專利名稱：導入AcInv反義基因培育抗低溫糖化馬鈴薯品系的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組DNA及其構(gòu)建，并以農(nóng)桿菌為介導轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種，培育馬鈴薯塊莖抗低溫糖化品系的方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種包含有擬南芥(Arabidopsis thaliana)rd29A啟動子(rd29A promoter)和馬鈴薯普通栽培種(Solanumer tuberosum，2n＝4X)酸性轉(zhuǎn)化酶(acidinvertase，AcInv)cDNA反向序列，能夠在植物細胞中受低溫誘導轉(zhuǎn)錄或表達酸性轉(zhuǎn)化酶反義基因的植物表達載體構(gòu)建，并以農(nóng)桿菌為介導轉(zhuǎn)化馬鈴薯普通栽培種(2n＝4X)，培育馬鈴薯塊莖抗低溫糖化品系的方法。
背景技術：
馬鈴薯為重要的糧菜兼用和工業(yè)原料作物，是世界四大作物之一。由于其耐瘠薄、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適應性廣、營養(yǎng)成分全和產(chǎn)業(yè)鏈長，而受到全世界的高度重視。根據(jù)國際馬鈴薯中心(CIP)的粗略估計，全世界用于直接食用的馬鈴薯不及總產(chǎn)量的1/2，其余都用于深加工。在一些發(fā)達國家，馬鈴薯加工所占比重一般都在70％，甚至有的國家高達80％以上，并有一系列配套的加工型品種。雖然我國馬鈴薯種植面積占全世界馬鈴薯播種面積的近1/4，總產(chǎn)約占1/5，其栽培面積和總產(chǎn)均居世界首位(張長生.面向21世紀的中國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)一馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與西部開發(fā).哈爾濱，哈爾濱工程大學出版社，2000，10-13)，但加工業(yè)一直比較落后，加工比重還不到總產(chǎn)量的20％，豐富的資源優(yōu)勢未得到充分開發(fā)利用，馬鈴薯生產(chǎn)效益仍然較低。要保持我國馬鈴薯生產(chǎn)的優(yōu)勢，必須以加工業(yè)為支撐，通過產(chǎn)品的深加工增值來帶動馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
用于加工的馬鈴薯原料品種要求比一般糧菜兼用型品種高，不但要高產(chǎn)、抗病，而且對塊莖外觀及內(nèi)含物還有嚴格的要求，其中塊莖干物質(zhì)含量和還原糖含量是加工型品種的兩項重要指標。一般要求作為加工原料的品種其塊莖比重要大于1.080，干物質(zhì)含量在20％以上。用于油炸薯片、薯塊的品種，其塊莖還原糖(主要是葡萄糖、果糖)含量應小于0.1％(鮮重)，上限不超過0.3％(樊民夫，高艮奎.面向21世紀的中國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)—馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與西部開發(fā).2001，84-87)。
由于我國傳統(tǒng)的馬鈴薯消費習慣是用于鮮食，品種選育也以高產(chǎn)、抗病為主要目標，育成品種大多為糧菜兼用型，淀粉含量多在12％～16％之間，適于加工的高淀粉品種奇缺。近年來，通過引進和自育篩選出了一些高淀粉含量的品種，基本上滿足了加工企業(yè)的要求。但這些品種還原糖含量普遍偏高，尤其在低溫貯藏條件下塊莖的還原糖含量增高，嚴重影響到加工產(chǎn)品質(zhì)量。因此，選育低還原糖含量和抗低溫糖化的品種已成為當前馬鈴薯育種工作的一項緊迫任務。
馬鈴薯塊莖還原糖含量高低既由遺傳因素控制，又受貯藏條件的影響。在諸多環(huán)境因素中低溫是造成還原糖含量增加的主要影響因子。用于加工的馬鈴薯塊莖收獲后，一般都要經(jīng)過一段貯藏期，在此期間因病害侵襲、抽芽和失水易造成腐爛損失?？刂平巡負p失的措施有噴施促休眠化學藥劑或采用低溫貯藏方法。由于化學藥劑處理會造成殘毒，一般禁止使用；利用農(nóng)民地窖貯藏，隨具有方便、安全和成本低的突出優(yōu)點，但由于地窖貯藏利用的是自然低溫，在嚴冬季節(jié)常低于10℃，往往會引起塊莖還原糖含量的增加，即所謂的冷糖化(cold-sweetening)。發(fā)生糖化的塊莖用于淀粉加工則出粉率較低；用作油炸食品原料時，則在高溫油煎過程中發(fā)生非酶促的邁拉爾德反應(Maillar-typereaction)，即細胞中還原糖與自由氨基酸發(fā)生反應生成褐色并帶有苦味的物質(zhì)，嚴重影響到食品的風味和觀感(Shailenberger et al..J.Agric.FoodChem.，1959，7274-277；Pressy et al..Arvh.Biochem.Biophys.，1966，133667-674；Samotus et al..Potato Res.，1974，1764-81；Eileen.PlantPhysiol.，1991335-341；Vayda et al..Potato Genetics，CBA InternationPress，Oxon UK，1994250-251)。因此，控制塊莖中的還原糖含量，對提高其加工產(chǎn)品的品質(zhì)是極為重要的。
一般降低塊莖還原糖含量的措施有兩種一是回暖(reconditioning)，二是品種選育(Samotus et al.，Potato Res.，1994，1764-81)。回暖是指低溫窖藏下的塊莖出窖后，再在10℃以上環(huán)境中放置一段時間，使體內(nèi)還原糖通過自身呼吸消耗掉(Bruton et al..Eur.Potato J.，1969，1281-95)，從而降低塊莖中還原糖含量。實施回暖措施不但需要一定的場地設施和增加生產(chǎn)工序，而且會造成原料無謂的消耗，必然會增加生產(chǎn)成本，一般難于被加工企業(yè)所采用。相對而言，通過育種途徑培育低還原糖含量和低溫下還原糖不升高的品種，利用自然低溫地窯貯藏，根據(jù)加工企業(yè)的需求按計劃供給原料，則可使加工企業(yè)生產(chǎn)成本大幅度下降。應當說這是解決塊莖低溫糖化最為經(jīng)濟有效的措施。
