專利名稱：γ－氨基丁酸的酶法轉化制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生化制藥技術領域，具體地說是涉及γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法。
二、技術背景γ-氨基丁酸是一種臨床上常用的藥物，它可以降低人體的血氨，治療各種類型的肝昏迷，同時又被廣泛地用于治療各種腦疾病，還可以作為兒童智力的營養(yǎng)補充劑和促進劑，老年人的營養(yǎng)劑。另外，L-天冬氨酸是L-賴氨酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體，作為K+、Mg2+離子載體向心肌輸送電解質，改善心肌功能，它還是新型甜味劑Aspartame的主要原料。
根據目前文獻報導，γ-氨基丁酸的制備方法主要有以下兩種1、酶法1961年，陳志民等(生物化學與生物物理學報，Vol.1，No.2，1961)利用大腸桿菌E1、E2、E3、E4菌株產生的脫羧酶將L-谷氨酸及其鈉鹽脫羧制備得γ-氨基丁酸。1989年，阿諾·舒爾茨等人(中國專利，CN1250101，1989)從E.coli DH-1中分離出一種氨基轉移酶將L-谷氨酸的氨基轉移至琥珀酸半醛得到γ-氨基丁酸。1997年，Darijel等人(RU 2143002，1997)用E.coliVKPM B-7460或B-7452產生的轉氨酶將L-谷氨酸或其鈉鹽轉化為γ-氨基丁酸。2002年，江波等人(中國專利，CN1392262，2002)用乳酸菌或乳酸菌和酵母菌混用產生的脫羧酶將L-谷氨酸或其鈉鹽轉化為γ-氨基丁酸。
2、化學合成法2001年，Abbjasovale等人(RU 2202538，2001)將α-吡咯烷酮和氫氧化鉀作用生成的γ-氨基丁酸鉀鹽轉化為γ-氨基丁酸。
混合氨基酸高效分離技術是現代生物化工領域的一大難題，目前L-谷氨酸和L-天冬氨酸的分離方法主要采用離子交換樹脂法，分離時間長，設備利用率低，成本居高不下。1989年，何炳林等人(離子交換與吸附，1989，5(3)，161-165)采用D371樹脂分離L-谷氨酸和L-天冬氨酸，再用0.1NHAc和0.1NHCl洗脫。1993年，紀慶芳等人(氨基酸雜志，1993，(1)4-7)采用等電點沉淀和離子交換樹脂相結合的方法分離L-谷氨酸和L-天冬氨酸，工藝復雜，得率低，分離不完全。

發(fā)明內容
1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足之處，從而提供一種高效、低成本的制備γ-氨基丁酸的方法，而且能同時生產出L-天冬氨酸。
2、技術方案目前我國氨基酸工業(yè)副產大量的L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物，不能直接用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。本發(fā)明采用L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物作為酶法制備γ-氨基丁酸原料，反應條件溫和，L-谷氨酸脫羧酶專一性強，轉化率高，可以達到分離兩種混合酸性氨基酸的目的，實現了γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸的同時生產。
本發(fā)明利用γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸理化性質的差異，用簡單的等電點結晶方法就可以分離制備L-天冬氨酸，成本低，工藝流程簡單，適合工業(yè)化生產。
本發(fā)明的目的可以通過以下的技術方案來達到一種γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其步驟為(1)埃希氏菌屬E.coli AS1.505菌株，在含有L-谷氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導產生高活力的L-谷氨酸脫羧酶；(2)采用游離細胞法，將含酶細胞和含有L-谷氨酸與L-天冬氨酸混合物的轉化液混合后，再加入緩沖液和表面活性劑，在28-45℃條件下進行酶促反應。
(3)將反應生成物進行分離，得到高純度的γ-氨基丁酸，同時還得到L-天冬氨酸。
上述步驟(1)中的培養(yǎng)基的碳源采用牛肉膏，葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，果糖，乳糖，其濃度為5～20g/L，氮源采用有機氮源，如酵母膏，玉米漿，蛋白棟，豆餅水解液或蛋白質水解物，其濃度為5～50g/L，加入L-谷氨酸誘導，其濃度為0.1～10g/L。
