專利名稱：使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及在基因重組技術(shù)中使用的誘導(dǎo)基因表達(dá)的物理方法，更具體地說(shuō)，涉及一種使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由表達(dá)載體和相應(yīng)的宿主細(xì)胞兩部分構(gòu)成，是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣、最容易操作的基因高效表達(dá)系統(tǒng)。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)載體通常運(yùn)用可調(diào)控型質(zhì)粒載體控制外源基因的表達(dá)，從而控制被表達(dá)的目標(biāo)蛋白對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制、減少細(xì)胞蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的降解作用、提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量。在重組蛋白的生產(chǎn)和應(yīng)用中表達(dá)載體的調(diào)控方式是影響基因表達(dá)水平、重組蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量，以及生產(chǎn)成本的主要因素之一。二十多年來(lái)國(guó)內(nèi)外科學(xué)家構(gòu)建了多種調(diào)控類型的表達(dá)載體，包括糖原調(diào)控型、色氨酸調(diào)控型、磷酸鹽調(diào)控型、pH調(diào)控型、溶氧調(diào)控型、生物素調(diào)控型、熱激調(diào)控型等等。其中研究最早和應(yīng)用最廣的是糖原調(diào)控型和熱激調(diào)控型的表達(dá)載體，應(yīng)用最為成功的已商品化的表達(dá)載體包括帶有l(wèi)ac/tac啟動(dòng)子、PL/PR啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子的系列載體等等(Sambrook，J，and DW Russell.2001.Molecular Cloninga laboratory manual，3rded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
糖原調(diào)控型載體T7系列的表達(dá)載體在已經(jīng)商品化的表達(dá)系統(tǒng)中是表達(dá)水平最高的，其啟動(dòng)子來(lái)源于大腸桿菌T7噬菌體，由T7 RNA聚合酶選擇性識(shí)別和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。這種表達(dá)載體是通過(guò)控制T7 RNA聚合酶的合成而進(jìn)行調(diào)控的將編碼T7 RNA聚合酶的基因插入λ噬菌體，使它處于lac啟動(dòng)子或PL啟動(dòng)子的控制下；用這些λ噬菌體的衍生株感染大腸桿菌獲得溶源菌DE3或CE6；以這些溶源菌為宿主細(xì)胞就可以通過(guò)IPTG誘導(dǎo)或熱激誘導(dǎo)T7RNA聚合酶的合成，從而啟動(dòng)T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。這類載體多數(shù)由lac啟動(dòng)子間接調(diào)控，屬于糖原調(diào)控型。
lac/tac載體是通過(guò)大腸桿菌的lac操縱基因來(lái)實(shí)現(xiàn)表達(dá)調(diào)控的。無(wú)誘導(dǎo)劑存在時(shí)，lacI編碼的阻遏蛋白與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄的起始；誘導(dǎo)劑的加入使阻遏蛋白從操縱基因上解離出來(lái)，從而使基因得到轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。因此，這是另一類應(yīng)用最廣的糖原調(diào)控型載體。
糖原調(diào)控型表達(dá)載體工業(yè)化應(yīng)用中存在著誘導(dǎo)劑的問(wèn)題，如對(duì)于lac啟動(dòng)子調(diào)控的載體異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是最有效、應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)劑，但是由于IPTG具有一定的毒性，這類表達(dá)載體在藥用蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制；同時(shí)，由于其價(jià)格昂貴IPTG在工業(yè)酶的生產(chǎn)中也難以推廣。也有用乳糖代替IPTG作誘導(dǎo)劑，但是因?yàn)槿樘鞘强纱x底物，必須在較高濃度下經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化才能產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，而且其誘導(dǎo)效果受到多種因素的影響(龔毅.2002.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng).見(jiàn)基因表達(dá)技術(shù)，1-19.科學(xué)出版社，北京)。
糖原調(diào)控型表達(dá)載體的另一個(gè)缺陷是具有較高的本底表達(dá)，這在使用高拷貝復(fù)制子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)尤其明顯。因此，當(dāng)目標(biāo)基因產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞有害時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖受到抑制，重組蛋白的表達(dá)必然量受到影響。
