專利名稱：一種編碼絲狀支原體絲狀亞種n端脂蛋白的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA，尤其涉及一種編碼絲狀支原體絲狀亞種N端脂蛋白的DNA、其制備方法、其編碼的蛋白質(zhì)及其在醫(yī)藥上的用途。
背景技術(shù)：
絲狀支原體絲狀亞種SC型(Mycoplasma mycoide subsp.mycoides SC，MmmSC)是引起牛傳染性胸膜肺炎(Contagious Bovine Pleuroneumonia，CBPP)的病原，該病又稱牛肺疫，主要以肺小葉間淋巴管漿液—滲出性纖維素性炎和漿液纖維素性胸膜肺炎為特征，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病。該病危害嚴(yán)重，這不僅是由于較高的發(fā)病率和死亡率，更是由于其嚴(yán)重地限制了牛及牛肉制品的對外貿(mào)易。因此有該病流行的國家，對其的控制和消滅都非常重視。CBPP常表現(xiàn)為亞急性或無臨床癥狀感染，這給該病的消滅帶來很大困難。在無牛肺疫國家血清學(xué)監(jiān)測和屠宰場肉品監(jiān)測成為控制該病爆發(fā)和流行的重要手段。
從感染動物分離到絲狀支原體絲狀亞種SC生物型對于CBPP的最終診斷是必須的。MmmSC營養(yǎng)需求非常復(fù)雜，依賴于多種營養(yǎng)基質(zhì)，包括維生素、核苷酸、類脂化合物、脂肪酸和氨基酸。絲狀支原體絲狀亞種在液體培養(yǎng)基中繁殖需要包括大量血清作為糖的來源。通氣培養(yǎng)可以增加絲狀支原體絲狀亞種培養(yǎng)速度。在生長比較快的培養(yǎng)基中絲狀支原體絲狀亞種呈絲狀生長，在培養(yǎng)到達(dá)終點主要呈現(xiàn)串珠狀、短絲狀，最后僅有少量小球狀。
在超過半個世紀(jì)的時間中有幾種血清學(xué)方法被描述，其中包括玻片凝集試驗(SAT)，補體結(jié)合試驗(CFT)，瓊脂擴散試驗(AGP)，被動血凝抑制試驗(PHA)和微量凝集試驗(MA)。這些試驗的局限性也已經(jīng)被證明。酶聯(lián)免疫試驗雖然具有很好的敏感性而且操作更加方便，但是CFT方法仍然被建議在歐洲和非洲繼續(xù)使用。PHA方法看起來實用，在篩選檢查時敏感性比CFT高出20％，但在從未發(fā)生CBPP的地區(qū)假陽性約有2％。
Onoviran and Taylor-Robinson在1979年首次報道了CBPP的酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)。Poumarat(1989)應(yīng)用ELISA、CFT、PHA等幾種方法對bovinegroup7、M.capricolum subsp.capricolum、M.mmLC和M.mycoides subsp capri等菌株感染牛的抗體反應(yīng)進行監(jiān)測并進行比較。用M.mmSC株制成的ELISA抗原比CFT或PHA更加特異，在bovine group7和M.mmLC感染牛特定時期內(nèi)檢測出的抗體滴度較高。Le Goff(1989，1990)應(yīng)用ELISA和CFT對M.mmSC感染和對照的5頭牛進行了檢測。在血清陽轉(zhuǎn)前1-2周氣管洗液中就能夠分離到支原體。補體結(jié)合抗體比ELISA抗體早幾周出現(xiàn)，但是與CFT不同的是，ELISA抗體在病原體排泄期間和排泄之后都呈陽性。
吳裕祥等(1988)報道了一個微量凝集試驗并與CFT進行了比較，證明MA更敏感、特異，操作簡便，適用于大量樣品的監(jiān)測。
