專利名稱：六六六農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一株六六六(HCH)農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域，是利用微生物的方法降解化學農(nóng)藥殘留，適用于環(huán)境污染的治理和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
二、技術(shù)背景六六六是有機氯農(nóng)藥的一種，是40年代中期出現(xiàn)的有機合成殺蟲劑，由于它價廉，廣譜，對農(nóng)、林、牧、毛紡、儲糧、衛(wèi)生等害蟲均有效，使用安全，從而得到廣泛應用。自1962年發(fā)現(xiàn)它有殘毒及污染環(huán)境后，1970年至今，絕大多數(shù)國家已宣布禁用，我國已于1983年4月1日起停止生產(chǎn)。90年代以后，六六六在農(nóng)業(yè)上的使用僅限于印度等少數(shù)國家，但作為防治衛(wèi)生害蟲的有效化學藥劑，目前在熱帶地區(qū)的一些國家仍然得以廣泛施用，由此導致新六六六污染。
在有機氯農(nóng)藥曾經(jīng)廣泛使用的30年來，我國累計施用六六六約490萬噸，平均每畝耕地投放六六六為2~3千克。同期，國際上累計用量分別為113萬噸，我國六六六的總用量比國際上多3倍以上。六六六不易分解，難溶于水，能耐熱耐酸，溶于脂肪和有機溶劑，因而在地上、水和物體中的殘留時間長。甲體六六六在土壤中的半衰期為26年，丙體六六六為18年，乙體六六六是造成土壤污染的主要物，毒性最強，且在旱地中的持留量遠高于水稻田。并且由于它們的衍生物、代謝物在環(huán)境中保持時間也特別長和疏水親脂特性，因而在生物的每個營養(yǎng)級上都會發(fā)生富集作用。在人的母體中的有機氯農(nóng)藥不僅可以通過乳汁喂養(yǎng)間接轉(zhuǎn)移給新生兒，而且可以通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，引起下一代發(fā)生慢性中毒。而有機氯農(nóng)藥長期蓄積于脂肪導致組織器官中不易被分解或排出，故隨著體內(nèi)蓄積量的增加，對人類的潛在威脅將愈大。
有機氯農(nóng)藥的殘留以及對環(huán)境的污染，已嚴重危害著人類的健康。但目前對于已經(jīng)施用過六六六的環(huán)境的綜合治理，一直未見有比較成熟的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于針對生產(chǎn)實踐中的實際問題和需求，開發(fā)研制出一種新型的農(nóng)藥殘留降解菌劑，使用本菌劑可以使六六六農(nóng)藥的殘留量降低99％以上，且費用較低。使用該降解菌劑既可以消除環(huán)境中特別是土壤中六六六農(nóng)藥的污染，又可在農(nóng)作物的正常生長過程中正常使用六六六農(nóng)藥進行病蟲害的防治，從而保證農(nóng)產(chǎn)品中六六六農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。
技術(shù)方案 下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容一株六六六(HCH)農(nóng)藥殘留降解菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陰性的Sphingomonas sp.的菌株BHC-A，2004年9月22日寄存于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.1223，經(jīng)鑒定為鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.，主要生物學特性為兼性好氧，有極生鞭毛，G-，直或彎桿菌，具有過氧化氫酶和氧化酶活性，V.P.反應為陽性，甲基紅反應為陰性，產(chǎn)黃色色素，菌體周圍產(chǎn)莢膜，能利用葡萄糖、甘氨酸和果糖氧化產(chǎn)酸，BHC-A菌株能以六六六的α-、β-、γ-、δ-四種異構(gòu)體為唯一碳源和能源進行生長，在實驗室條件下對六六六的降解率達99％以上。
用上述的六六六(HCH)農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)的降解菌劑，是通過以下方法生產(chǎn)而成1.將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2.將上述培養(yǎng)好的菌種按1％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖質(zhì)量比為0.1％，NaCl1.0％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.25％，pH7.2-7.5；3.將種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30℃，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
有益效果 本發(fā)明提供一種消除六六六(HCH)農(nóng)藥α-、β-、γ-、δ(甲體、乙體、丙體、丁體)四種異構(gòu)體殘留的降解菌劑， BHC-A菌株能以六六六(HCH)為唯一碳源和能源進行生長，并可在短時間內(nèi)完全高效降解α-、β-、γ-、δ-HCH四種異構(gòu)體。β-異構(gòu)體的有氧生物降解一直是世界環(huán)境污染物微生物降解研究的難題。BHC-A對β-異構(gòu)體具有高效降解效率，可以在12小時內(nèi)完全礦化5mg/L的β-異構(gòu)體。
