專利名稱：一種蘋果酒的混合酵母發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種蘋果酒的混合酵母發(fā)酵方法，涉及蘋果酒的釀造技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
優(yōu)良蘋果酒酵母應(yīng)該有較高的發(fā)酵效率，不產(chǎn)生明顯的異味，形成必要的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。酵母的較高發(fā)酵效率主要包括較高的發(fā)酵速率和完全的發(fā)酵能力(完全利用蘋果汁中的可發(fā)酵性糖)。
目前應(yīng)用于蘋果酒工業(yè)發(fā)酵的酵母主要是酵母屬酵母(Saccharomyces)。關(guān)于目前使用的酵母的釀造特性，人們認(rèn)為，這些單株酵母屬酵母以及混和酵母屬酵母雖然有較高的發(fā)酵效率，但形成的揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量較少，缺少酯香(Lackingin estery cider character)。
與現(xiàn)代果酒發(fā)酵相比，雖然傳統(tǒng)發(fā)酵的果酒風(fēng)味存在不確定性，發(fā)酵周期長，但傳統(tǒng)發(fā)酵的果酒有濃郁的果香(酯香)。人們認(rèn)為，傳統(tǒng)發(fā)酵的果酒和現(xiàn)代工藝發(fā)酵的果酒香氣上的差異可能主要是由于發(fā)酵果酒的酵母不同?，F(xiàn)代的果酒發(fā)酵趨向于純種酵母屬酵母發(fā)酵。傳統(tǒng)發(fā)酵過程的果酒不添加酵母，也不添加二氧化硫，酵母在發(fā)酵過程中是一個順序生長的過程，當(dāng)乙醇濃度上升至2-4％前，涉及到的是非酵母屬酵母(non-saccharomyces spp.)，當(dāng)乙醇濃度上升至2-4％后，占優(yōu)勢的酵母是酵母屬酵母(Saccharomyces cerevisiae(uvarum))。據(jù)報道，傳統(tǒng)果酒有濃郁的果香可能主要是由于非酵母屬酵母的作用。對果酒香氣風(fēng)味有積極影響的非酵母屬酵母有檸檬形克氏酵母(Kloeckera apiculata)，法爾皮有孢漢生酵母(Hanseniaspora valbyensis)，美極梅氏酵母(Metschnikowia pulcherrima)，但是這些非酵母屬酵母的發(fā)酵效率普遍較低(Quere and Drilleau，1996；Lea，1995；Plata et al，2003；Zohre and Erten，2002)。因此，人們試圖通過非酵母屬酵母和酵母屬酵母混合發(fā)酵增加果酒中的酯香，同時保證用于果酒發(fā)酵的酵母有較高的發(fā)酵效率(Plataet al，2003；Zohre and Erten，2002)，但有關(guān)混合酵母對蘋果酒揮發(fā)性物質(zhì)及發(fā)酵效率的影響未見詳細(xì)的成功報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蘋果酒的混合酵母發(fā)酵方法。若要調(diào)節(jié)蘋果酒的果香、總酯含量、醇酯比，改變酵母屬酵母和非酵母屬酵母均能達(dá)到目的，但由酵母屬酵母改變?yōu)榉墙湍笇俳湍父行АＲ宜?2-苯乙酯是引起我國主要蘋果品種果香產(chǎn)生區(qū)別的重要物質(zhì)。醇酯比是影響蘋果酒果香(酯香)的最重要因素，其次是總酯濃度，其中，醇酯比與果香強(qiáng)度成負(fù)相關(guān)，總酯濃度與果香強(qiáng)度成正相關(guān)；在實(shí)驗(yàn)用酵母中法爾皮有孢漢生酵母醇酯比最低，總酯、乙酸-2-苯乙酯產(chǎn)生量最高，酵母屬酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCTCC M201022的發(fā)酵效率最高。本發(fā)明試圖通過優(yōu)化接種量、蘋果汁營養(yǎng)條件等發(fā)酵參數(shù)，使法爾皮有孢漢生酵母和酵母屬酵母CCTCC M201022的混合酵母發(fā)酵既能降低蘋果酒的醇酯比、增加蘋果酒中的總酯、乙酸-2-苯乙酯產(chǎn)生量，從而增強(qiáng)蘋果酒的果香，又使蘋果酒發(fā)酵有較高的發(fā)酵效率。