支原體感染的最終確認(rèn)通常依靠生長抑制試驗(GI)或免疫熒光試驗(IF)。這些試驗?zāi)軌騾^(qū)分2個支原體亞種，但不能區(qū)分LC和SC兩個生物型。Poumarat(1991)建立了一種快速斑點免疫結(jié)合試驗，其主要優(yōu)點是快速并適合大量樣品的檢測。
到目前為止補體結(jié)合試驗(CFT)仍然是OIE推薦使用最為廣泛的一種血清學(xué)診斷方法。該方法在CBPP流行的急性期較為敏感，在急性期過后或感染3個月后，其敏感性大大降低。
Le Goff和Thiaucourt從133株支原體中篩選出1株特異性單抗，該單抗能夠識別一種分子量約為80KDa的MmmSC抗原決定簇并建立了用于CBPP血清學(xué)診斷的競爭ELISA(C-ELISA)方法。我們引進了CFT和C-ELISA兩種診斷試劑，發(fā)現(xiàn)C-ELISA方法對CFT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測為陰性，而且其所識別的約80KDa的蛋白質(zhì)抗原性尚未確定。所以C-ELISA診斷方法的應(yīng)用還需做大量的試驗來予以確認(rèn)。
脂蛋白LppQ的抗原性已經(jīng)確定并廣泛認(rèn)為存在于MmmSC非洲株、歐洲株和疫苗株，而在絲狀支原體簇的其他成員中未發(fā)現(xiàn)。據(jù)報道LppQ基因的N末端編碼的脂蛋白在自然感染和試驗感染牛體內(nèi)均可誘導(dǎo)產(chǎn)生強大的早期免疫反應(yīng)，且抗體持續(xù)期長，是一種比較理想的診斷抗原。
但是通過對脂蛋白LppQ全基因測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在支原體的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)中UGA并不代表終止密碼子，而代表色氨酸，而且使用頻率比UGG高得多。在體外表達(dá)中必須對目的基因進行體外誘變，將UGA改造成UGG，這樣才能進行體外表達(dá)。
MmmSC脂蛋白基因全長1764bp，閱讀框架1335bp，編碼445個氨基酸，分子量約為52.08Kda。經(jīng)過對該蛋白質(zhì)抗原性分段分析，結(jié)果表明N末端具有良好的抗原特性，在自然感染和試驗感染牛體內(nèi)均可誘導(dǎo)產(chǎn)生強大的早期免疫反應(yīng)，且抗體持續(xù)期長，是一種比較理想的診斷抗原。但在該蛋白質(zhì)閱讀框架中存在10個UGA密碼子，這些密碼子必須改造成同義密碼子UGG才能在體外進行表達(dá)。
Joachim Frey等人根據(jù)脂蛋白LppQ的抗原性對其閱讀框架1335個核苷酸進行了改造，將其中9個UGA誘變?yōu)閁GG，表達(dá)的蛋白質(zhì)分子量約為48kDa。但體外誘變脂蛋白LppQ基因的9個核苷酸操作異常復(fù)雜，成功率非常低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的編碼絲狀支原體絲狀亞種N端脂蛋白的DNA，其編碼的蛋白質(zhì)可作為抗原應(yīng)用于牛傳染性胸膜肺炎的血清學(xué)診斷。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過以下途徑來實現(xiàn)的利用體外誘變技術(shù)將脂蛋白LppQ基因閱讀框架N端582個核苷酸其中1個UGA核苷酸誘變?yōu)閁GG，其誘變后的核苷酸序列見序列表SEQ ID No.1所述，將誘變后的脂蛋白LppQ DNA序列與表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進行體外表達(dá)，將所表達(dá)的重組蛋白(其氨基酸序列見序列表SEQ ID No.2所述)收集純化后作為抗原用于牛傳染性胸膜肺炎的血清學(xué)診斷。