雖然馬鈴薯塊莖還原糖含量高低在品種間存在較大的差異，通過育種途徑有可能培育出還原糖含量低的品系。但遺憾地是，利用低還原糖無性系與普通品種雜交，其后代分布傾向于高還原糖親本，低還原糖后代所占比率極低，通過常規(guī)育種方法來選育還原糖含量及塊莖抗低溫糖化的品種，將是極其困難和非常耗時的(Eileen et al..Plant Physiol，1991，335～341)。于是，人們企圖通過基因工程技術來控制低溫糖化代謝過程，培育塊莖低還原糖含量和抗低溫糖化的品系。
分子生物學研究表明，反義RNA(antisense RNA)技術是控制特定基因(靶基因)表達的一條有效途徑。反義RNA技術成功應用的第一件事例是耐貯性番茄品種的培育。目前這一技術已應用到瓜菜花卉保鮮、某些人類疾病的控制等方面，其成功的事例也越來越多，這就啟迪我們采用反義RNA技術來抑制塊莖低溫糖化過程中的關鍵酶基因，以培育塊莖低還原糖含量和抗低溫糖化的品種。
根據(jù)馬鈴薯塊莖中糖類轉(zhuǎn)化機制，在淀粉降解代謝過程中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UGPase)和轉(zhuǎn)化酶(invertase)是兩個重要的酶(Bruton et al..Eur.Potato J.，1969，1281-95；Samotus et al..Potato Res.，1974，1764-81)。1993年，Zrenner克隆并構(gòu)建了UGPase反義基因植物表達載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株中UGPase活性受到明顯抑制，其活性較對照下降了95％～96％。但遺憾的是，剩余的UGPase活性仍使淀粉——還原糖轉(zhuǎn)化過程照常進行，說明控制UGPase活性并不能有效地降低低溫糖化代謝過程(Zrenner et al..Planta，1993，190247-252)。轉(zhuǎn)化酶包括中性轉(zhuǎn)化酶(nautral invertase)和酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase，AcInv)，其作用都是催化蔗糖降解產(chǎn)生己糖。中性轉(zhuǎn)化酶在生長的植株體內(nèi)含量較高，其作用與合成代謝密切相關，而在冷藏塊莖中的含量波動很小，活性也很低，幾乎與冷藏塊莖低溫糖化作用無關(Zrenner et al..Planta，1996，198246-252)。AcInv則與塊莖冷糖化作用密切相關，Pressey的研究指出低溫貯藏塊莖中AcInv具有最大活性(Pressey.Arvh.Biochem.Biophys.，1966，133667-674)。低溫糖化代謝過程中，AcInv催化蔗糖水解為轉(zhuǎn)化糖的反應是不可逆的。生化代謝調(diào)控理論認為，一般催化不可逆反應的酶往往是影響整個代謝途徑的限速酶，也是代謝調(diào)控的關鍵部位，所以，AcInv被認為是低溫糖化代謝過程中的關鍵酶。據(jù)此我們認為，抑制AcInv活性有可能成為控制塊莖低溫糖化的突破口。
到目前為止，有關AcInv的分子生物學研究報道較少。Zhou等最早從低溫貯藏塊莖中克隆了AcInv cDNA全長序列(Plant Physiol.，1994，106397-398)。此后，Zrenner等構(gòu)建了由花椰菜花葉病毒35S啟動子(cauliflower mosaic virus 35S promoter，CaMV 35S)驅(qū)動的AcInv反義基因植物表達載體，轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種得到轉(zhuǎn)基因植株，其塊莖在低溫貯藏條件下雖然可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)總量沒有變化，但還原糖/蔗糖的比率下降(Planta，1996，198246-252)，說明對AcInv基因的反義抑制可有效地控制蔗糖的降解。但CaMV 35S啟動子是一種組成型表達啟動子，在植物的任何組織、任何條件下都會啟動它所控制的基因表達。這種表達模式不但在能量代謝上是一種無謂的浪費，還有可能對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。在生產(chǎn)上，馬鈴薯多以塊莖作為繁殖材料，種薯萌發(fā)過程中體內(nèi)貯藏的淀粉必須轉(zhuǎn)化為可溶性糖才能被新生組織和器官所利用，其中轉(zhuǎn)化酶的作用是非常重要的。盡管有研究指出，在馬鈴薯塊莖萌發(fā)和植株生長期，以中性轉(zhuǎn)化酶的作用為主，但并未排除AcInv的作用(Isherword.Phytochemistry，1976，1533-41)。如果在正常生長期，植株體內(nèi)的AcInv作用仍受到抑制，也許對生長發(fā)育產(chǎn)生負面影響。由于塊莖發(fā)生糖化的環(huán)境誘導因子是低溫，如果將AcInv反義基因置于低溫誘導啟動子之下，在正常溫度條件下使反義基因的轉(zhuǎn)錄停止或轉(zhuǎn)錄水平極低，則對內(nèi)源性AcInv活性影響甚微或不產(chǎn)生影響；一旦塊莖處于低溫條件下，低溫誘導型啟動子則驅(qū)動AcInv反義基因的轉(zhuǎn)錄，抑制內(nèi)源性AcInv基因的轉(zhuǎn)錄或表達，使AcInv引起的糖化作用降低到最低，這樣就有可能防止塊莖發(fā)生低溫糖化。
鑒于以上考慮，我們研究的總體思路是設計一種低溫誘導的AcInv反義基因表達模式，使轉(zhuǎn)基因植株中AcInv反義基因在正常溫度條件下處于一種沉默狀態(tài)，而在低溫貯藏條件下高效轉(zhuǎn)錄，以抑制塊莖內(nèi)源性AcInv基因的表達，達到抗低溫糖化的目的。
到目前為止，從植物中分離鑒定出的低溫誘導啟動子主要有油菜的bn115、擬南芥的rd29A、cor15A和adh、小麥的wes120和玉米的mlip15等基因啟動子，其中rd29A啟動子在植物基因表達調(diào)控方面的作用被人們所重視(Yamaguchi-Shinozaki et al..Plant Cell，1994，6251-264)。許多研究結(jié)果表明，rd29A啟動子在低溫下可驅(qū)動它所控制的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，此外它還受干旱、高鹽滲透脅迫或外源脫落酸(ABA)的誘導而上調(diào)所控制基因的表達(Xiong et al..Plant Physiol.，1999，119205-212)。因此，我們選用了rd29A啟動子控制的AcInv反義基因表達模式。