使用該發(fā)明生產(chǎn)的農(nóng)藥殘留降解菌劑具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點，適合治理環(huán)境中六六六造成的污染和在全國糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標標志的地方大面積推廣使用。本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人民的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。降解菌BHC-A能使六六六農(nóng)藥的殘留量降低99％以上，降低了生產(chǎn)和使用過程中的工作量，使生產(chǎn)和使用成本降低。使用該降解菌劑既可以消除環(huán)境中特別是土壤中六六六農(nóng)藥的污染，又可在農(nóng)作物的正常生長過程中正常使用六六六農(nóng)藥進行病蟲害的防治，從而保證農(nóng)產(chǎn)品中六六六農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。并且該菌為革蘭氏陰性菌，在田間的存活時間適當，不會影響以后農(nóng)藥使用效果。
降解菌產(chǎn)品直接施用可使土壤中農(nóng)藥六六六殘留量降低95％以上，能夠有效地消除土壤污染，緩解植株受藥害癥狀，解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥六六六殘留超標問題，可生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。該降解菌劑可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設備進行生產(chǎn)。本發(fā)明成功的解決了環(huán)境中特別是土壤中農(nóng)藥六六六農(nóng)藥的殘留超標問題，既充分發(fā)揮化學農(nóng)藥六六六在植物病蟲害防治中的高效快速的作用，生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品，又可以修復環(huán)境中六六六農(nóng)藥的污染。
四

圖1 BHC-A菌落照片和電鏡照片圖2 接種量對BHC-A降解六六六的影響圖3 初始pH對BHC-A降解六六六的影響圖4 溫度對BHC-A降解六六六的影響圖5 通氣量對BHC-A降解六六六的影響圖6 β-HCH對照與處理不同時間取樣氣相測定色譜圖a-β-HCH對照b-4小時取樣c-12小時取樣d-20小時取樣圖7 BHC-A菌株在黃瓜上的施用15天后效果圖
五具體實施例方式
1 菌株的分離和鑒定取污染土壤10g，置于100ml的無菌水中，振蕩5分鐘，即為土壤菌懸液。取5ml的菌懸液，加入到100ml的無機鹽培養(yǎng)基中，添加HCH作為唯一碳源，于30℃，180rpm搖床培養(yǎng)獲得富集液，連續(xù)稀釋涂布添加HCH的LB平板，于是我們得到一株能在培養(yǎng)基上生長并降解HCH的菌(見圖1)，命名為BHC-A，該菌經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后，進一步純化并鑒定為鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.。其主要生物學特性為兼性好氧，有極生鞭毛，G-，直或彎桿菌，具有過氧化氫酶和氧化酶活性，V.P.反應為陽性，甲基紅反應為陰性，產(chǎn)黃色色素，菌體周圍產(chǎn)莢膜，能利用葡萄糖、甘氨酸和果糖氧化產(chǎn)酸。BHC-A菌株能以六六六(HCH)為唯一碳源和能源進行生長，并可完全降解α-、β-、γ-、δ-HCH四種異構(gòu)體。在實驗室條件下對六六六的降解率達99％以上。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設備進行生產(chǎn)。
2 實驗室生物降解實驗2.1 接種量對BHC-A菌株降解HCH的影響B(tài)HC-A在SM中培養(yǎng)至對數(shù)期，以2％、5％、10％、15％的接種量接入HCH為10mg/L的基礎鹽培養(yǎng)基中，30℃、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，按一定的培養(yǎng)時間取樣，立即用正己烷提取，氣譜測定。如圖22小時測定結(jié)果顯示，2％、5％、10％、15％接種量的降解率分別為74.8％，99.1％，99.8％，100％，接種量越大，BHC-A降解γ-HCH的速率就越快。
2.2 初始pH對BHC-A菌株降解γ-HCH的影響B(tài)HC-A在SM中培養(yǎng)至對數(shù)期以2％的接種量接入初始pH為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 HCH為10mg/L的基礎鹽培養(yǎng)基中，30℃，180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，按一定的培養(yǎng)時間，隔2小時、6小時、12小時用無菌移液管取樣，立即用正己烷提取，氣譜測定。如圖32小時測定結(jié)果顯示初始pH越高，BHC-A降解HCH的速率越快。當培養(yǎng)基初始pH為4時，BHC-A對HCH的降解率即使經(jīng)過12小時也只有46％。這可能是因為HCH在酸性條件下很穩(wěn)性，而BHC-A在pH小于5時生物增長量小，從而抑制了它的降解能力。