本發(fā)明的詳細(xì)描述首先提取支原體的基因組DNA，設(shè)計含有酶切位點的一對特異性引物，以所提取的DNA為模板進行PCR擴增，回收擴增的特異性片段經(jīng)酶切后將回收的片斷連接到PUC載體上，以該載體作為模板，加入一對載體通用引物和一對突變引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，將再次擴增到的特異性片斷連接到測序載體中進行核苷酸序列測定，經(jīng)序列測定后證實所擴增的特異性片段為所需的突變片段，將該突變目的片斷定向克隆到Pet32a載體中，在IPTG誘導(dǎo)下進行表達(dá)，SDS-PAGE顯示表達(dá)蛋白質(zhì)分子量為43Kda，利用親和層析技術(shù)對該蛋白質(zhì)進行純化，將純化后的蛋白質(zhì)作為包被抗原利用間接ELISA方法檢測牛傳染性胸膜肺炎，結(jié)果表明該抗原具有非常好的特異性和敏感性。
目前應(yīng)用的牛傳染性胸膜肺炎血清學(xué)診斷方法——補體結(jié)合試驗操作非常繁瑣，需進行專業(yè)培訓(xùn)才能進行，另外該方法尚存在特異性不高的缺點。而重組N端脂蛋白具有非常好的特異性，但脂蛋白體外表達(dá)的技術(shù)難度高，不易獲得。本項發(fā)明利用體外定點誘變技術(shù)解決了脂蛋白體外表達(dá)的技術(shù)難題，與國外進行的N端脂蛋白表達(dá)相比，本項發(fā)明采用更加簡單的方法而得到相同的效果，完全可以替代國外產(chǎn)品，重組表達(dá)的脂蛋白N端可以作為抗原用于血清學(xué)診斷，將所表達(dá)的蛋白質(zhì)作為包被抗原用間接ELISA方法檢測牛傳染性胸膜肺炎，結(jié)果表明該抗原具有非常好的特異性和敏感性，用該抗原建立的間接ELISA方法操作非常簡單，容易推廣應(yīng)用，適合進行大規(guī)模血清學(xué)調(diào)查，與國外技術(shù)相比操作更加簡單，特異性、敏感性均符合要求。


圖1 第一次PCR擴增結(jié)果圖2 第一次PCR擴增產(chǎn)物的重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖3 重組表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果圖4 重組表達(dá)蛋白Western blotting結(jié)果具體實施方式
以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
編碼絲狀支原體絲狀亞種N端脂蛋白的突變DNA的制備首先提取支原體(購買自中國獸藥監(jiān)察所)的基因組DNA，設(shè)計含有酶切位點EcoR I/Sal I的一對特異性引物，引物序列分別為A5，GCGGAATTCCCATTAGTTGTTGTTTCATGTA，3(SEQ ID No.3)和D5，GACGTCGACATTAAAGTTTCTAGCTTGTTG，3(SEQ ID No.4)，以所提取的支原體基因組DNA為模板，利用PyrobestTMDNA聚合酶和引物A、D擴增脂蛋白LppQ N末端基因，100μl反應(yīng)體系如下10xBuffer10.0μl2.5mMdNTPs 8.0μl10μmol引物A 5.0μl10μmol引物D 5.0μl模板DNA 1.0μl10u/μl Taqpolymerase1.0μl純水 70μl擴增條件為95℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，57℃退火45s，72℃延伸60s，30個循環(huán)后，72℃延伸10min。