上述步驟(2)的轉化液中L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的比例為5∶95～95∶5，最適比例為30∶70～70∶30，在轉化液中加入醋酸緩沖液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，Macllvaine緩沖液使轉化液pH2～7，最適轉化液pH4～5；在轉化液中加入表面活性劑，如吐溫-80，十六烷三甲基溴化銨(CTAB)，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其濃度為0.005～5％。培養(yǎng)液的L-谷氨酸脫羧酶活性為每小時每克濕細胞轉化1×103～1×105μmol L-谷氨酸。100ml轉化液中濕細胞重量為1～2g，28～45℃反應1～48h。
上述步驟(3)中分離反應體系中的γ-氨基丁酸及L-天冬氨酸的方法是采用等電點結晶法或等電點結晶與離子交換樹脂分離相結合的方法。
3、有益效果本發(fā)明與現有技術相比具有如下優(yōu)點(1)本發(fā)明采用E.coli AS1.505菌株，在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以高產率的生成L-谷氨酸脫羧酶，使反應有高的轉化率和高的反應速率，γ-氨基丁酸及L-天冬氨酸產物的純度為99.3％。
(2)本發(fā)明采用L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物作為制備原料，反應條件溫和，L-谷氨酸脫羧酶專一性強，轉化率高，解決了兩種混合酸性氨基酸高效分離的難題，實現了γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸的同時生產。
(3)γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸的理化性質差異很大，用簡單的等電點方法就可以分離制備，成本低，工藝流程簡單，適合工業(yè)化生產。
(4)具有原料來源豐富，價格低廉，轉化時間短，操作簡便，生產成本低等優(yōu)點。
具體實施例方式
實施例一γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其制備步驟如下
1.將E.coli AS 1.505菌株培養(yǎng)在如下1000mL培養(yǎng)基中蛋白胨1％，NaCl0.5％，牛肉膏0.3％，L-谷氨酸0.1％，pH7.2。35℃搖瓶振蕩培養(yǎng)12h，4000rpm離心15min得濕細胞。
2.將細胞加入到600mL的轉化液中，轉化液含10％的L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物(比例為50∶50)，6mL 0.5％吐溫-80、600mLpH4.8醋酸緩沖液，35℃反應36h。反應液中L-天冬氨酸濃度為5％，γ-氨基丁酸濃度為3.5％，對L-谷氨酸摩爾轉化率為100％。
3.將反應液用6N NaOH調pH5.5，攪拌升溫到60℃，加活性炭脫色除菌體，濾液用5NHCl調pH至2.8，減壓濃縮到120mL，冷卻結晶，析出的結晶過濾后用少量純水洗滌，烘干得25.8g L-天冬氨酸。L-天冬氨酸結晶母液加水稀釋，上JK008陽離子樹脂柱吸附L-天冬氨酸和γ-氨基丁酸，吸附飽和后，用3％的氨水洗脫，收集含有γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸洗脫液(pH6.2)，升溫脫色，減壓濃縮到50mL，加三倍體積95％酒精，攪拌均勻，放冰箱靜置過夜，析出的結晶過濾后用酒精反復洗滌得14.9gγ-氨基丁酸，結晶母液循環(huán)使用。
實施例二γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其制備步驟如下1.將E.coli AS 1.505菌株培養(yǎng)在如下1000mL培養(yǎng)基中蛋白胨1％，NaCl0.5％，牛肉膏0.3％，乳糖1.5％，L-谷氨酸0.1％，pH7.0。35℃搖瓶振蕩培養(yǎng)12h，4000rpm離心15min得濕細胞。
2.將細胞加入到600mL的轉化液中，轉化液含10％的L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物(比例為60∶40)，6mL 0.5％CTAB、600mL pH4.7的Macllvaine緩沖液，35℃反應36h。反應液中L-天冬氨酸濃度為4％，γ-氨基丁酸濃度為4.2％，對L-谷氨酸摩爾轉化率為100％。
3.將反應液用6N NaOH調pH5.5，攪拌升溫到60℃，加活性炭脫色除菌體，濾液用5NHCl調pH至2.8，減壓濃縮到130mL，冷卻結晶，析出的結晶過濾后用少量純水洗滌，烘干得21.3g L-天冬氨酸。L-天冬氨酸結晶母液加水稀釋，用6N NaOH調pH5上D201大孔弱堿樹脂柱吸附L-天冬氨酸，含有γ-氨基丁酸流出液，用5NHCl調pH至6.0，加熱脫色，減壓濃縮到40mL，加三倍體積95％酒精，攪拌均勻，放冰箱靜置過夜，析出的結晶過濾后用酒精洗滌得17.6gγ-氨基丁酸，結晶母液循環(huán)套用。
實施例三γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其制備步驟如下1.將E.coli AS 1.505菌株培養(yǎng)在如下1000mL培養(yǎng)基中玉米漿0.5％，NaCl0.5％，牛肉膏2％，麥芽糖0.5％，L-谷氨酸0.1％，pH7.2。36℃搖瓶振蕩培養(yǎng)12h，4000rpm離心15min得濕細胞。