2.3 溫度對BHC-A菌株降解HCH的影響B(tài)HC-A在SM中培養(yǎng)至對數(shù)期，以2％的接種量接入HCH為10mg/L的基礎鹽培養(yǎng)基中，分別于25℃、30℃、37℃、40℃，180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，按一定的培養(yǎng)時間取樣，立刻用正己烷提取，氣譜測定培養(yǎng)基中殘余的γ-HCH。如圖4所示2小時后測定結(jié)果顯示，20℃時，BHC-A對的降解率為44.2％；在20~30℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高BHC-A的降解性能明顯上升；在30℃時，降解能力最強。
2.4 通氣量對BHC-A菌株降解γ-HCH的影響B(tài)HC-A在SM中培養(yǎng)至對數(shù)期，以2％的接種量接入250mL分別裝有30，50，70，100，120，150mL基礎鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，HCH終濃度為10mg/L，30℃、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，按一定的培養(yǎng)時間，用無菌移液管取樣，立即用正己烷提取，氣譜測定。如圖52小時測定結(jié)果顯示，70mL裝液量的降解率最低，只有66％，其他的都在70％以上。裝液量不同對BHC-A降解γ-HCH速率的影響不大。
2.5 BHC-A菌株對β-HCH的降解BHC-A菌株在SM中培養(yǎng)至對數(shù)期，以2％的接種量接入到β-HCH為5mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，30℃、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，每隔2小時取一次樣，立即用正己烷提取后，取1μL氣譜測定培養(yǎng)基中殘留的β-HCH。測定結(jié)果如圖6。從圖中可以看出，BHC-A菌株能夠降解β-HCH，12小時內(nèi)，培養(yǎng)基中5mg/L的β-HCH全部被降解。在降解的2~12小時過程中，氣相色譜圖上一直有一個顯著的產(chǎn)物色譜峰出現(xiàn)(RTβ-HCH＝2.232min；RT產(chǎn)物＝3.632min)(如圖7a、b、c、d)，12小時以內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中β-HCH的減少該產(chǎn)物的峰面積逐漸增加，到12小時時峰面積值達到最高，然后隨著時間的延長該峰漸漸消失。對此產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定還有待于進一步研究。國內(nèi)外有關(guān)于微生物對β-HCH的降解的報道很少，這是由于在六六六的四種異構(gòu)體中，β-HCH具有獨特的化學結(jié)構(gòu)，它的化學性質(zhì)最穩(wěn)定，半衰期最長，毒性也最大。BHC-A菌株能夠完全礦化β-HCH，對菌體本身而言，降解途徑是獨特的；對于環(huán)境中六六六污染的修復具有重要的理論和實踐意義。
3 BHC-A菌株在土壤中對六六六的降解試驗從校園里采取菜園土作為供試土樣。將土樣過2-mm篩，取一定量的γ-HCH及六六六粉劑分別溶于10ml丙酮中，然后浸泡硅藻土，使農(nóng)藥被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通風櫥中吹干，將其拌入土壤中，使土壤中γ-HCH的濃度為10mg/kg，六六六粉劑的理論濃度為30mg/kg。新鮮的BHC-A培養(yǎng)液5,000rpm離心5min后，收集菌體，用無菌去離子水洗滌3次后再用無菌水懸浮，以10％的接種量接入到上述兩種土樣中。每一種土樣各取30g于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不接菌的作為對照，期間土壤的持水量保持在60％。培養(yǎng)7天后，GC測定殘留量。土壤中殘留的γ-HCH及六六六總量的檢測方法參照前面所述。測定結(jié)果如表1。
從表1可以得出，在實驗室條件下，經(jīng)過7天的培養(yǎng)后，BHC-A對10mg/Lγ-HCH的降解率達到96.9％，對α-HCH、β-HCH、δ-HCH的降解率分別為90.1％，80.7％和88.6％。以上結(jié)果說明，BHC-A菌株在施入土壤中后，沒有出現(xiàn)不產(chǎn)生降解作用或降解率急劇下降的現(xiàn)象，它的降解性能仍然穩(wěn)定和優(yōu)良，這就為BHC-A菌株作為受六六六污染的土壤修復劑提供了科學的試驗依據(jù)。
表1 BHC-A菌株在土壤中對六六六異構(gòu)體的降解土壤中六六六異構(gòu)體的殘留量 CK 處理 降解率/mg/kg0.04007±α-HCH 0.4067±0.04440 90.1％0.02259β-HCH 0.5715±0.3515 0.1101±0.04445 80.7％γ-HCH 7.197±0.1267 0.2245±0.1129 96.9％δ-HCH 0.8867±0.1207 0.1006±0.05562 88.6％4 BHC-A菌株用于黃瓜上的盆栽試驗選擇籽粒飽滿均勻的黃瓜種子(蔬春牌津研四號)，先在室溫下用水浸泡12小時，然后在30℃催芽12小時。
稱取30mg的六六六農(nóng)藥，溶于10mL的丙酮中，然后浸泡5.0g的硅藻土，使農(nóng)藥被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通風櫥中吹干，將其拌入1000g的過篩風干土中，理論上六六六總量的濃度為30mg/kg。將處理好的土樣置于花盆中，空白對照不加六六六農(nóng)藥，澆足水后放置36小時待用。共設添加菌液(BHC-A1，BHC-A2，BHC-A3)，不加菌液(CK1，CK2，CK3)和空白對照(空1，空2，空3)三個處理。在每個花盆中播種已發(fā)芽的黃瓜種子10粒，在BHC-A1，BHC-A2，BHC-A3處理中加入20mL新鮮的BHC-A培養(yǎng)液，其他的處理則加20mL的水補齊，置于室外培養(yǎng)。于15天拍照看黃瓜生長情況，并于15天時取樣測定土壤中殘留的六六六農(nóng)藥的量。從表2中可以看出，與不加菌液的CK相比，在BHC-A花盆中添加菌液后，經(jīng)過半月后，土壤中的六六六已降為0.33mg/kg，降解率達到84.3％。