利用遺傳轉(zhuǎn)化技術把外源基因?qū)胫参锛毎?，并整合到基因組中是植物基因工程的主要環(huán)節(jié)。目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導法、花粉管通道法、基因槍法、超聲波法、電激法和激光微束導入法等，其中農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前研究最多、機理最清楚、技術方法最成熟、應用最廣泛的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，第一批能表達外源基因的轉(zhuǎn)基因植物就是通過根癌農(nóng)桿菌介導法獲得的，迄今所獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中，有80％是利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)產(chǎn)生的(李衛(wèi)等.科學通報，2000，45(8)798-807)。利用基因工程技術培育馬鈴薯品種的研究中，以農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化成功的事例也最多，但也存在基因型依賴性和轉(zhuǎn)化效率不高的問題，如何進一步提高轉(zhuǎn)化效率仍然是當前需要解決的主要問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種低溫誘導型啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因植物表達載體的構(gòu)建方法，即構(gòu)建含有rd29A啟動子(rd29A promoter)，它可受低溫誘導驅(qū)動馬鈴薯普通栽培種(Solanum tuberosum，2n＝4X)酸性轉(zhuǎn)化酶(AcInv)cDNA反向序列轉(zhuǎn)錄和表達的載體，轉(zhuǎn)化馬鈴薯普通栽培種獲得轉(zhuǎn)基因植株，其塊莖在正常溫度條件下AcInv反義基因不轉(zhuǎn)錄，而受低溫誘導時應高效轉(zhuǎn)錄，以抑制內(nèi)源性AcInv基因的表達，從而提高塊莖抗低溫糖化的能力，降低塊莖還原糖含量。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用農(nóng)桿菌介導法將目的基因?qū)腭R鈴薯普通栽培品種的優(yōu)化方法，以提高轉(zhuǎn)化效率，獲得轉(zhuǎn)基因品系。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先從擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組DNA克隆了rd29A啟動子(SEQ ID NO 1)，從低溫誘導下的馬鈴薯普通栽培品種“農(nóng)薯3號”塊莖中克隆了AcInv基因cDNA(SEQ ID NO 2)，用rd29A啟動子和AcInv基因cDNA片段替換植物表達載體pBI121上的CaMV 35S啟動子和GUS基因，構(gòu)建成低溫誘導型rd29A啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因植物表達載體pBIAc。然后用直接導入法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，獲得具有rd29A啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因農(nóng)桿菌工程菌，再利用低溫誘導型rd29A啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因農(nóng)桿菌工程菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種，培育塊莖抗低溫糖化品系。
本發(fā)明對農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系進行了研究，通過對培養(yǎng)基組分、受體材料、受體對Kan的敏感性、預培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌濃度、浸染時間、共培養(yǎng)時間以及轉(zhuǎn)化受體材料的褐化防止等方面的研究，建立了較好的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，使農(nóng)桿菌介導的rd29A啟動子驅(qū)動的馬鈴薯AcInv反義基因轉(zhuǎn)化效率達到了0.501％，高于目前報道的馬鈴薯轉(zhuǎn)化率(0.1％)。利用該方法，獲得了2個轉(zhuǎn)基因品系，其中“Ac轉(zhuǎn)大西洋”塊莖干物質(zhì)、淀粉和還原糖含量分別為24.53％、19.96％和0.05％，其還原糖含量比對照品種“大西洋”低89.5％；“Ac轉(zhuǎn)甘2”塊莖干物質(zhì)、淀粉和還原糖含量分別為27.93％、21.30％和0.44％，其還原糖含量比對照品種低59.8％。在低溫(4℃±2℃)貯藏4周后，“Ac轉(zhuǎn)大西洋”品系的塊莖還原糖含量變?yōu)?.08％，比對照低91.3％；“Ac轉(zhuǎn)甘2”品系塊莖還原糖含量為0.48％，比對照降低了79.6％。證明了采用低溫誘導啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法，是培育馬鈴薯塊莖抗低溫糖化品系的一種有效方案。目前國內(nèi)外尚未有相同的報道。


圖1 從擬南芥DNA擴增Rd29A啟動子的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2～3擬南芥基因組DNA為模板PCR擴增產(chǎn)物圖2 克隆載體pUCRD酶切(Hind III+Bam HI)產(chǎn)物電泳結(jié)果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2Hind III+Bam HI酶切pUCRD的產(chǎn)物圖3 克隆載體pUCRD的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2～3以pUCRD質(zhì)粒為模板PCR擴增產(chǎn)物圖4 低溫誘導型啟動子rd29A的克隆載體圖譜圖5 CaMV35S啟動子驅(qū)動的GFP基因植物表達載體圖譜圖6 rd29A低溫誘導啟動子驅(qū)動的GFP基因植物表達載體圖譜圖7 轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細胞中GFP的表達顯微觀察(20X)A～B28℃、弱光(1000lux)條件下洋蔥表皮細胞中GFP的表達C～D4℃、弱光(1000lux)條件下洋蔥表皮細胞中GFP的表達A和CpBIG轉(zhuǎn)化細胞；B和DpBIRG轉(zhuǎn)化細胞。