得到了582bp的特異性擴增片斷，見圖1，其中第1和第2泳道為擴增產(chǎn)物，第3泳道為DL2000Marker；將擴增的產(chǎn)物經(jīng)EcoR I/Sal I酶切，酶切結(jié)果見圖2，其中泳道1為DL2000Marker，泳道2為EcoR I/Sal I酶切結(jié)果，泳道3為EcoR I酶切結(jié)果，泳道4為Sal I酶切結(jié)果。將酶切后的擴增片斷連接到PUC載體上。設(shè)計了一對突變引物，引物序列分別5，TCTTGTTTTTGCCACTCATTTTTTG，3(SEQ ID No.5)和5，CAAAAAATGAGTGGCAAAAACAAGA，3(SEQ ID No.6)。以該重組PUC載體為模板，加入一對載體通用引物和該突變引物進行PCR擴增，100μl反應(yīng)體系如下10xBuffer10.0μl2.5mMdNTPs 8.0μl10μmol通用引物 5.0μl10μmol引物B 5.0μl10μmol引物C 5.0μl模板DNA 1.0μl10u/μl Taqpolymerase1.0μl純水 65μl
擴增條件為95℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，57℃退火45s，72℃延伸60s，30個循環(huán)后，72℃延伸10min，將獲得的特異性片斷連接到測序載體中進行核苷酸序列測定，其核苷酸序列見序列表SEQ ID No.1所述，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列見序列表SEQ ID No.2所述。
重組編碼絲狀支原體絲狀亞種N端脂蛋白的突變DNA的表達(dá)經(jīng)突變后的LppQ N末端基因和Pet32a載體(購自Navagen公司)用EcoRI/Sal I酶切，膠回收酶切片段，用T4DNA連接酶于16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布于含50μg/ml的氨基芐青霉素鈉LB細(xì)菌培養(yǎng)基平板上。挑取白色菌落，接種于LB(含50μg/ml氨基芐青霉素鈉)液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃搖床培養(yǎng)16h后，提取質(zhì)粒DNA。用PCR及限制性內(nèi)切酶鑒定重組質(zhì)粒，陽性者按1％接種LB(含50μg/ml氨基芐青霉素鈉)液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)3h后(OD值為0.6-0.8)，加入IPTG至終濃度為1mM，誘導(dǎo)3h。將培養(yǎng)液以16000g離心10min，收集菌體，將收集到的粗蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，其蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜與Westernblotting結(jié)果分別見圖3和圖4，最后使用Novagen公司蛋白純化試劑盒將所得蛋白質(zhì)純化即得。
利用補體結(jié)合試驗進行血清學(xué)檢測一、材料準(zhǔn)備1、試驗用巴比妥緩沖液，使用時作1∶5稀釋，配制方法如下巴比妥緩沖液(VB)配制氯化鈉85克巴比妥酸 5.75克巴比妥鈉 3.75克氯化美(MgCl2·6H2O) 1.68克氯化鈣(CaCl2·2H2O) 0.37克滅菌雙蒸水 2000ml用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.3。使用時用滅菌雙蒸水作1∶5稀釋。
2、綿羊紅細(xì)胞懸液使用阿氏液，制備方法如下