熱激調(diào)控型載體克服糖原調(diào)控型表達(dá)載體的缺點(diǎn)的方法之一是篩選阻遏蛋白的溫度敏感型突變體，溫度敏感型突變體所產(chǎn)生的阻遏蛋白在較低溫度時(shí)(如30℃)對(duì)啟動(dòng)子具有阻遏功能，在較高溫度(如40℃)時(shí)失去活性并且解阻遏(Elvin CM，PR Thompson，ME Argall et al.1990.Modified bacteriophage lambda promoter Vectors foroverproduction of proteins in Escherichia coli.Gene，87123-126)?，F(xiàn)在已經(jīng)有多種不同的溫度敏感型lacI基因突變體被鑒定并且被應(yīng)用于lac/tac啟動(dòng)子的調(diào)控；PL/PR是λ噬菌體的早期轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，受基因cI所產(chǎn)生的阻遏蛋白抑制，其溫度敏感型突變體cI857ts在熱激誘導(dǎo)型載體的發(fā)展中起了重要作用，常用的載體包括pJLA503(Schauder，B et al.1987.Inducible expression vectorsincorporating the Escherichia coli atpE translational initiationregion.Gene，52279-283)、pBV220(張智清等.1990.含PRPL啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用.病毒學(xué)報(bào)，6111-116)、pHsh(中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00410041636.7)等等。
熱激調(diào)控型載體的不足之處在于進(jìn)行大體積培養(yǎng)時(shí)難以實(shí)現(xiàn)快速升溫(Glazer，AN，and H Nikaido.1995.Microbial Biotechnology.WH Freeman and Company，New York)，而升溫緩慢又會(huì)影響表達(dá)水平；同時(shí)可能存在的另一個(gè)問(wèn)題是在熱激誘導(dǎo)過(guò)程中，大腸桿菌熱休克系統(tǒng)被激活，從而合成蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行降解。對(duì)于小體積培養(yǎng)液可參照現(xiàn)有的方法進(jìn)行升溫，如熱水浴法或換液法(Sambrook，J，and DWRussell，2001)。
最近，本研究組成功地構(gòu)建了一種新型高效表達(dá)載體pHsh(中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00410041636.7)，其特征在于具有由大腸桿菌σ因子σ32識(shí)別和調(diào)控的啟動(dòng)子，而不通過(guò)熱敏感的抑制子進(jìn)行調(diào)控。因此，這一種是誘導(dǎo)機(jī)制不同于其它熱敏質(zhì)粒的新型的用熱激方法誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)的質(zhì)粒載體。與其它熱激載體相比，這個(gè)新型載體主要優(yōu)點(diǎn)是重組蛋白的產(chǎn)量高和大腸桿菌蛋白酶的活性低。因此，要將熱激調(diào)控型載體大規(guī)模地應(yīng)用于外源基因的表達(dá)，還需要解決的問(wèn)題在于如何使大體積發(fā)酵液快速升溫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，在基因工程中通過(guò)發(fā)酵液的快速升溫來(lái)誘導(dǎo)目的基因在大腸桿菌表達(dá)體系中進(jìn)行大量表達(dá)，使熱激誘導(dǎo)型的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)(1)預(yù)備A、B兩臺(tái)發(fā)酵罐，測(cè)試出B罐將水從起始溫度加熱到目標(biāo)溫度的加熱速度；(2)在A、B罐中分別裝入培養(yǎng)液，滅菌后將A罐的溫度設(shè)置為起始溫度，B罐的溫度設(shè)置為目標(biāo)溫度；(3)向A罐接種熱激調(diào)控型基因工程菌，進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵；(4)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將A罐中的發(fā)酵液以步驟(1)中測(cè)出的加熱速度注入已經(jīng)預(yù)熱至目標(biāo)溫度并且正在加熱和通氣攪拌的B罐中(5)A罐中的發(fā)酵液注入B罐后，將B罐的溫度穩(wěn)定在目標(biāo)溫度，讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，以獲得目標(biāo)蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明中的起始溫度是熱激調(diào)控載體中阻遏蛋白對(duì)啟動(dòng)子具有阻遏功能的溫度，如28-32℃，優(yōu)選30℃；目標(biāo)溫度是使阻遏蛋白失去活性并且解阻遏的溫度，如37-44℃，優(yōu)選40-42℃；不同熱激調(diào)控載體的起始溫度和目標(biāo)溫度是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過(guò)查閱而得知的。
本發(fā)明方法向A、B罐中分別裝入培養(yǎng)液，為了達(dá)到較理想的效果，推薦A罐與B罐的裝液比為1∶(0.05-1.2)，優(yōu)選1∶0.1。