圖8 馬鈴薯塊莖RNA RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2以馬鈴薯塊莖RNA為模板的RT-PCR產(chǎn)物圖9 AcInV基因的克隆載體圖譜圖10 AcInv基因反義植物表達載體(pBIRA)酶切檢測結(jié)果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2(HindIII+BamHI)雙酶切pBIRA的電泳檢測結(jié)果圖11 rd29A低溫誘導型啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因的植物表達載體圖譜圖12 AcInv反義基因農(nóng)桿菌工程菌的PCR檢測瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Lane 1λDNA/EcoR I+Hind III MarkersLane 2～5轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物圖13 對馬鈴薯不同受體材料的轉(zhuǎn)化效果A.試管苗莖段 B.試管薯薯片 C.試管苗葉片 D.試管苗莖段E.微型薯薯片 F.試管苗莖段轉(zhuǎn)化再生苗圖14 轉(zhuǎn)化苗的Southern bloting檢測結(jié)果1.Dig標記的DNA Markers 2.大西洋轉(zhuǎn)化植株DNA3.甘農(nóng)薯2號轉(zhuǎn)化植株DNA 4.布爾班克轉(zhuǎn)化植株DNA5.夏伯蒂轉(zhuǎn)化植株DNA 6.pBIRA/Bam HI+SacI7.大西洋未轉(zhuǎn)化植株DNA圖15 “Ac轉(zhuǎn)大西洋”和“Ac轉(zhuǎn)甘2”品系微型薯A.Ac轉(zhuǎn)大西洋 B.Ac轉(zhuǎn)甘2圖16 “Ac轉(zhuǎn)大西洋”和“Ac轉(zhuǎn)甘2”品系大田表現(xiàn)A.Ac轉(zhuǎn)大西洋 B.Ac轉(zhuǎn)甘2圖17 轉(zhuǎn)基因品系與對照品種的薯塊比較圖18 本發(fā)明的植物表達載體構(gòu)建流程圖具體實施方式
實施例1.擬南芥rd29A啟動子的克隆根據(jù)Yamaguchi-Shinozaki等(1994)報道的rd29A基因啟動子核苷酸序列(GenBankD13044，gi285614)設計并合成如下成對引物Hind III引物R15’-AAG CTTAAC GCA TGA TTT GAT GGA GGA-3’Bam HI引物R25’-GGA TCCCTT TCC AAT AGA AGT AAT CAA ACC-3’
以擬南芥總DNA為模板，通過PCR擴增(94℃，3min預變性；94℃40sec，55℃40sec，72℃1.5min，循環(huán)30次擴增；72℃10min補平)得到約0.95kb的特異片段(圖1)。
用PCR Fragment Recovery Kit回收0.95kb的特異片段，在T4 DNA連接酶的作用下，將回收的特異片段與pUCm-T Vector連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂板(含有50mg/L Amp的LB固體培養(yǎng)基)后37℃過夜培養(yǎng)。挑選隔離良好的白色單菌斑搖菌。收集菌體，采用堿裂解法微量提取質(zhì)粒。通過滯后質(zhì)粒篩選、酶切(圖2)和PCR鑒定(圖3)，篩選的重組子提交上海聯(lián)合基因科技有限公司進行測序，測序結(jié)果為SEQ ID NO 1。將測序結(jié)果SEQ ID NO1與GenBank中的rd29A基因啟動子序列(D13044，gi285614)進行同源性比較，相同率達到98.12％，其主要調(diào)控區(qū)域如TATA box和低溫響應元件(lowtemperature response element，LTRE)未發(fā)生任何改變，確證得到rd29A基因啟動子。將此重組質(zhì)粒命名為pUCRD(圖4)。
實施例2.擬南芥rd29A啟動子驅(qū)動的GFP基因植物表達載體構(gòu)建及rd29A啟動子活性檢測綠色熒光蛋白(green-fluorescent protein，GFP)是一些腔腸動物所特有的生物熒光素蛋白，其基因在異源細胞中的表達研究表明在藍光激發(fā)下，轉(zhuǎn)化細胞中的GFP都能發(fā)出綠光，即發(fā)射團的形成無物種特異性，也不需要特異的輔助因子?；谶@一特點GFP基因作為新型標記或報告基因已廣泛應用于各種生物。在我們的研究中，采用GFP基因的瞬時表達水平檢測，以確定rd29A啟動子的活性。
1.擬南芥rd29A啟動子驅(qū)動的GFP基因植物表達載體構(gòu)建將我們已經(jīng)構(gòu)建的植物表達載體pBIG(圖5)(CaMV 35S+GFP基因)，用Hind III和Bam HI雙酶切，回收大片段；用同樣的兩個限制酶酶切pUCRD，回收小片段；將回收的兩個片段混合，用T4 DNA連接酶進行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂板(含有Amp的LB固體培養(yǎng)基)后37℃過夜培養(yǎng)；挑選白色單菌斑搖菌，采用堿裂解法微量提取質(zhì)粒；通過滯后質(zhì)粒篩選、酶切和PCR鑒定篩選出重組子，將此重組質(zhì)粒命名為pBIRG(圖6)。由于此質(zhì)粒是用rd29A基因啟動子替換pBIG上的CaMV35S，加之是雙酶切產(chǎn)物的連接，可達到定向連接的目的，使rd29A啟動子位于GFP基因的上游。所以此載體是rd29A啟動子驅(qū)動的GFP基因植物表達載體。至此，獲得了具有CaMV 35S啟動子驅(qū)動和rd29A基因啟動子驅(qū)動的GFP基因兩種植物表達載體(pBIG和pBIRG)。這兩種載體的結(jié)構(gòu)示意如下 2.Rd29A啟動子活性檢測將啟動子加在報告基因的上游，然后檢測報告基因的表達水平可用來衡量啟動子的活性?；虻乃矔r表達是檢測啟動子和增強子活性的常用方法。由于我們構(gòu)建的pBIG和pBIRG載體中都具有GFP基因，檢測GFP的熒光強度，就可以確定啟動子的活性。本研究用基因槍分別以包被pBIG和pBIRG質(zhì)粒DNA的鎢粉轟擊洋蔥表皮組織，在熒光顯微鏡下觀察被處理的組織中熒光強度，用以比較rd29A啟動子和CaMV 35S啟動子驅(qū)動的GFP基因表達水平，進而確定rd29A啟動子的活性和特點。