2.將細胞加入到600mL的轉化液中，轉化液含10％的L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物(比例為40∶60)，6mL 0.5％OP、600mL pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，35℃反應36h。反應液中L-天冬氨酸濃度為6％，γ-氨基丁酸濃度為2.8％，對L-谷氨酸摩爾轉化率為100％。
3.將反應液用6N NaOH調pH5.5，攪拌升溫到60℃，加活性炭脫色除菌體，濾液用5NHCl調pH至2.8，酸化析出的結晶真空過濾，用少量純水洗滌，烘干得27.8g L-天冬氨酸。結晶母液真空減壓濃縮到100mL，冷卻結晶，析出的結晶過濾后用少量純水洗滌，烘干得3.3g L-天冬氨酸，合并得31.1g L-天冬氨酸。L-天冬氨酸結晶母液用6N NaOH調pH至6，減壓濃縮到50mL，加三倍體積95％酒精攪拌均勻，放冰箱靜置過夜，析出的結晶過濾后用酒精反復洗滌得11.3gγ-氨基丁酸。
權利要求
1.一種γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其步驟為(1)埃希氏菌屬E.coli AS1.505菌株，在含有L-谷氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導產生高活力的L-谷氨酸脫羧酶；(2)采用游離細胞法，將含酶細胞和含有L-谷氨酸與L-天冬氨酸混合物的轉化液混合后，再加入緩沖液和表面活性劑，在28-45℃條件下進行酶促反應；(3)將反應生成物進行分離，得到高純度的γ-氨基丁酸，同時還得到L-天冬氨酸。
2.根據權利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(1)所用的培養(yǎng)基碳源采用牛肉膏，葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，果糖，乳糖，其濃度為5～20g/L；氮源采用有機氮源，如酵母膏，玉米漿，蛋白棟，豆餅水解液或蛋白質水解物，其濃度為5～50g/L，加入L-谷氨酸誘導，其濃度為0.1～10g/L。
3.根據權利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)的轉化液中L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的比例為5∶95～95∶5，最適比例為30∶70～70∶30。
4.根據權利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的緩沖液包括醋酸緩沖液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，Macllvaine緩沖液使轉化液pH2～7，最適轉化液pH4～5。
5.根據權利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)所述的表面活性劑包括吐溫-80，十六烷三甲基溴化銨，聚乙二醇辛基苯基醚，其濃度為0.005～5％。
6.根據權利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2)培養(yǎng)液的L-谷氨酸脫羧酶活性為每小時每克濕細胞轉化1×103～1×105μmol L-谷氨酸。
7.根據權利要求1所述的γ-氨基丁酸的酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(3)分離L-天冬氨酸及γ-氨基丁酸的方法為等電點結晶法或等電點結晶與離子交換樹脂分離相結合的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種γ－氨基丁酸的酶法轉化制備方法。該制備方法用L－谷氨酸和L－天冬氨酸兩種混合酸性氨基酸作為原料，將具有高活力L－谷氨酸脫羧酶的埃希氏菌Escherichia.coli AS1.505的菌體細胞與含有L－谷氨酸和L－天冬氨酸混合物的轉化液混合，28－45℃下進行酶促反應，然后用等電點結晶法或等電點結晶與離子交換樹脂相結合的方法分離轉化產物，得到高純度的γ－氨基丁酸和L－天冬氨酸。該方法解決了兩種酸性混合氨基酸高效分離的難題，得到了附加值較高的γ－氨基丁酸，并具有原料價格低廉，操作簡便，轉化時間短，生產成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12P13/00GK1635128SQ20041006481
公開日2005年7月6日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權日2004年9月30日
發(fā)明者焦慶才, 吳曉燕, 李加友, 錢紹松, 陳然 申請人:南京大學