本發(fā)明方法中的熱激調(diào)控型基因工程菌是常規(guī)的以熱激調(diào)控型載體作為表達(dá)載體的基因工程菌，其中熱激調(diào)控型載體可以是pHsh、pJLA503或pBV220，對(duì)轉(zhuǎn)入的外源基因沒(méi)特別的限定。
本發(fā)明方法中將A罐中的發(fā)酵液注入B罐的時(shí)間選擇在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，優(yōu)選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之早期；細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期可以以細(xì)胞密度為指標(biāo)，但相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度因培養(yǎng)基的配方而異，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過(guò)實(shí)驗(yàn)繪制生長(zhǎng)曲線而得知，如用Luria-Bertani培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)含有pHsh的大腸桿菌時(shí)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞密度OD600為0.4-2.0，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之早期的細(xì)胞密度為0.4-1.2，優(yōu)選0.6-0.9。用Terrific培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞密度OD600為0.4-3，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之早期的細(xì)胞密度為0.4-1.2，優(yōu)選0.7-1.2。
本發(fā)明方法中將A罐中的發(fā)酵液注入B罐后，讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，以獲得目標(biāo)蛋白的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定，推薦2-12小時(shí)，優(yōu)選6-9小時(shí)。
本發(fā)明方法中的基因工程菌可通過(guò)以下技術(shù)獲得基因克隆選擇Thermotoga maritima(ATCC4 3589)中的阿拉伯糖苷酶基因araB、葡萄糖醛酸酶基因aguA及其木聚糖酶基因xynB的突變體xynIII(本實(shí)驗(yàn)室誘變)等為待表達(dá)的基因，對(duì)pHsh、pJLA503、pBV220等熱激調(diào)控型載體進(jìn)行基因表達(dá)誘導(dǎo)試驗(yàn)。該試驗(yàn)中所用到的基因克隆的技術(shù)均參照冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)《分子克隆)》第三版(Sambrook，J，and DW Russell，2001)。
XynIII可通過(guò)xynII在表達(dá)載體pHsh中的原位定點(diǎn)誘變獲得原位定點(diǎn)誘變?yōu)榱私档痛竽c桿菌稀有密碼子和非優(yōu)勢(shì)密碼子在基因xynII中的出現(xiàn)頻率，選擇xynII基因序列中段稀有密碼子和非優(yōu)勢(shì)密碼子較密集區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)誘變?cè)O(shè)計(jì)一對(duì)5’端鄰接，3’端方向相反的引物，將變異序列平均分配在這對(duì)引物的5’端；以pHsh-xynII為模板，用Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用T4 DNA激酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行磷酸化，再用T4 DNA連接酶使之自身環(huán)化連接。突變體經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序確認(rèn)后定名為pHsh-xynIII。
araB、aguA和xynIII的PCR擴(kuò)增片段被分別克隆到pHsh，插入位點(diǎn)為NcoI和XhoI；同時(shí)，xynIII的PCR擴(kuò)增片段被克隆到載體pJLA503、pBV220中，插入位點(diǎn)為pJLA503的NdeI和SalI，以及pBV220的EcoRI和SalI。重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞產(chǎn)生基因工程菌株pHsh-araB、pHsh-aguA、pHsh-xynIII、pJLA503-xynIII和pBV220-xynIII。
大體積發(fā)酵液熱激誘導(dǎo)為了使獲得快速升溫以達(dá)到熱激(heatshock)效果，本發(fā)明公開(kāi)了預(yù)熱-注入法。其操作過(guò)程如下(1)預(yù)備A、B兩臺(tái)發(fā)酵罐，A罐預(yù)設(shè)溫度為a，B罐預(yù)設(shè)溫度為b，測(cè)試B罐將水從a加熱至b所需要的時(shí)間，換算出加熱速度xml/min，即每分鐘(min)能使多少(x)毫升(ml)水從a升溫至b；(2)在A罐中裝培養(yǎng)液n立升，B罐裝n×0.1至n×1立升(A罐與B罐裝液體積之和不得超出B罐的最大容量)，滅菌后將A罐的溫度設(shè)置為a，B罐的溫度設(shè)置為b；(3)向A罐接種以熱激誘導(dǎo)型質(zhì)粒為表達(dá)載體的大腸桿菌基因工程菌菌種，進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵；(4)細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期時(shí)，將A罐中的發(fā)酵液以xml/min速度注入已經(jīng)預(yù)熱至b并且正在加熱和通氣攪拌的B罐中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的注入速度將B罐的溫度控制在b；(5)A罐中的發(fā)酵液注入B罐后，將B罐的溫度穩(wěn)定在37-44℃，讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)2至12個(gè)小時(shí)。