用基因槍轟擊洋蔥表皮組織前，先將洋蔥表皮組織進行滅菌消毒，然后接種到含有滲透劑(0.25mol/L甘露醇+0.25mol/L山梨醇，用于維持細胞正常滲透壓)的MS固體培養(yǎng)基中(Φ9cm培養(yǎng)皿)，在人工氣候箱中，無菌、28℃±2℃、弱光(1000lux)條件下預培養(yǎng)4～6h。然后用基因槍分別將包被pBIG、pBIRG質(zhì)粒DNA的鎢粉(Φ1.2nm，Bio-Rad產(chǎn)品)轟擊預培養(yǎng)的洋蔥表皮組織。接著以28℃±2℃、弱光(1000lux)條件下將基因槍轟擊后的洋蔥表皮組織進行過渡培養(yǎng)3h，以利于受轟擊細胞的恢復。此后，將過渡培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化材料各分為兩批，一批繼續(xù)在28℃±2℃、弱光(1000lux)條件下培養(yǎng)，另一批則置于4℃±2℃、弱光(1000lux)條件下培養(yǎng)10h，用熒光顯微鏡進行觀察。
根據(jù)觀察結(jié)果，在不同溫度條件下rd29A啟動子和CaMV 35S啟動子驅(qū)動GFP基因表達有明顯差異。在28±2℃、弱光(1000lux)條件下，pBIG質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細胞的綠色熒光強度(圖7-A)高于pBIRG質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的表皮細胞(圖7-B)，說明正常溫度條件下CaMV 35S啟動子的活性要高于rd29A啟動子；相反的，在4℃±2℃、弱光(1000lux)條件下，pBIRG質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的表皮細胞中，綠色熒光強度(圖7-C)明顯強于pBIG質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的表皮細胞(圖7-D)，說明rd29A啟動子是一受低溫誘導的啟動子。
實施例3馬鈴薯塊莖AcInv基因的克隆和rd29A啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因植物表達載體構(gòu)建1.馬鈴薯塊莖AcInv基因的克隆為了誘導AcInv基因的轉(zhuǎn)錄，將馬鈴薯品種“農(nóng)薯3號”塊莖貯藏于2℃條件下1-2周，然后提取總RNA。以塊莖總RNA為模板，Oligo(dT)15作引物，在AMV Reverase(AMV-RT)作用下合成cDNA第一鏈。
根據(jù)已知AcInv基因核苷酸序列(GenBankL29099.1，GI529515)設計一對特異引物PAC-1Sac I
5’-GAG CTCATG GCC ACG CAG TAC CAT TCC AG-3’PAC-2BamH I5’-GGA TCCTTA CAA GTC TTG CAA GGG GAA GGA TC-3’將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋50倍作模板，加入合成的引物(PAC-1和PAC-2)、dNTP和Taq DNA polymerase，混勻后進行PCR擴增。PCR擴增反應參數(shù)為 30cycles擴增得到分子量約1.9kb的片段(圖8)。
用PCR Fragment Recovery Kit回收PCR產(chǎn)物中分子量約為1.9kb的特異條帶。在T4 DNA連接酶的作用下，將回收片段與pUCm-T Vector(上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品，Cat.No.D0211)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α。挑選白色單菌斑、搖菌，采用堿裂解法微量提取質(zhì)粒。通過滯后質(zhì)粒篩選、酶切和PCR鑒定，初步確定為重組子，提交“賽北盛生物技術有限公司”測序。測序結(jié)果如SEQ ID NO 2所示，與GenBank中的AcInv基因序列(GenBankL29099.1，GI529515)進行同源性比較，同源率達到98.96％，確證得到AcInv基因，將此重組子命名為pGEMA(圖9)。
2.rd29A基因啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因植物表達載體的構(gòu)建分別培養(yǎng)pBIRG/E.coli DH5α和pUCAc/E.coli DH5α，提取質(zhì)粒。為了用pUCAc上的AcInv cDNA片段替換pBIRG上的GFP基因片段，同時保證將AcInv cDNA片段反向連接在rd29A啟動子之后，先根據(jù)pBIRG和pUCAc上的酶切位點對比分析，選用Sac I和BamH I分別對兩種質(zhì)粒進行酶切；分別從pBIRG質(zhì)粒和pUCAc質(zhì)粒酶切產(chǎn)物中，回收13.05kb片段和1.92kb片段；用T4 DNA Ligase將回收的兩片段連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，涂布到含Kan(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基表面，37℃過夜培養(yǎng)；次日挑取隔離良好的單菌落8個，少量搖菌，提質(zhì)粒進行酶切鑒定(圖10)，結(jié)果重組質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生的兩個片段之一與AcInv基因的分子大小相符；同時以重組質(zhì)粒為模板，用引物PAC-1和PAC-2進行PCR擴增，擴增得到的片段與AcInv基因的分子大小也相符，證明AcInv cDNA已反向插入到rd29A啟動子下游。該質(zhì)粒上AcInv反義基因上游是植物源性的rd29A基因啟動子，因此，它是AcInv反義基因的植物表達載體。將此植物表達載體命名為pBIRA(圖11)。