表2 15天后BHC-A菌株對土壤中六六六總量的降解CK BHC-A空白降解率土壤中殘留2.099±0.3309±的六六六 0 84.3％0.1872 0.1579/mg/kg從圖7a中可以看出，不施加BHC-A菌液的CK中黃瓜秧苗產(chǎn)生嚴重的六六六藥害，生長受到明顯抑制。葉片墨綠，小而且卷曲，伸展度少，植株矮小瘦弱，從莖底部產(chǎn)生黃色枯斑，逐漸萎縮，嚴重的到15天后甚至死亡。而施加了BHC-A菌液的盆缽中，黃瓜植株健壯生長，莖直立而葉片完全伸展，這說明施用BHC-A菌液能夠消除污染土壤中的六六六農(nóng)藥，可以有效地緩解植株受害的癥狀。從15天的空白處理中和施加BHC-A菌液處理中的黃瓜生長照片(圖7b)相比較而言，施加BHC-A菌液的處理長勢略好，說明BHC-A菌株對黃瓜植株沒有不利生長的影響。
使用上述六六六農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)菌劑的工藝為斜面種一搖瓶種子液一種子罐一產(chǎn)品(包裝劑型為液體菌劑)。
本發(fā)明的詳細實施步驟為1)將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.1％(質(zhì)量比，下文同)，蛋白胨0.5％，酵母膏0.25％，pH7.2-7.5；3)將種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30℃，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
降解菌產(chǎn)品直接施用可使土壤中農(nóng)藥六六六殘留量降低95％以上，能夠有效地消除土壤污染，緩解植株受藥害癥狀，解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥六六六殘留超標問題，可生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。該降解菌劑可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設備進行生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一株六六六(HCH)農(nóng)藥殘留降解菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陰性的Sphingomonas sp.的菌株BHC-A，2004年9月22日寄存于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCCNO.1223，經(jīng)鑒定為鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.，主要生物學特性為兼性好氧，有極生鞭毛，G-，直或彎桿菌，具有過氧化氫酶和氧化酶活性，V.P.反應為陽性，甲基紅反應為陰性，產(chǎn)黃色色素，菌體周圍產(chǎn)莢膜，能利用葡萄糖、甘氨酸和果糖氧化產(chǎn)酸，BHC-A菌株能以六六六的α-、β-、γ-、δ-四種異構(gòu)體為唯一碳源和能源進行生長，在實驗室條件下對六六六的降解率達99％以上。
2.一種用權(quán)利要求1所述的六六六(HCH)農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)的降解菌劑，是通過以下方法生產(chǎn)而成1)將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按1％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖質(zhì)量比為0.1％，NaCl1.0％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.25％，pH7.2-7.5；3)將種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30℃，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效降解農(nóng)藥六六六(HCH)的菌劑，所用菌株為BHC－A，經(jīng)鑒定為Sphingomonas sp.，能以六六六(HCH)為唯一碳源和能源進行生長，并可在短時間內(nèi)完全高效降解α－、β－、γ－、δ－HCH四種異構(gòu)體，解決了β－異構(gòu)體的有氧生物降解一直是世界環(huán)境污染物微生物降解研究的難題，可以在12小時內(nèi)完全礦化5mg/L的β－異構(gòu)體，降解菌產(chǎn)品直接施用可使土壤中農(nóng)藥六六六殘留量降低95％以上，能夠有效地消除土壤污染，緩解植株受藥害癥狀，解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥六六六殘留超標問題，可生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。
文檔編號C12N1/20GK1648238SQ20041006605
公開日2005年8月3日 申請日期2004年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日
發(fā)明者李順鵬, 馬愛芝, 武俊, 張國順, 洪青, 何健, 管曉進 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學