專利名稱：一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase.E.C.2.3.2.13)，是一種催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸共價(jià)鍵的酶，通過(guò)催化反應(yīng)，可引起各種蛋白質(zhì)分子內(nèi)的交聯(lián)、分子間的交聯(lián)、蛋白質(zhì)與氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解，被譽(yù)為生物體內(nèi)‘天然的粘合劑’，在化妝品、皮革制品、紡織品工業(yè)，尤其是在食品加工領(lǐng)域有著廣泛的用途。目前已從多種生物材料(包括動(dòng)植物及微生物)中獲得了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，微生物來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，因其生產(chǎn)不受季節(jié)和原料限制，是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶家族中最有可能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的一種，盡管有多種微生物自然狀態(tài)下能產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，但大多數(shù)的產(chǎn)酶量不高；而通過(guò)常規(guī)誘變育種技術(shù)進(jìn)行育種，耗時(shí)費(fèi)力，又很難篩選到產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高產(chǎn)菌株，這就造成了實(shí)際生產(chǎn)成本較高，限制了該酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)，將微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因克隆至大腸桿菌，然后通過(guò)誘導(dǎo)基因高效率表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，從而提高該酶的產(chǎn)量和降低該酶的生產(chǎn)成本。本發(fā)明的技術(shù)方案為1.本發(fā)明首先提供一種獲得微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因克隆的方法提取鏈霉菌屬茂原鏈霉菌基因組DNA后，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶全長(zhǎng)基因。2.提供一種生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的方法主要是利用含6-His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pQE30-xa和大腸桿菌JM109進(jìn)行谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的融合表達(dá)。3.提供重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分離純化的方法，主要是利用Ni-NTA柱親和層析的方法獲得高純度的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。
本發(fā)明有益效果是重組后的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性達(dá)到2.2U/ml，高于原始菌株2-3倍，且利用大腸桿菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)該酶的工藝流程少，原料簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉。而在一些對(duì)酶純度要求不高的行業(yè)，諸如皮革制品、紡織品工業(yè)、飼料加工等行業(yè)，也可直接使用未經(jīng)純化的粗酶，這將大大降低這些行業(yè)的生產(chǎn)成本。譬如若利用未經(jīng)純化的重組谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶對(duì)酪蛋白進(jìn)行改性研究發(fā)現(xiàn)，粗酶也可很好的交聯(lián)酪蛋白，使之溶液粘度增加，乳化能力提高，發(fā)泡性下降另外，通過(guò)重組的谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶粘和小體型蝦，獲得了體積增大且經(jīng)煎煮后也不易分離的重疊蝦，大輻度提高了小體型蝦的商品價(jià)值?？傊ㄟ^(guò)這一方法生產(chǎn)的重組谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶同非重組谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶一樣可以廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)、食品加工業(yè)等領(lǐng)域中。
四

圖1 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的PCR擴(kuò)增圖2 用于生產(chǎn)重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)載體pQE30xa-TGase圖3 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間下谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)A標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；B誘導(dǎo)培養(yǎng)12h；C誘導(dǎo)培養(yǎng)10h；D誘導(dǎo)培養(yǎng)8h；E誘導(dǎo)培養(yǎng)6h；F誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；G誘導(dǎo)培養(yǎng)2h；H pQE30xa空白載體。
圖4 親和層析純化后的重組谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶五具體實(shí)施方式
1.微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的分離克隆從茂原鏈霉菌(Streptomycesmobaraensis)提取基因組DNA為模板，具體DNA提取方法參照Promega說(shuō)明書(shū)，根據(jù)相關(guān)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因序列合成引物，用上下游引物TGP1(5’CGGGATCCATG CGC ATA CGC CGG AGA 3’)，TGP2(5’CG AAGCTT GCC AGC CCT GCT TTA CCTTG 3’)并在其5’端分別加入BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基，進(jìn)行谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件95℃預(yù)變性5min，94℃1min，55℃45s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。制備1.2％TBE瓊脂糖凝膠，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5uL與6×凝膠電泳上樣緩沖液1uL混勻后電泳，電壓5V/cm，電泳完畢后，在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照，結(jié)果見(jiàn)附圖1。利用DNA凝膠純化試劑盒純化回收1.2Kb的PCR產(chǎn)物，與克隆pUC-mT載體(上海博亞生物科技有限公司)進(jìn)行連接。10ul連接反應(yīng)體系為pUC-mT載體50ng，PCR產(chǎn)物50ng，1x連接緩沖液2μl，T4DNA連接酶3weiss，4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細(xì)胞，并在在含有x-gal、IPTG及Amp的LB平板上進(jìn)行重組子的篩選。挑選白色菌落，抽提質(zhì)粒DNA后，一部分進(jìn)行酶切和PCR鑒定，將重組質(zhì)粒命名為pUC-mT-TGase；另外一部分送博亞公司進(jìn)行目的片段序列的雙向測(cè)定，測(cè)序最終結(jié)果如下序列atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga 40gtgcggtgtt atgcaccgcc ggattcatgc cgtcggccag 80gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt 160cgcgaacatc aacgcgctca acgaaagcgc tccggccgct 200tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc 280cgacccgtac cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc 320gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg 400ggagtggctg tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc 440aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg 520caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc 560
cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct 640ggagaacgcc cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc 680aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac 760gccgtccttc aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg 800tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta 880cggcgacccg gacgccttcc gctccgcccc gggcaccggt 920ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc 960ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg 1000ctggttcggc gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc 1040gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg cccaatggca 1080gcctggggtg ccatgcatgt ctcacgagag caagttccgc 1120aactgggtcc gagggttact cggacttcga ccgcggggag 1160ccctatgtgg tatcaccctc tccatcccca agaatgctgg 1200aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggcgtgatg 1240tgagcg 1246并將所獲得的基因序列同已知微生物來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因序列進(jìn)行序列相似性比較后發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)獲得的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因與已知基因存在較高的同源性。
2.原核表達(dá)系統(tǒng)pQE30xa-TGase構(gòu)建首先用BamHI和HindIII分別消化重組質(zhì)粒(pUC-mT-TGase)和表達(dá)載體pQE30xa(Qiagen公司)，分別純化回收后，T4DNA連接酶連接得到重組表達(dá)載體pQE30xa-TGase，見(jiàn)圖2。轉(zhuǎn)化受體菌JM109后，挑白色菌落，按照常規(guī)方法小量制備質(zhì)粒DNA，利用酶切方法鑒定出陽(yáng)性克隆。
3.重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的提取將重組工程菌接種到LB液體培養(yǎng)基(含Amp，100mg/L)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按照1∶1000轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中(含Amp 100mg/L)，37℃振蕩培養(yǎng)3-6h后，加1mol/L異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.1mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)10h～12h后，見(jiàn)附圖3，離心收集菌體，將獲得菌體用5mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH6.5)洗一次，再溶于1/10體積的PBS中，加1mmol/L蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為1mmol/L，超聲波破碎(40％功率，破碎10min)。然后，10000r/min，4℃離心10min，上清液CM-纖維素層析后，進(jìn)一步應(yīng)用6xHis標(biāo)簽和Ni-NTA樹(shù)脂純化后，其純度達(dá)90％以上。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE結(jié)果證明電泳的條帶為一條，分子量45KD左右，且表達(dá)量較高，見(jiàn)附圖4。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的酶活測(cè)定方法參照Folk提出的hydroxylamine比色法進(jìn)行，即1個(gè)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活單位定義為pH6.0，37℃時(shí)，每分鐘催化底物生成1mol CBZ-Glu(Gly)γ-單氧肟酸產(chǎn)物所需的酶量。重組后的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性達(dá)到2.2U/ml，高于原始菌株2-3倍，且利用大腸桿菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)該酶的工藝流程少，原料簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉。而在一些對(duì)酶純度要求不高的行業(yè)，諸如皮革制品、紡織品工業(yè)、飼料加工等行業(yè)，也可直接使用未經(jīng)純化的粗酶，這將大大降低這些行業(yè)的生產(chǎn)成本。譬如若利用未經(jīng)純化的重組谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶對(duì)酪蛋白進(jìn)行改性研究發(fā)現(xiàn)，粗酶也可很好的交聯(lián)酪蛋白，使之溶液粘度增加，乳化能力提高，發(fā)泡性下降；另外，通過(guò)重組的谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶粘和小體型蝦，獲得了體積增大且經(jīng)煎煮后也不易分離的重疊蝦，大輻度提高了小體型蝦的商品價(jià)值?？傊?，通過(guò)這一方法生產(chǎn)的重組谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶同非重組谷胺酰胺轉(zhuǎn)胺酶一樣可以廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)、食品加工業(yè)等領(lǐng)域中。
重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因序列表重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因序列表<110>南京大學(xué)<120>重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因<160>1<210>1<211>1246bp<212>DNA<213>人工序列<400>1atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga gtgcggtgtt atgcaccgcc 60ggattcatgc cgtcggccag gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt cgcgaacatc aacgcgctca 180acgaaagcgc tccggccgct tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac cgtccctcgt 300acggcagggc cgagacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg tcctacggct 420gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg tccggcgaga 540cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc cacgacgaga 660gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc aaggagcgga 780acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg gacgccttcc 900gctccgcccc gggcaccggt ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc 960ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc gcccagacgg 1020aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg cccaatggca 1080gcctggggtg ccatgcatgt ctcacgagag caagttccgc aactgggtcc gagggttact 1140cggacttcga ccgcggggag ccctatgtgg tatcaccctc tccatcccca agaatgctgg 1200aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggcgtgatg tgagcg 124權(quán)利要求