實施例4 農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因品系的獲得1.pBIRA向根癌農(nóng)桿菌的導入采用直接導入法(王關林等著，植物基因工程原理與技術，北京，科學出版社，1998472-473)將pBIRA導入農(nóng)桿菌LBA4404，使rd29A啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因整合到Ti質(zhì)粒，得到農(nóng)桿菌工程菌用于馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化。由于pBIRA上具有T-DNA左邊界區(qū)和右邊界區(qū)(AcInv反義基因表達單元和npt-II基因表達單元的外測)，一旦pBIRA導入農(nóng)桿菌后，就能與Ti質(zhì)粒上的T-DNA同源區(qū)段發(fā)生雙交換，使介于T-DNA左邊界區(qū)和右邊界區(qū)之間的區(qū)段置換整合到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上，而使Ti質(zhì)粒成為共合體。其具體操作方法是將轉(zhuǎn)化的pBIRA/LBA4404農(nóng)桿菌涂布到含有卡那霉素(Kan，100μg/ml)+鏈霉素(Str，25μg/ml)+利富平(Rif，25μg/ml)的YEP固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)14～18h，隨機挑取分隔良好的幾個單菌落，提取Ti質(zhì)粒。以提取的Ti質(zhì)粒做模板，用克隆AcInv基因時的特異引物進行PCR擴增，結(jié)果從挑選的四個單菌落Ti質(zhì)粒模板中均擴增出了1.92kb的DNA分子片段(圖12泳道2-5)，說明轉(zhuǎn)化獲得成功，將此轉(zhuǎn)化鑒定后的農(nóng)桿菌工程菌命名為LBRA。
2.農(nóng)桿菌介導的馬鈴薯轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立通過對培養(yǎng)基組分、受體Kan敏感性、不同受體材料、預培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌濃度、浸染時間、共培養(yǎng)時間以及防止轉(zhuǎn)化受體材料的褐化等方面的研究，初步建立了較好的轉(zhuǎn)化體系。本轉(zhuǎn)化體系的主要內(nèi)容有
①培養(yǎng)基 試管苗莖段和葉片轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基采用1/2MS，激素濃度和配比見表1。薯片培養(yǎng)所加激素種類和使用濃度與試管苗莖段和葉盤培養(yǎng)有一定差別，還需增加有機物附加成分，包括激動素(KT)、葉酸、生物素、2，4-D和水解酪蛋白等。
②受體材料 適合于作為轉(zhuǎn)化材料的是試管苗莖段，其誘導愈傷和分化的能力較強(圖13-A、D和F)；其次是薯片(圖13-B和E)，其中微型薯薯片(圖13-B)優(yōu)于大田薯塊薯片，葉盤最差(圖13-C)。
③Kan的使用濃度 莖段75mg/L，薯片75mg/L，葉盤為25mg/L。
④預培養(yǎng)時間 以莖段預培養(yǎng)2d，薯片預培養(yǎng)3d轉(zhuǎn)化效率最高。
⑤農(nóng)桿菌濃度 以OD600為0.5的濃度比較適宜，浸染時間以莖段侵染10min、葉盤5min、薯片3min效果較好。
⑥共培養(yǎng)時間 莖段以2d、葉盤3d、薯片共培養(yǎng)1d。
⑦誘導劑 在固體培養(yǎng)基表面涂以乙酰丁酰酮(AS)和1μmol/L的脯氨酸，對轉(zhuǎn)化有明顯的促進作用。
⑧轉(zhuǎn)化材料褐化的預防 防止轉(zhuǎn)化材料褐化，對提高轉(zhuǎn)化效率極為重要。在初期培養(yǎng)階段(包括預培養(yǎng)、共培養(yǎng)和選擇培養(yǎng)初期階段)置于暗處能有效的防止褐化。如果在培養(yǎng)基中加入2％PVP或水解酪蛋白，則防止褐化的效果更佳。
用以上轉(zhuǎn)化體系使農(nóng)桿菌介導的rd29A啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因轉(zhuǎn)化莖段，其轉(zhuǎn)化率平均達到了0.501％，比目前報道的馬鈴薯轉(zhuǎn)化率(0.1％)[王關林等著.植物基因工程原理與技術(第二版).北京科學出版社，2002389-402]提高了5倍。
實施例5 AcInv反義基因轉(zhuǎn)化品系及塊莖抗低溫糖化效果鑒定采用農(nóng)桿菌介導法，對目前生產(chǎn)上栽培的馬鈴薯品種“甘農(nóng)薯1號”、“甘農(nóng)薯2號”、“農(nóng)薯3號”、“Favorita”、“臺紅”、“大西洋”、“Novaly”、“甘農(nóng)科院SK13”和“甘農(nóng)科院92-24-114”等9個品系進行了遺傳轉(zhuǎn)化，從“Favorita”、“臺紅”、“大西洋”和“甘農(nóng)科院SK13品系”和“甘農(nóng)薯2號”等五個品種上得到轉(zhuǎn)基因苗。經(jīng)Southern雜交[王關林等著.植物基因工程原理與技術(第二版).北京科學出版社，2002844-854]檢測，來自“大西洋”和“甘農(nóng)薯2號”的轉(zhuǎn)化苗呈陽性(圖14)，將此轉(zhuǎn)化株系命名為“Ac轉(zhuǎn)大西洋”和“Ac轉(zhuǎn)甘2”。
將轉(zhuǎn)基因品系“Ac轉(zhuǎn)大西洋”和“Ac轉(zhuǎn)甘2”進行組織快繁，栽植在溫室蛭石中，定期噴灑營養(yǎng)液，在生長60d后收獲微型薯(圖15)，作為大田種薯。2003年將微型薯種植在甘肅省天祝藏族自治縣進行了品系鑒定(圖16)。從兩轉(zhuǎn)基因品系在田間生長狀況來看，其株型、葉型未改變，但與原來品種相比，其生長勢較旺，葉色更加深綠，葉片變大，薯型、花色產(chǎn)生變異，如Ac轉(zhuǎn)大西洋株系，其花色為淡紫色(大西洋品種為白花)、薯型變?yōu)殚L橢圓形，芽眉明顯變長且略突出(圖17)。
成熟塊莖收獲后，從各轉(zhuǎn)基因品系和相應對照品種中隨機取8個塊莖，洗凈去皮，各稱取1g薯肉，立即用液氮速凍、研磨成粉狀，轉(zhuǎn)到一2ml離心管，加入1ml 80％乙醇(含10mmol/L Hepes-KOH，pH7.4)80℃提取1～2h，然后按照Stitt等所述方法(Methods Enzymol，1989，174518-552)，取上清液測定還原糖(葡萄糖、果糖)和蔗糖含量。所剩沉淀用冷水洗兩遍后進行干燥，然后按照中國食物營養(yǎng)成分分析檢測中心提供方法——酶水解法(http//www.fh21.com.cn)測定淀粉含量。干物質(zhì)含量測定采用烘干稱重法。
對轉(zhuǎn)基因品系和對照品系塊莖干物質(zhì)含量、淀粉含量和還原糖含量測定結(jié)果表明對照品種“大西洋”塊莖的干物質(zhì)含量為20.19％，淀粉含量為17.7％，還原糖含量為0.49％；轉(zhuǎn)基因品系“Ac轉(zhuǎn)大西洋”塊莖的干物質(zhì)含量為24.53％，淀粉含量為17.9％，還原糖含量為0.08％；其還原糖含量比對照降低了83.7％。對照品種“甘農(nóng)薯2號”塊莖的干物質(zhì)含量為26.5％，淀粉含量為19.6％，還原糖含量為1.09％；轉(zhuǎn)基因品系“Ac轉(zhuǎn)甘2”品系塊莖干物質(zhì)含量為27.93％，淀粉含量為21.30％，還原糖含量為0.44％；其還原糖含量比對照降低了59.6％。
