQ20041005692
公開日2006年2月22日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權日2004年8月20日
發(fā)明者朱正茂, 趙書紅, 李奎 申請人:李奎, 趙書紅