1.一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因，長(zhǎng)度1246，其特征是1-180位的核苷酸為編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因前導(dǎo)肽的序列，該段序列與酶的跨膜運(yùn)輸和正確折疊有密切關(guān)系；420-422位的核苷酸為編碼酶活性中心cys的序列；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶全長(zhǎng)基因序列為atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga 40gtgcggtgtt atgcaccgcc ggattcatgc cgtcggccag 80gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt 160cgcgaacatc aacgcgctca acgaaagcgc tccggccgct 200tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc 280cgacccgtac cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc 320gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg 400ggagtggctg tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc 440aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg 520caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc 560cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct 640ggagaacgcc cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc 680aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac 760gccgtccttc aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg 800tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta 880cggcgacccg gacgccttcc gctccgcccc gggcaccggt 920ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc 960ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg 1000ctggttcggc gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc 1040gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg cccaatggca 1080gcctggggtg ccatgcatgt ctcacgagag caagttccgc 1120aactgggtcc gagggttact cggacttcga ccgcggggag 1160ccctatgtgg tatcaccctc tccatcccca agaatgctgg 1200aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggcgtgatg 1240tgagcg 1246
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法，其特征是由以下步驟完成A微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分離和克隆；B谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因原核表達(dá)載體構(gòu)建；C谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法，其特征是獲取谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的具體步驟為(1)提取茂原鏈霉菌基因組DNA；(2)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的PCR擴(kuò)增；(3)PCR產(chǎn)物的回收純化；(4)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的T/A克??；(5)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因雙脫氧終止法雙向測(cè)序。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法，其特征是進(jìn)行微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因在大腸桿菌中表達(dá)的具體步驟為(1)原核表達(dá)載體構(gòu)建(2)重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的親和層析分離純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)基因工程重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征是將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因正向插入表達(dá)載體pQE30-xa標(biāo)簽序列6-His之后，這樣便于后期融合蛋白的鑒定和分離純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)重組微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的純化方法，其特征是異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)標(biāo)的的終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)的時(shí)間為10h～12h小時(shí)后，收集菌體超聲破碎后，上清液先用CM-纖維素層析，再進(jìn)一步利用6xHis標(biāo)簽和Ni-NTA樹(shù)脂的特點(diǎn)，進(jìn)行親和層析分離純化。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，主要是利用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)，將來(lái)自茂原鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因克隆分離后，構(gòu)建了含有該基因的重組原核表達(dá)載體pQE30xa－TGase，并在大腸桿菌JM109菌株中獲得了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)親和層析分離純化后，可以得到純度為90％左右的重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，重組后的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性達(dá)到2.2U/ml，高于原始菌株2－3倍。利用該酶進(jìn)行酪蛋白改性和重疊蝦的制作均取得良好效果。由于本發(fā)明利用大腸桿菌生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)酶活性較高，生產(chǎn)成本低，表達(dá)的酶易于分離純化，可為今后谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)提供一條切實(shí)可行的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1796561SQ20041006580
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月20日
發(fā)明者田興軍, 張智俊, 李亞玲 申請(qǐng)人:南京大學(xué)