挑選大小適中的“Ac轉(zhuǎn)大西洋”、“Ac轉(zhuǎn)甘2”、“大西洋”和“甘農(nóng)薯2號”的薯塊，貯藏在低溫(4±2℃)條件下6周，然后對塊莖的還原糖含量進行測定。冷藏后的“大西洋”塊莖還原糖含量為0.92％，“Ac轉(zhuǎn)大西洋”為0.12％，“甘農(nóng)薯2號”為2.35％，“Ac轉(zhuǎn)甘2”為0.52％。與低溫貯藏前的塊莖還原糖含量相比，轉(zhuǎn)基因品系的還原糖含量增加了18％～50％，而對照品種的還原糖含量增加了1倍；“Ac轉(zhuǎn)大西洋”塊莖的還原糖含量比“大西洋”低86.9％，“Ac轉(zhuǎn)甘2”比“甘農(nóng)薯2號”低77.8％。說明采用低溫誘導啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因植物表達載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種是培育塊莖抗低溫糖化品系的一條有效途徑。
表1 試管苗莖段、葉盤培養(yǎng)的三種激素濃度和配比尋優(yōu)結(jié)果外植體 生長激素(mg/L) 愈傷誘導 根分化芽分化NAA 0.2 0.4 06-BA 1.1250 3.4莖段GA300 4.5NAA∶6-BA∶GA31∶5∶0 1∶0∶0 0∶1∶1.2NAA 0.3 0.4 -6-BA 2.25 0 -葉盤GA300 -NAA∶6-BA∶GA31∶6∶0 1∶0∶0 -SEQ ID NO 1的信息序列特征
(A)(長度)958個堿基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)(拓撲結(jié)構(gòu))線性序列描述SEQ ID NO 1Hind III1AAGCTTAACG CATGATTTGA TGGAGGAGCC ATAGATGCAA TTCAATCAAA51 CTGAAATTTC TGCAAGAATC TCAAACACGG AGATCTCAAA GTTTGAAAGA101AAATTTATTT CTTCGATTCA AAACAAACTT ACGAAATTTA GGTAGAACTT151ATATACATTA TATGTGTAAT TTTTTGTAAC AAAATGTTTT TATTATTATT201ATAGAATTTT ACTGGTTAAA TTAAAAATGA ATAGAAAAGG TGAATTAAGA251GGAGAGAGGA GGTAAACATT TTCTTCTATT TTTTCATATT TTCAGGATAA301ATTATTGTAG AAGTTTAAAA GATTTCCATT TGACTAGTGT AAATGAGGAA351TATTCTCTAG TAAGATCATT ATTTCATCTA CTTCTTTTAT CTTCTACCAG401TAGAGGAATA AACAATATTT AGCTCCTTTG TAAATACAAA TTAATTTTCG451TTCTTGACAT CATTCAATTT TAATTTTACG TATAAAATAA AAGATCATAC501CTATTAGAAC GATTAAGGAG AAATACAATT CGAATGAGAA GGATGTGCCG551TTTGTTATAA TAAACAGCCA CACGACGTAA ACGTAAAATG ACCACATGAT601GGGCCAATAG ACATGGACCG ACTACTAATA ATAGTAAGTT ACATTTTAGG高鹽/脫水/低溫/ABA響應元件1651ATGGAATAAA TATCA CAGTTT GAAAGAAAAG GGAAAAAAAG高鹽/脫水/低溫/ABA響應元件2701AAAAAATAAA TAAAAGATAT AC GAGTTCCAA AAAGCAAAAA751AAAAGATCAA GCCGATACAG ACACGCGTAG AGAGCAAAAT GACTTTGACG801TCACACCACG AAAACAGACG CTTCATACGT GTCCCTTTAT CTCTCTCAGTTATA box851CTCTC CTTAGTGAG ACCCTCCTCT GTTTTACTCA CAAATATGCA
901AACTAGAAAA CAATCATCAG GAATAAAGGG TTTGATTACT TCTATTGGAABamH I951AGGGATCCSEQ ID NO 2的信息序列特征(A)(長度)1920個堿基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)(拓撲結(jié)構(gòu))線性序列描述SEQ ID NO 21 ATGGCCACGC AGTACCATTC CAGTTATGAC CTGGAAAACT CCGCCTCCCA51 TTACACATTC CTCCCGGATC AACCTGATTC CGGCCACCGG AAGTCCCTTA101AAATCATCTC CGGCATTTTC CTCTCCTCTT TCCTTTTGCT TTCTGTAGCC151TTCTTTCCGA TCCTCAACAA CCAATCACCG GACTTGCAGA GTAACTCCCG201TTCGCCGGCG CCGCCGTCAA GAGGTGTTTC TCAGGGAGTC TCCGATAAGA251CTTTTCGAGA TGTCGTCAAT GCTAGTCACG TTTCTTATGC GTGGTCCAAT301GCTATGCTTA GCTGGCAAAG AACTGCTTAC CATTTTCAAC CTCAAAAAAA351TTGGATGAAC GATCCTAATG GTCCATTGTA CCACAAGGGA TGGTATCATC401TTTTTTATCA ATACAATCCA GATTCAGCTA TTTGGGGAAA TATCACATGG451GGCCATGCCG TATCCAAGGA CTTGATCCAC TGGCTCTACT TGCCTTTTGC501CATGGTTCCT GATCAATGGT ACGATATAAA CGGTGTCTGG ACTGGGTCCG551CTACCATCCT ACCCGATGGT CAGATCATGA TGCTTTATAC CGGTGACACT601GATGATTATG TACAAGTGCG AAATCTTGCG TACCCCACCA ACTTATCTGA651TCCTCTCCTT CTAGACTGGG TCAAGTACAA AGGCAACCCG GTTCTGGTTC701CTCCACCCGG CATTGGTGTC AAGGACTTTA GAGACCCGAC CACTGCTTGG