本發(fā)明的技術(shù)方案酵母菌株酵母屬酵母(Saccharomyces cerecisiae)CCTCC M201022由本實(shí)驗(yàn)室篩選得到中國專利01127081.0。
法爾皮有孢漢生酵母(Hanseniaspora valbyensis)采用AS 2.1488(見《中國菌種目錄》1992，170頁)，ATCC 10631(《真菌目錄》2000年臺灣版22頁)等。
發(fā)酵方法蘋果酒的發(fā)酵本發(fā)明中用于蘋果酒發(fā)酵的蘋果汁為濃縮蘋果汁稀釋至22.0°Brix的蘋果汁。
A.順序混菌蘋果酒發(fā)酵在1000mL三角瓶中裝入800mL稀釋后的濃縮蘋果汁，稀釋后的濃縮蘋果汁的外觀糖為22°Brix。法爾皮有孢漢生酵母種子和酵母屬酵母種子已在30℃培養(yǎng)48小時。先接種法爾皮有孢漢生酵母，再在發(fā)酵若干天后接種酵母屬酵母菌種CCTCC M201022，在15℃下進(jìn)行發(fā)酵。以后每3天取樣測定發(fā)酵液中的外觀糖、計數(shù)法爾皮有孢漢生酵母和酵母屬酵母數(shù)量，取樣前充分搖勻發(fā)酵液。當(dāng)發(fā)酵液中外觀糖達(dá)到恒定值時，3000rpm離心10min分離發(fā)酵液以除去酵母，測定發(fā)酵液中總糖濃度、醇類酯類物質(zhì)生成量。
B.發(fā)酵效率研究的蘋果酒發(fā)酵所有發(fā)酵均在15℃條件下進(jìn)行。
C.正交試驗(yàn)確定最佳接種量、(NH4)2SO4和VB1濃度，提高混菌酵母發(fā)酵的發(fā)酵效率在11個50mL三角瓶中加入25mL稀釋后的濃縮蘋果汁，該稀釋后的濃縮蘋果汁外觀糖為22°Brix，取其中10個三角瓶接種法爾皮有孢漢生酵母，其中9個三角瓶接種量為1×102、1×104、1×106cfu/mL，每個接種量接種3個三角瓶；另外1個三角瓶接種量為4×106cfu/mL；最后1個三角瓶接種酵母屬酵母，接種量為2×106cfu/mL，作為酵母屬酵母發(fā)酵的對照樣品。發(fā)酵第3天，取9個按1×102、1×104、1×106cfu/mL接種量接種過法爾皮有孢漢生酵母的三角瓶接種酵母屬酵母，并加入(NH4)2SO4和VB1，酵母屬酵母接種量、(NH4)2SO4和VB1加入濃度分別為1×102、1×104、1×106cfu/mL、250、500、750mg/L、0.16、0.4、0.8mg/L。發(fā)酵過程中，每3天取樣測一次外觀糖，至每兩次外觀糖含量之差小于1.0后，每1天取樣測定外觀糖，至24小時發(fā)酵液的外觀糖達(dá)到恒定值時，離心發(fā)酵液，測定總糖濃度。
混合酵母接種時間對發(fā)酵效果的影響非酵母屬酵母法爾皮有孢漢生酵母發(fā)酵后的3天為降糖延滯期，發(fā)酵后的3-18天為快速降糖期，發(fā)酵21天后，外觀糖沒有明顯的降低，進(jìn)入降糖平衡期。所以本發(fā)明選擇法爾皮有孢漢生酵母的發(fā)酵延滯期(發(fā)酵第3天)、快速發(fā)酵中期(發(fā)酵第9天)，快速發(fā)酵后期(發(fā)酵第15天)為酵母屬酵母的加入時間進(jìn)行順序混合酵母發(fā)酵特性研究。
在法爾皮有孢漢生酵母發(fā)酵期的第3、9、15天加入酵母屬酵母，混菌發(fā)酵液中醇酯比分別為2.97、2.32、1.05，分別是純種酵母屬酵母發(fā)酵液的20.96％、16.34％、7.41％；總酯濃度分別為68.12mg/L、80.03mg/L、85.60mg/L，分別是純種酵母屬酵母發(fā)酵液的總酯濃度(23.78mg/L)的2.86、3.37、3.60倍。因此，在不同時間接種酵母屬酵母的混菌發(fā)酵，可以調(diào)節(jié)蘋果酒中香氣物質(zhì)的醇酯比、酯類物質(zhì)濃度，酵母屬酵母加入時間滯后，能夠降低蘋果酒中香氣物質(zhì)的醇酯比、增加蘋果酒中的酯類物濃度，從而增加蘋果酒的酯香。本發(fā)明選擇在發(fā)酵第三天加入酵母屬酵母CCTCC M201022。