每隔1小時(shí)取樣一次，分析細(xì)胞密度和重組酶的活性，發(fā)現(xiàn)酶活性不再增長(zhǎng)時(shí)立即停止培養(yǎng)并以大容量離心機(jī)或連續(xù)流式離心機(jī)離心收集細(xì)胞。
基因表達(dá)水平的評(píng)估以重組酶的活性估算基因表達(dá)水平(見(jiàn)圖1至圖5)。其中阿拉伯糖苷酶的活性定義為以1mM對(duì)硝基苯酚α-阿拉伯糖苷(pNPA，Sigma)為底物，在80℃，pH 5.8的條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量；葡萄糖醛酸酶的活性定義為以4-O-甲基葡萄糖醛酸寡木糖為底物，在80℃，pH 5.8的條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmolα-葡萄糖醛酸所需要的酶量；木聚糖酶活性定義為以0.5％Oatxylan(Sigma)為底物，在90℃，pH 5.8的條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需要的酶量。
本發(fā)明的有益效果是使大體積發(fā)酵液中的細(xì)胞在瞬間獲得升溫獲得熱激效應(yīng)，首次使低成本、無(wú)毒性的物理誘導(dǎo)方法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。


圖1是以pHsh為表達(dá)載體的基因工程菌pHsh-xynIII分別在搖瓶中熱激誘導(dǎo)和通過(guò)本發(fā)明方法熱激誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平曲線圖；圖2是以pHsh為表達(dá)載體的基因工程菌pHsh-araB分別在搖瓶中熱激誘導(dǎo)和通過(guò)本發(fā)明方法熱激誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平曲線圖；圖3是以pHsh為表達(dá)載體的基因工程菌pHsh-aguA分別在搖瓶中熱激誘導(dǎo)和通過(guò)本發(fā)明方法熱激誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平曲線圖；圖4是以pJLA503為載體的基因工程菌pJLA503-xynIII分別在三角瓶中熱激誘導(dǎo)和通過(guò)本發(fā)明方法熱激誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平曲線圖；圖5是以pBV220為載體的基因工程菌pBV220-xynIII分別在三角瓶中熱激誘導(dǎo)和通過(guò)本發(fā)明方法熱激誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平曲線圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1木聚糖酶的制備(1)基因克隆將Thermotoga maritimas基因xynB的突變體xynIII通過(guò)NcoI和XhoI雙位點(diǎn)克隆到表達(dá)載體pHsh中構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHsh-xynIII；用電穿孔法(electroporation)將這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株JM109。
(2)菌種制備挑選出的轉(zhuǎn)化子接入250ml含有100μg/ml氨芐青霉素的Terrific培養(yǎng)基，在30℃搖床中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)至OD600約為2.0。
(3)細(xì)胞培養(yǎng)A罐裝10升Terrific培養(yǎng)基，滅菌后降溫至30℃，接入菌種250ml并加入0.8克氨芐青霉素；于30℃通氣攪拌培養(yǎng)至OD600約為1.2，溶氧量為80％以上，攪拌速度為250rpm。
(4)表達(dá)誘導(dǎo)測(cè)試出B罐每分鐘可將1升水從30℃加熱到42℃。B罐裝10升Terrific培養(yǎng)基，滅菌后降溫至42℃，加入氨芐青霉素0.8克；將A罐中的發(fā)酵液以約每分鐘1升的速度注入B罐，邊注入邊加熱攪拌使溫度維持在39-42℃之間；全部注入B罐后于42℃繼續(xù)通氣攪拌培養(yǎng)，6小時(shí)后停止培養(yǎng)，并以連續(xù)流式離心機(jī)離心收集細(xì)胞。
(5)將細(xì)胞懸浮于磷酸緩沖液，通過(guò)高壓細(xì)胞破碎儀使細(xì)胞裂解；將細(xì)胞裂解液置于70度下水浴30min，離心除去沉淀，獲得接近電泳純的木聚糖酶。
實(shí)施例2與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，外源基因?yàn)門.ethanolicus中的阿拉伯糖苷酶基因araB，將它克隆到表達(dá)載體pHsh中得到重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109得到相應(yīng)得重組菌株pHsh-araB。