阿氏液配制A液葡萄糖20.5克滅菌雙蒸水200mlB液檸檬酸鈉 12.0克氯化鈉4.2克滅菌雙蒸水800ml用5％檸檬酸調(diào)節(jié)B液PH至6.1?；旌螦液、B液，用蔡氏濾器過濾除菌。
3、6％綿羊紅細(xì)胞懸液制備方法如下無菌采集健康公綿羊靜脈血，脫纖后用愛氏液懸浮，1500g洗滌3次，每次10分鐘。收集紅細(xì)胞沉淀，用愛氏液配成6％懸液，40℃放置48小時后使用，但最多使用不超過2周。
4、供試樣品所用抗原為國際標(biāo)準(zhǔn)牛傳染性胸膜肺炎補體結(jié)合試驗抗原(從普通生物試劑公司購買得到)，陽性血清、陰性血清由葡萄牙國家獸醫(yī)參考實驗室惠贈(也可從普通生物試劑公司購買得到，效果等同)，為用國際標(biāo)準(zhǔn)品。溶血素、補體由中國獸藥監(jiān)察所購買，按說明書使用。溶血素效價滴定如下溶血素效價的測定取0.1ml溶血素連續(xù)作10倍稀釋至1∶1000作為基礎(chǔ)液，其稀釋方法見表1。
表1 溶血素稀釋法 單位ml

按照表1程序加入各種試驗成份，在37-38℃水浴30分鐘，1500g離心10分鐘。將100％溶血管的液體與等體積VB混合制成50％溶血比色管。能使紅細(xì)胞液50％溶血(HD50)的溶血素最大稀釋度作為溶血素效價，使用12個單位的HD50。
如表2中第8管溶血程度達(dá)到50％，而對照管都沒有溶血現(xiàn)象，則該批溶血素的效價即為1∶8000，使用12個單位的HD50，則應(yīng)將溶血素作8000/12＝666.6倍稀釋。
表2 溶血素效價測定 單位ml

符號說明“+”抑制溶血，“±”部分溶血，“-”全部溶血。
5、致敏綿羊紅細(xì)胞制備使用12HD50(50％溶血程度)的溶血素與等體積的6％綿羊紅細(xì)胞混合，37℃水浴30分鐘，期間間隔5分鐘搖動一次。
6、補體購買自哈爾濱獸醫(yī)生物藥品廠，效價滴定方法如下使用VB稀釋補體，具體操作如表3和表4。
表3

表4

將1∶30到1∶110各稀釋度補體25μl加入96孔微量反應(yīng)板中，每個補體稀釋度孔中加入25μl抗原，25μlVB，震蕩混勻后37℃水浴30分鐘。加入25μl致敏后的綿羊紅細(xì)胞，震蕩混勻后37℃水浴30分鐘后125g離心2分鐘判定結(jié)果。
補體效價判定使綿羊紅細(xì)胞100％溶解的補體最高稀釋度即是該補體效價。檢測時使用2.5U補體。例如補體在1∶60時使綿羊紅細(xì)胞100％溶解，那么該補體效價為60，使用時應(yīng)作60/2.5＝24倍稀釋。
7、抗原效價滴定方法如下1)、用VB 2倍連續(xù)稀釋抗原，從1∶10到1∶640；2)、用VB 2倍連續(xù)稀釋陽性血清，從1∶10到1∶1280；3)、使用96孔微量反應(yīng)板對抗原進行方陣滴定。具體操作如表5。每孔分別加入對應(yīng)稀釋度的抗原25μl，陽性血清25μl，2.5U補體25μl，震蕩混勻后37℃水浴30分鐘。每孔加入致敏后的綿羊紅細(xì)胞25μl，震蕩混勻后37℃水浴30分鐘。125g離心2分鐘判定結(jié)果。同時設(shè)0.5U、1U、2.5U補體對照，致敏紅細(xì)胞對照，每個抗原稀釋度的抗補體對照。
表5

當(dāng)對照全部成立情況下，補體100％被結(jié)合的最高稀釋度陽性血清對應(yīng)的抗原最高稀釋度即是抗原效價。如表5所示，當(dāng)陽性血清1∶160，抗原1∶80時，抗原抗體復(fù)合物能夠結(jié)合100％補體，那么該抗原效價為1∶80。檢測時使用2個單位，將抗原作80/2＝40倍稀釋。
說明以上所用所有生化試劑均可從生化試劑公司購買得到。
二、試驗方法1、將被檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清均用巴比妥緩沖液作1∶10稀釋于56℃水浴中滅活30分鐘。