混合酵母接種量對發(fā)酵效果的影響在酵母屬酵母接種量相同的條件下，在1×102-1×106cfu/mL范圍內(nèi)增加法爾皮有孢漢生酵母的接種量有利于縮短發(fā)酵時間，接種量最低(1×102cfu/mL)和最高(1×106cfu/mL)均會降低發(fā)酵液中的殘余總糖濃度，但接種量為1×104cfu/mL時，發(fā)酵液中殘余總糖濃度上升，該現(xiàn)象說明，法爾皮有孢漢生酵母對酵母屬酵母的抑制作用與發(fā)酵液中法爾皮有孢漢生酵母的初始濃度有關(guān)，但是，抑制程度不隨發(fā)酵液中法爾皮有孢漢生酵母數(shù)量的增加而增加，有效的混菌發(fā)酵應(yīng)排除使發(fā)酵液中殘?zhí)呛孔罡叩姆柶び墟邼h生酵母接種量(1×104cfu/mL)。本發(fā)明選擇法爾皮有孢漢生酵母接種量為1×102cfu/mL或1×106cfu/mL。
在法爾皮有孢漢生酵母接種量相同的條件下，增加酵母屬酵母的接種量不能縮短發(fā)酵時間，但可以降低發(fā)酵液中殘余總糖含量。所以本發(fā)明選擇酵母屬酵母接種量為1×106cfu/mL～2×106cfu/mL。
蘋果汁所加營養(yǎng)物質(zhì)(NH4)2SO4和VB1對酵母發(fā)酵效率的影響加入(NH4)2SO4和VB1的蘋果酒發(fā)酵，外觀糖達(dá)到恒定值的時間相同，并等于相應(yīng)的對照發(fā)酵樣品，所以，加入(NH4)2SO4和VB1不能提高兩株酵母的發(fā)酵速率。
在法爾皮有孢漢生酵母和酵母屬酵母中，加入(NH4)2SO4的最低總糖殘余濃度分別是22.08g/L、3.62g/L，加入VB1的最低總糖殘余濃度分別是22.85g/L、3.79g/L，即在兩株酵母中，加入(NH4)2SO4的最低殘余總糖濃度均低于加入VB1的最低殘余總糖濃度，說明(NH4)2SO4和VB1兩種因素中，(NH4)2SO4更有利于酵母降低發(fā)酵液中的殘余總糖含量。
加入VB1、(NH4)2SO4的混菌發(fā)酵蘋果酒中殘余總糖濃度為3.17-3.49g/L均在4.0g/L以下，與純種酵母屬酵母的殘余總糖濃度(3.82g/L)接近。明顯低于純種法爾皮有孢漢生酵母的殘余總糖濃度25.45g/L。
CCTCC M201022的接種量增加為2×106cfu/mL時，與法爾皮有孢漢生酵母混菌發(fā)酵過程中，未加入VB1、(NH4)2SO4的樣品和加入VB1、(NH4)2SO4樣品外觀糖達(dá)到恒定值的時間均為21天，因此，在該接種量條件下，VB1、(NH4)2SO4對外觀糖達(dá)到恒定值的時間無明顯影響。但該條件下，能降低發(fā)酵液中殘余總糖含量，從25.45g/L降至24.00g/L。
未加入(NH4)2SO4和VB1的樣品混菌發(fā)酵的發(fā)酵時間和殘?zhí)菨舛确謩e為38天和3.92g/L，發(fā)酵時間長于21天，殘?zhí)呛扛哂谧罡咧?.49g/L，說明在混菌接種量為1×102和2×106cfu/mL的混菌發(fā)酵條件下，同時加入(NH4)2SO4和VB1既能縮短發(fā)酵時間，又能降低發(fā)酵液中的殘余總糖濃度。
影響混合酵母發(fā)酵效率的最佳接種量、(NH4)2SO4和VB1濃度的確定接種量、蘋果汁營養(yǎng)條件均對酵母發(fā)酵效率有顯著影響，所以有必要對這些因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定影響混合酵母發(fā)酵效率的最佳接種量、(NH4)2SO4和VB1濃度。
因素重要性次序?yàn)榻湍笇俳湍附臃N量、法爾皮有孢漢生酵母接種量、(NH4)2SO4濃度、VB1濃度。最佳配比為A1B3C2D3。