實(shí)施例3與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，外源基因?yàn)門.ethanolicus中的葡萄糖醛酸酶基因aguA，將它克隆到表達(dá)載體pHsh中得到重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109得到相應(yīng)得重組菌株pHsh-aguA。
實(shí)施例4與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，宿主菌是大腸桿菌JM109(DEC)。
實(shí)施例5與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，宿主菌是大腸桿菌DH5α。
實(shí)施例6與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，表達(dá)誘導(dǎo)步驟中A罐滅菌后降溫至28℃，菌種培養(yǎng)至OD600約為0.4，B罐裝1升Terrific培養(yǎng)基，滅菌后降溫至37℃，將A罐中的發(fā)酵液以約每分鐘1升的速度注入B罐，全部注入B罐后于37℃繼續(xù)通氣攪拌培養(yǎng)2小時(shí)。
實(shí)施例7與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，表達(dá)誘導(dǎo)步驟中A罐滅菌后降溫至32℃，菌種培養(yǎng)至OD600約為0.5，B罐裝5升Terrific培養(yǎng)基，滅菌后降溫至44℃，將A罐中的發(fā)酵液以約每分鐘1升的速度注入B罐，全部注入B罐后于44℃繼續(xù)通氣攪拌培養(yǎng)10小時(shí)。
實(shí)施例8與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，表達(dá)誘導(dǎo)步驟中A罐滅菌后降溫至29℃，菌種培養(yǎng)至OD600約為0.9，B罐裝8升Terrific培養(yǎng)基，滅菌后降溫至41℃，將A罐中的發(fā)酵液以約每分鐘1升的速度注入B罐，全部注入B罐后于37℃繼續(xù)通氣攪拌培養(yǎng)9小時(shí)。
實(shí)施例9與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，表達(dá)誘導(dǎo)步驟中A罐滅菌后降溫至31℃，菌種培養(yǎng)至OD600約為0.7，B罐裝2升Terrific培養(yǎng)基，滅菌后降溫至40℃，將A罐中的發(fā)酵液以約每分鐘1升的速度注入B罐，注入B罐后于40℃繼續(xù)通氣攪拌培養(yǎng)12小時(shí)。
實(shí)施例10與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，表達(dá)誘導(dǎo)步驟中A罐裝培養(yǎng)基15升，B罐裝培養(yǎng)基18升。
實(shí)施例11與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，表達(dá)誘導(dǎo)步驟中A罐裝培養(yǎng)基20升，B罐裝培養(yǎng)基1升。
實(shí)施例12與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，表達(dá)誘導(dǎo)步驟中A罐裝培養(yǎng)基15升，B罐裝培養(yǎng)基20升。
實(shí)施例13與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，表達(dá)誘導(dǎo)步驟中A罐裝培養(yǎng)基20升，B罐裝培養(yǎng)基0.8升。
實(shí)施例15與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，B罐的加熱速度為每分鐘1.2升。
實(shí)施例16與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，A罐細(xì)胞密度達(dá)到3.0時(shí)，轉(zhuǎn)罐熱激誘導(dǎo)。
實(shí)施例17與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，A罐細(xì)胞密度達(dá)到0.7時(shí)，轉(zhuǎn)罐熱激誘導(dǎo)。
實(shí)施例18與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，A罐細(xì)胞密度達(dá)到2.0時(shí)，轉(zhuǎn)罐熱激誘導(dǎo)。
實(shí)施例19與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，使用Luria-Bertani培養(yǎng)基培養(yǎng)。
實(shí)施例20與實(shí)施例19基本相同，不同之處在于，A罐細(xì)胞密度達(dá)到1.0時(shí)，轉(zhuǎn)罐熱激誘導(dǎo)。
實(shí)施例21與實(shí)施例19基本相同，不同之處在于，A罐細(xì)胞密度達(dá)到0.6時(shí)，轉(zhuǎn)罐熱激誘導(dǎo)。
實(shí)施例22與實(shí)施例19基本相同，不同之處在于，A罐細(xì)胞密度達(dá)到0.9時(shí)，轉(zhuǎn)罐熱激誘導(dǎo)。
實(shí)施例23與實(shí)施例19基本相同，不同之處在于，以pJLA503為表達(dá)載體構(gòu)建成重組質(zhì)粒pJLA503-xynIII。
實(shí)施例24與實(shí)施例19基本相同，不同之處在于，以pBV220為表達(dá)載體構(gòu)建成重組質(zhì)粒pBV220-xynIII。
實(shí)施例25與實(shí)施例19基本相同，不同之處在于，將帶有重組質(zhì)粒pHsh-xynIII的基因工程菌用本發(fā)明方法誘導(dǎo)，A罐與B罐的裝液比為1∶0.25，轉(zhuǎn)罐培養(yǎng)測(cè)定酶活性，見(jiàn)圖1；在容量為100ml的三角瓶中裝入25ml培養(yǎng)基，滅菌、冷卻后加入氨芐青霉素至0.1mg/ml，并以1-5％接種量接入帶有重組質(zhì)粒pHsh-xynIII的基因工程菌；將三角瓶置于30℃搖床振蕩培養(yǎng)，細(xì)胞密度(OD600)達(dá)到1.0左右時(shí)將它從30℃搖床移入42℃水浴搖床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；從表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)開(kāi)始每隔2小時(shí)取樣一次，測(cè)定酶活性的增加，見(jiàn)圖1。