751 ACCGGACCCC AAAATGGGCA ATGGCTTTTA ACAATCGGGT CTAAGACTGG801 TAAAACGGGT ATTGCACTTG TTTATGAAAC TTCCAACTTC ACAAGCTTTA851 AGCTATTGGA TGAAGTGCTG CATGCGGTTC CGGGTACGGG TATGTGGGAG901 TGTGTGGACT TTTACCCGGT ATCGACTGAA AAAACAAACG GGTTGGACAC951 ATCATATAAC GGCCCGGGTG TAAAGCATGT GTTAAAAGCA AGTTTAGATG1001ACAATAAGCA AGATCACTAT GCTATTGGGA CGTATGACTT GACAAAGAAC1051AAATGGACAC CCGATAACCC GGAATTGGAT TGTGGAATTG GGTTGAAGCT1101GGATTATGGG AAATATTATG CATCAAAGAC ATTTTATGAC CCGAAGAAAC1151AACGAAGAGT ACTGTGGGGA TGGATTGGGG AAACTGATAG TGAATCTGCT1201GACCTGCAGA AGGGATGGGC ATCTGTACAG AGTATTCCAA GGACAGTGCT1251TTACGACAAG AAGACAGGGA CACATCTACT TCAGTGGCCA GTTGAAGAAA1301TTGAAAGCTT AAGAGCGGGT GATCCTATTG TTAAGCAAGT CAATCTTCAA1351CCAGGTTCAA TTGAGCTACT CCATGTTGAC TCAGCTGCAG AGTTGGATAT1401AGAAGCCTCA TTTGAAGTGG ACAAAGTCGC GCTCCAGGGA ATAATTGAAG1451CAGATCATGT AGGTTTCAGC TGCTCTACTA GTGGAGGTGC TGCTAGCAGA1501GGCATTTTGG GACCATTTGG TGTCGTTGTA ATTGCTGATC AAACGCTATC1551TGAGCTAACG CCAGTTTACT TCTACATTTC TAAAGGAGCT GATGGCCGAG1601CTGAGACTCA CTTCTGTGCT GATCAAACCA GATCCTCAGA GGCTCCGGGA1651GTTGCTAAAC AAGTTTATGG TAGTTCAGTA CCCGTGTTGG ACGGTGAAAA1701ACATTCGATG AGATTATTGG TGGACCACTC AATTATGGAG AGCTTTGCTC1751AAGGAGGAAG AACAGTCATA ACATCGCGAA TTTACCCAAC AAAGGCAGTG1801AATGGAGCAG CACGACTCTT CGTTTTCAAC AATGCCACAG GGTCTAGCGT1851GACTGCCTCC GTCAAGATTT GGTCACTTGA GTCGGCTAAT ATTCAATCCT1901TCCCCTTGCA AGACTTGTAA
權利要求
1.一種包含有擬南芥Rd29A基因啟動子和馬鈴薯塊莖酸性轉(zhuǎn)化酶基因cDNA的載體pBIAc，其特征在于該載體的Rd29A基因啟動子和AcInv基因定向連接在一起，Rd29A基因啟動子位于反向AcInv基因的上游，使AcInv基因被Rd29A基因啟動子所驅(qū)動。
2.一種如權利要求1所述的載體，其中Rd29A啟動子核苷酸序列為SEQ IDNO 1。
3.一種如權利要求1所述的載體，其中酸性轉(zhuǎn)化酶基因核苷酸序列為SEQ IDNO 2。
4.一種構(gòu)建如權利要求1-3所述任一載體的方法，所述載體包括具有權利2和3所述核苷酸序列任一片段所構(gòu)建的載體。
5.一種含有如權利要求1-3所述任一載體的微生物克隆。
6.一種權利要求1-3所述任一載體的用途，其特征在于以各種基因?qū)敕椒?，包括農(nóng)桿菌介導法和直接導入法等轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化馬鈴薯任一品種，用以抑制馬鈴薯塊莖低溫糖化現(xiàn)象的發(fā)生。
7.一種以農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化馬鈴薯材料，將權利要求1-3所述任一載體導入馬鈴薯品種，培育塊莖抗低溫糖化品系的方法，該方法包括(1)農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化受體材料是馬鈴薯普通栽培種品種；(2)所使用的轉(zhuǎn)化組織是馬鈴薯普通栽培品種莖段、葉片、薯塊等。
全文摘要
一種低溫誘導型啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因植物表達載體構(gòu)建及抗低溫糖化馬鈴薯品系培育方法，從擬南芥菜葉片克隆了低溫誘導型Rd29A啟動子和馬鈴薯普通栽培種塊莖酸性轉(zhuǎn)化酶基因cDNA；用Rd29A啟動子片段替換植物表達載體pBI121上的組成型表達啟動子－CaMV 35S啟動子，并將AcInv基因cDNA片段反向插入到Rd29A啟動子和NOS終止子之間，建成了Rd29A啟動子驅(qū)動的低溫誘導型AcInv反義基因植物表達載體pBIAc；用直接導入法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，獲得了由低溫誘導型Rd29A啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因農(nóng)桿菌工程菌。還提供了一種利用低溫誘導型Rd29A啟動子驅(qū)動的AcInv反義基因農(nóng)桿菌工程菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種，培育塊莖抗低溫糖化品系的方法。利用該方法，獲得了“Ac轉(zhuǎn)大西洋”和“Ac轉(zhuǎn)甘2”兩個轉(zhuǎn)基因品系，其中“Ac轉(zhuǎn)大西洋”塊莖還原糖含量為0.08％；“Ac轉(zhuǎn)甘2”塊莖還原糖含量為0.44％。在低溫(4℃±2℃)貯藏6周后，“Ac轉(zhuǎn)大西洋”品系塊莖還原糖含量為0.18％；“Ac轉(zhuǎn)甘2”品系塊莖還原糖含量為0.52％。
文檔編號C12N5/10GK1618976SQ200410068868
公開日2005年5月25日 申請日期2004年7月13日 優(yōu)先權日2004年7月13日
發(fā)明者張金文, 王蒂, 孟亞雄, 關彥榮, 王清, 黃慧英, 于品華, 白斌, 王旺田, 李學才, 張寧 申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學