2、在96孔微量反應(yīng)板中，每孔加入25μl抗原，25μl被檢血清，25μl2.5U補體，震蕩混勻后37℃水浴30分鐘。
3、每孔加入25μl致敏后的綿羊紅細(xì)胞，震蕩混勻后37℃水浴30分鐘。
4、設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清、補體對照、溶血素對照、以抗原抗補體活性對照。
三、判定1、96孔微量反應(yīng)板125g離心2分鐘或靜止10分鐘，當(dāng)陰性對照、陽性對照、補體對照、紅細(xì)胞對照成立情況下，判定被檢孔補體結(jié)合百分率。
2、判定補體結(jié)合百分率方法如下表6 補體結(jié)合百分率判定

3、判定標(biāo)準(zhǔn)血清1∶10稀釋時，++++為陽性；血清1∶10稀釋時，+、++、+++為疑似；血清1∶10稀釋時，-為陰性。
對于疑似樣品重新采集血清進行復(fù)檢，如果仍為疑似，則做病理學(xué)和病原學(xué)檢查。
4、試驗結(jié)果試驗結(jié)果見表7。
表7 應(yīng)用補體結(jié)合試驗(CFT)對人工感染牛傳染性胸膜肺炎陽性牛血清檢測結(jié)果

結(jié)果表明采用本發(fā)明重組表達(dá)的蛋白質(zhì)作為抗原運用補體結(jié)合試驗方法檢測牛傳染性胸膜肺炎，檢測結(jié)果準(zhǔn)確率高，說明該抗原具有很高的特異性和敏感性，可用于牛傳染性胸膜肺炎的血清學(xué)診斷。
利用重組表達(dá)的突變絲狀支原體絲狀亞種N端脂蛋白進行牛傳染性胸膜肺炎血清學(xué)檢測一、試驗材料1、供試樣品用本發(fā)明實施例所純化的蛋白質(zhì)作為包被抗原2、陽性對照、陰性對照由葡萄牙國家獸醫(yī)參考實驗室惠贈(也可從普通生物試劑公司購買得到，效果等同)，為用國際標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻讓φ諡?00μl底物溶液加50μl終止液。
3、試劑魚明膠、吐溫20、OPD(鄰苯二胺)(均可從普通生物試劑公司購買得到)。
二、試驗方法將實施例2所純化的蛋白以1μg/ml包被96孔平底聚苯乙烯酶標(biāo)板，具體試驗程序如下1、包被抗原用pH9.6，0.05M的碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋到工作濃度，用微量加樣器每孔加入100μl，覆上石蠟封口膜(Parafilm)，4℃包被過夜。次日傾去包被液，用Stat Fax 2600型全自動洗板機洗滌。
2、封閉每孔加入100μl 3％魚明膠，置濕盒中37℃孵育90min，甩干后同上洗滌。
3、加被檢血清用含0.05％吐溫20的PBS(PBST)將血清以1∶80倍稀釋，每孔加100μl。置濕盒中37℃孵育30min，甩干后同上洗滌。
4、加酶結(jié)合物用PBST(磷酸鹽緩沖液)將酶結(jié)合物以1∶2000倍稀釋，每孔加100μl，置濕盒中37℃孵育1h，甩干后同上洗滌。
5、加底物溶液每孔加入OPD(鄰苯二胺)溶液100μl，置暗盒中室溫放置30min。
6、加終止液每孔加入2M H2SO450μl，終止反應(yīng)。
7、測定光密度值(OD)終止反應(yīng)后，用Stat Fax 2600型全自動酶標(biāo)儀以492nm測定各孔OD值。
在每次試驗中均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性、標(biāo)準(zhǔn)陰性和底物終止液空白對照孔。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清樣品OD值為0.8-1.0之間；標(biāo)準(zhǔn)陰性血清樣品OD值為0.20-0.25之間.