實(shí)施例26與實(shí)施例25基本相同，不同之處在于，基因工程菌是帶有重組質(zhì)粒pHsh-araB的基因工程菌，測(cè)定酶活性，見(jiàn)圖2。
實(shí)施例27與實(shí)施例25基本相同，不同之處在于，基因工程菌是帶有重組質(zhì)粒pHsh-aguA的基因工程菌，測(cè)定酶活性，見(jiàn)圖3。
實(shí)施例28與實(shí)施例25基本相同，不同之處在于，基因工程菌是帶有重組質(zhì)粒pJLA503-xynIII的基因工程菌，測(cè)定酶活性，見(jiàn)圖4。
實(shí)施例29與實(shí)施例25基本相同，不同之處在于，基因工程菌是帶有重組質(zhì)粒pBV220-xynIII的基因工程菌，測(cè)定酶活性，見(jiàn)圖5。
權(quán)利要求
1.一種使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其步驟如下(1)預(yù)備A、B兩臺(tái)發(fā)酵罐，測(cè)試出B罐將水從起始溫度加熱到目標(biāo)溫度的加熱速度；(2)在A、B罐中分別裝入培養(yǎng)液，滅菌后將A罐的溫度設(shè)置為起始溫度，B罐的溫度設(shè)置為目標(biāo)溫度；(3)向A罐接種熱激調(diào)控型基因工程菌，進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵；(4)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將A罐中的發(fā)酵液以步驟(1)中測(cè)出的加熱速度注入已經(jīng)預(yù)熱至目標(biāo)溫度并且正在加熱和通氣攪拌的B罐中(5)A罐中的發(fā)酵液注入B罐后，將B罐的溫度穩(wěn)定在目標(biāo)溫度，讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，以獲得目標(biāo)蛋白的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其特征在于，其中的起始溫度是28-32℃，目標(biāo)溫度是37-44℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其特征在于，其中的起始溫度是30℃，目標(biāo)溫度是40-42℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其特征在于，其中步驟(2)中A罐與B罐的裝液比為1∶0.05-1.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的A罐與B罐的裝液比為1∶0.1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其特征在于，其中的熱激調(diào)控型基因工程菌是以pHsh、pJLA503或pBV220為載體的基因工程菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其特征在于，其中步驟(4)中的轉(zhuǎn)罐是在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之早期時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其特征在于，其中步驟(5)中讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)2至12個(gè)小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法，其特征在于，其中步驟(5)中讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)6至9個(gè)小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種使大體積發(fā)酵液快速升溫的熱激誘導(dǎo)方法。其特征是預(yù)備A、B兩臺(tái)發(fā)酵罐，測(cè)試出B罐將水從起始溫度加熱到目標(biāo)溫度的加熱速度；在A、B罐中分別裝入培養(yǎng)液，滅菌后將A罐的溫度設(shè)置為起始溫度，B罐的溫度設(shè)置為目標(biāo)溫度；向A罐接種熱激調(diào)控型基因工程菌，進(jìn)行通氣攪拌發(fā)酵；細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將A罐中的發(fā)酵液以測(cè)出的加熱速度注入已經(jīng)預(yù)熱至目標(biāo)溫度并且正在加熱和通氣攪拌的B罐中；A罐中的發(fā)酵液注入B罐后，將B罐的溫度穩(wěn)定在目標(biāo)溫度，讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，以獲得目標(biāo)蛋白的表達(dá)。本發(fā)明的有益效果是使大體積發(fā)酵液中的細(xì)胞在瞬間獲得升溫獲得熱激效應(yīng)，使低成本、無(wú)毒性的物理誘導(dǎo)方法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12M3/00GK1609212SQ20041006577
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月18日
發(fā)明者邵蔚藍(lán), 裴建軍 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)