專利名稱：5＇－核苷酸酶活性測(cè)定方法及5＇－核苷酸酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定5′-核苷酸酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時(shí)，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時(shí)5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因?yàn)?′-核苷酸酶活性無生理性升高，對(duì)于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測(cè)定5′-核苷酸酶的活性對(duì)于疾病的診斷具有重要意義。
5′-核苷酸酶的活性測(cè)定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強(qiáng)酸測(cè)磷法(1925年)。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用同位素底物測(cè)試法，方法為5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5′-核苷酸酶活性?；蛘呃?′-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機(jī)磷，再用化學(xué)強(qiáng)酸法分析無機(jī)磷含量得以計(jì)算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測(cè)定儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。無機(jī)磷測(cè)定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度不好，強(qiáng)酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的5′-核苷酸酶活性的測(cè)定方法，同時(shí)給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行5′-核苷酸酶活性測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定5′-核苷酸酶活性的步驟如下1)、將樣品與主要由尿苷單磷酸、丙酮酸、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下方法原理的反應(yīng)尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用5′-核苷酸酶偶聯(lián)丙酮酸氧化酶、過氧化物酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)，以尿苷單磷酸為底物，以及還原型色原體(Chromogen)組合系統(tǒng)，將無色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此測(cè)量染料含量的高低(不同染料吸收波長(zhǎng)不同，介于400--600nm之間)可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)有(1)它利用將無色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原或者吲嗒胺色原染料來反映5′-核苷酸酶活性，有精確度好的優(yōu)點(diǎn)。(2)這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)組成的反應(yīng)成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試結(jié)果精確。
用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l尿苷單磷酸 1--50mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l丙酮酸氧化酶 5000--50000U/l過氧化物酶 5000--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)還原型色原體組合 0.1--20mmol/l以上還原型色原體組合可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone簡(jiǎn)稱MBTH)或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)與0.1--20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine簡(jiǎn)稱ESPAS)N，N-雙乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-雙氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-
benzenesulfonic acid簡(jiǎn)稱TBHB)3，5-雙氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid簡(jiǎn)稱DHBS)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium簡(jiǎn)稱TOOS)仨溴羥基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)雙甲基苯胺(Dimethylaniline簡(jiǎn)稱DMA)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine簡(jiǎn)稱EHSPT)2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)簡(jiǎn)稱ABTS4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)簡(jiǎn)稱HMB)3-甲基-乙基-羥基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline簡(jiǎn)稱MEHA)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源磷酸鹽(H2PO4-)污染試劑I緩沖液 40--200mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l丙酮酸氧化酶 5000--50000U/l過氧化物酶 5000--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)還原型色原體組合(一) 0.1--20mmol/l
還原型色原體組合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒 二者中之一。
試劑II緩沖液40--200mmol/l尿苷單磷酸1--50mmol/l穩(wěn)定劑10--50mmol/l還原型色原體組合(二) 0.1--20mmol/l還原型色原體組合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四種成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
雙劑的配方不僅限于上述配方，還原型色原體組合(一)及(二)可以互換位置。如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源磷酸鹽(H2PO4-)污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l還原型色原體組合(一) 0.1--20mmol/l還原型色原體組合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
試劑II緩沖液 40--200mmol/l丙酮酸氧化酶 5000--50000U/l過氧化物酶 5000--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l尿苷單磷酸 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l還原型色原體組合(二) 0.1--20mmol/l還原型色原體組合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四種成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
三劑的配方不僅限于上述配方，還原型色原體組合(一)及(二)可以分開放在試劑I、II或III的任何位置。其中的試劑I的成分，丙酮酸可以放在試劑II中，試劑II的成分，丙酮酸氧化酶、過氧化物酶等也可以放在試劑I中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明5′-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l肌苷單磷酸 1--5mmol/l丙酮酸 1--10mmol/l丙酮酸氧化酶5000--20000U/l過氧化物酶 5000--20000U/l穩(wěn)定劑 10--50％(總體積)10--50mmol/l還原型色原體組合0.1--10mmol/l由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡(jiǎn)便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源磷酸鹽(H2PO4-)的污染，消除內(nèi)、外源磷酸鹽(H2PO4-)的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)、外源磷酸鹽(H2PO4-)已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測(cè)試5′-核苷酸酶活性所需要的磷酸鹽(H2PO4-)都是產(chǎn)生于5′-核苷酸酶的活性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l尿苷單磷酸 1mmol/l丙酮酸 1mmol/l丙酮酸氧化酶 5000U/l過氧化物酶 5000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)4-氨基抗砒 2mmol/l石碳酸 10mmol/l在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)495～505nm，測(cè)試副波長(zhǎng)600nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)495～505nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
本實(shí)施例應(yīng)用5′-核苷酸酶偶聯(lián)丙酮酸氧化酶、過氧化物酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)，以尿苷單磷酸為底物，以及還原型色原體組合系統(tǒng)，將無色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原或者吲嗒胺色原，因此測(cè)量染料含量的高低(不同染料吸收波長(zhǎng)不同，介于400--600nm之間)可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l丙酮酸 5mmol/l丙酮酸氧化酶 12000U/l過氧化物酶 12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)4-氨基抗砒 1mmol/l試劑II緩沖液 100mmol/l肌苷單磷酸 3mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 1mmol/l測(cè)定5′-核苷酸酶活性時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)546nm，測(cè)試副波長(zhǎng)600nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
具體測(cè)定步驟為
尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)546nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l丙酮酸10mmol/l穩(wěn)定劑50mmol/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l丙酮酸氧化酶 20000U/l過氧化物酶20000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑III緩沖液120mmol/l尿苷單磷酸5mmol/l穩(wěn)定劑50mmol/l雙甲基苯胺2mmol/l
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間20分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)578nm，測(cè)試副波長(zhǎng)700nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
具體測(cè)定步驟為尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
實(shí)施例四本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 120mmol/l丙酮酸 6mmol/l丙酮酸氧化酶 12000U/l過氧化物酶 12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)4-氨基抗砒 1mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/l尿苷單磷酸 2mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l
雙甲基苯胺 2mmol/l測(cè)定5′-核苷酸酶活性時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)578nm，測(cè)試副波長(zhǎng)700nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在5分鐘。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種5′-核苷酸酶活性測(cè)定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由尿苷單磷酸、丙酮酸、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述5′-核苷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于所述步驟2)為，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測(cè)定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種5′-核苷酸酶診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l肌苷單磷酸 1--50mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l丙酮酸氧化酶5000--50000U/l過氧化物酶 5000--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)還原型色原體組合0.1--20mmol/l
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體為0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合為由0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定5′－核苷酸酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及5′－核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、尿苷單磷酸、丙酮酸、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/28GK1760368SQ20041006491
公開日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2004年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月11日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:王爾中