最終確定的最佳接種量、(NH4)2SO4和VB1濃度為法爾皮有孢漢生酵母1×102cfu/mL，酵母屬酵母2×106cfu/mL，(NH4)2SO4500mg/L，VB10.8mg/L。
本發(fā)明的有益效果對混合酵母發(fā)酵蘋果酒和純種酵母發(fā)酵蘋果酒的果香感官評定表明，混合酵母發(fā)酵蘋果酒比純種酵母屬酵母有濃郁的果香。
A.醇酯比?；炀l(fā)酵、法爾皮有孢漢生酵母純種發(fā)酵和酵母屬酵母純種發(fā)酵蘋果酒的醇酯比分別為3.06、0.82、11.90，從該結(jié)果可以看出，混菌發(fā)酵的醇酯比為酵母屬酵母的25.72％，因此，可以有效地降低醇酯比。
B.酯類物質(zhì)a.乙酸酯三種發(fā)酵液中檢測出的主要乙酸酯為乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯和乙酸異戊酯，混菌發(fā)酵、法爾皮有孢漢生酵母純種發(fā)酵和酵母屬酵母純種發(fā)酵蘋果酒中乙酸酯總和分別為56.05mg/L、107.03mg/L、19.01mg/L，占相應(yīng)蘋果酒中總酯含量的90.26％、96.89％和68.93％，因此，一方面可以認(rèn)為，與酵母屬酵母純種發(fā)酵相比，法爾皮有孢漢生酵母純種發(fā)酵有利于發(fā)酵液中乙酸酯的生成，另一方面說明，與酵母屬酵母純種發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵部分包含了法爾皮有孢漢生酵母產(chǎn)生高濃度乙酸酯的優(yōu)良釀造特性，有利于提高蘋果酒中乙酸酯濃度。
b.乙酯三種發(fā)酵液中檢測出的主要乙酯為丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙酯和9-癸烯酸乙酯，混菌發(fā)酵、法爾皮有孢漢生酵母純種發(fā)酵和酵母屬酵母純種發(fā)酵蘋果酒中乙酯總和分別為6.05mg/L、3.44mg/L和8.57mg/L。占相應(yīng)蘋果酒中總酯含量的9.74％、3.11％和31.07％，因此，一方面可以認(rèn)為，與法爾皮有孢漢生酵母純種發(fā)酵相比，酵母屬酵母純種發(fā)酵有利于發(fā)酵液中乙酸酯的生成，另一方面說明，與法爾皮有孢漢生酵母純種發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵部分包含了酵母屬酵母產(chǎn)生高濃度乙酯的優(yōu)良釀造特性，有利于提高蘋果酒中乙酯濃度，比法爾皮有孢漢生酵母純種發(fā)酵的蘋果酒香氣更復(fù)雜。
C.順序混合酵母發(fā)酵和純種酵母發(fā)酵的發(fā)酵效率比較順序混菌發(fā)酵與酵母屬酵母純種發(fā)酵的發(fā)酵時間相同，均為31天；法爾皮有孢漢生酵母發(fā)酵結(jié)束時間為40天。
法爾皮有孢漢生酵母發(fā)酵40天時，殘?zhí)呛繛?0.21g/L，不能降糖至4.0g/L以下，而順序混菌發(fā)酵與酵母屬酵母發(fā)酵31天時殘余總糖分別為3.88g/L、3.47g/L，均低于4.0g/L。
因此，優(yōu)化發(fā)酵條件后的混菌發(fā)酵具備與酵母屬酵母相似的高發(fā)酵效率的優(yōu)良發(fā)酵性能。
生物材料樣品保藏酵母屬酵母，保藏日期2001年6月24日，保藏單位名稱及簡稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為NOM201022。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1接種量、蘋果汁營養(yǎng)條件均對酵母發(fā)酵效率有顯著影響，所以有必要對這些因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定影響混合酵母發(fā)酵效率的最佳接種量、(NH4)2SO4和VB1濃度。
采用的正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平如表1所示。法爾皮有孢漢生酵母采用AS2.1488，酵母屬酵母采用CCTCC M201022。
表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平

試驗(yàn)安排及結(jié)果如表2所示。
表2 L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果


因素重要性次序?yàn)榻湍笇俳湍附臃N量、法爾皮有孢漢生酵母接種量、(NH4)2SO4濃度、VB1濃度。最佳配比為A1B3C2D3。
最終確定的最佳接種量、(NH4)2SO4和VB1濃度為法爾皮有孢漢生酵母1×102cfu/mL，酵母屬酵母2×106cfu/mL，(NH4)2SO4500mg/L，VB10.8mg/L。
實(shí)施例2按照最佳工藝條件，接種量法爾皮有孢漢生酵母ATCC 10631 1×102cfu/mL，酵母屬酵母CCTCC M201022 2×106cfu/mL，營養(yǎng)物質(zhì)添加量(NH4)2SO4500mg/L，VB10.8mg/L進(jìn)行蘋果酒混合酵母發(fā)酵，混合發(fā)酵溫度為15℃，混合發(fā)酵時間為31天后，所得蘋果酒產(chǎn)品總糖為3.88g/L，醇酯比為3.06，總酯濃度為62.10mg/L，是純種酵母屬酵母發(fā)酵的2.6倍。
權(quán)利要求
1.一種蘋果酒的混合酵母發(fā)酵方法，其特征是以濃縮蘋果汁稀釋至22°Brix的蘋果汁進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵第一天接種法爾皮有孢漢生酵母(Hanseniasporavalbyensis)，接種量為1×102cfu/mL或1×106cfu/mL，再在發(fā)酵第三天接種酵母屬酵母CCTCC M201022，接種量為1×106cfu/mL～2×106cfu/mL，在發(fā)酵蘋果汁中添加營養(yǎng)物質(zhì)(NH4)2SO4和VB1，添加量為(NH4)2SO4250～750mg/L，VB10.16～0.8mg/L，混合發(fā)酵溫度為15℃，混合發(fā)酵時間為31天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合酵母發(fā)酵方法，其中的接種法爾皮有孢漢生酵母(Hanseniaspora valbyensis)，接種量為1×102cfu/mL，接種酵母屬酵母CCTCCM201022，接種量為2×106cfu/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合酵母發(fā)酵方法，其中的接種用的法爾皮有孢漢生酵母種子和酵母屬酵母CCTCC M201022種子均已在30℃培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)基為濃縮蘋果汁稀釋至10°Brix的蘋果汁。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合酵母發(fā)酵方法，其中的法爾皮有孢漢生酵母采用AS 2.1488或ATCC 10631。p
全文摘要
一種蘋果酒的混合酵母發(fā)酵方法，涉及蘋果酒的釀造技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提出一種非酵母屬酵母法爾皮有孢漢生酵母(Hanseniaspora valbyensis)和酵母屬酵母CCTCC M201022的混合酵母發(fā)酵方法來制備蘋果酒，并確定了酵母接種量、接種時間和營養(yǎng)物質(zhì)(NH
文檔編號C12G3/02GK1635080SQ200410064830
公開日2005年7月6日 申請日期2004年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者徐巖, 王棟, 趙光鰲 申請人:江南大學(xué)