三、試驗結(jié)果試驗結(jié)果見表8。
表8 應(yīng)用間接ELISA試驗對人工感染牛傳染性胸膜肺炎陽性牛血清檢測結(jié)果

說明供試樣品的數(shù)值結(jié)果大于或等于0.25為陽性結(jié)果表明采用本發(fā)明重組表達(dá)的蛋白質(zhì)作為抗原運用間接ELISA試驗方法檢測牛傳染性胸膜肺炎，檢測結(jié)果準(zhǔn)確率高，說明該抗原具有很高的特異性和敏感性，可用于牛傳染性胸膜肺炎的血清學(xué)診斷。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>一種編碼絲狀支原體絲狀亞種N端脂蛋白的DNA<160>6<210>1<211>573<212>DNA<213>人工序列<400>1ccattagttg ttgtttcatg taaaacttca aattttaata acaataaacc taataataat 60caacaaaaaa aagagcaagt aagtaaaatt gatatttcaa gttttaaaga taaaattgaa120ccaaaaaatg agtggcaaaa acaagatgtt ttacaagcat tactaaaaat aaaagggcta180gataaattaa ctcaaaatga ttttaatttt aatattaaga aagctaattt attacgtaat240ggacaattga taattaaatc taaagacgat tctaaaatta taaaaggtga actaagttta300gaaattaaaa aactaaatag agttaaaaaa gttgaaacaa aatataatga tactagaact360gaggttttag taattggtta tgatgaaaat ggaaaaattt ctgggtttgc tcaaactgtt420aaaaaagttc ctgaaaaact accagaagaa attattagtc tagagcgtgc ttttttaaaa480aataattctg ataaaattga aaatcttgat aaatgggaca catctaatat agtaagtatg540tcttcaatgt ttcaacaagc tagaaacttt aat 573<210>2<211>191<212>PRt<213>人工序列<400>2Pro Leu Val Val Val Ser cys Lys Thr Ser Asn Phe Asn Asn Asn15 10 15Lys Pro Asn Asn Asn Gln Gln Lys Lys Glu Gln Val Ser Lys Ile20 25 30Asp Ile Ser Ser Phe Lys Asp Lys Ile Glu Pro Lys Asn Glu Trp35 40 45Gln Lys Gln Asp Val Leu Gln Ala Leu Leu Lys Ile Lys Gly Leu50 55 60Asp Lys Leu Thr Gln Asn Asp Phe Asn Phe Asn Ile Lys Lys Ala65 70 75Asn Leu Leu Arg Asn Gly Gln leu Ile Ile Lys Ser Lys Asp Asp80 85 90Ser Lys Ile Ile Lys Gly Glu Leu Ser Leu Glu Ile Lys Lys Leu95 100 105Asn Arg Val Lys Lys Val Glu Thr Lys Thr Asn Asp Thr Arg Thr110 115 120Glu Val Leu Val Ile Gly Thy Asp Glu Asn Gly Lys Ile Ser Gly125 130 135Phe Ala Gln Thr Val Lys Lys Val Pro Glu Lys Leu Pro Glu Glu140 145 150Ile Ile Ser Leu Glu Arg Ala Phe Leu Lys Asn Asn Ser Asp Lys155 160 165Ile Glu Asn Leu Asp Lys Trp Asp Thr Ser Asn Ile Val Ser Met170 175 180Ser Ser Met Phe Gln Gln Ala Arg Asn Phe Asn185 190<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>3gcggaattcc cattagttgt tgtttcatgt a 31<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列
<400>4gacgtcgaca ttaaagtttc tagcttgttg 30<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>5tcttgttttt gccactcatt ttttg 15<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>6caaaaaatga gtggcaaaaa caaga 1權(quán)利要求
1.一種編碼絲狀支原體絲狀亞種N端脂蛋白的DNA，其特征在于具有序列表SEQ ID No.1所述的序列。
2.權(quán)利要求1的DNA所編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于具有序列表SEQ IDNo.2所述的序列。
3.權(quán)利要求1所述的DNA的制備方法，包括以下步驟1)提取支原體的基因組DNA，設(shè)計一對特異性引物，以所提取的支原體基因組DNA為模板進行PCR擴增，將擴增到的特異性片段經(jīng)酶切后連接到PUC載體上，2)設(shè)計一對突變引物，以該重組PUC載體為模板，加入一對載體通用引物和該突變引物進行PCR擴增，收集所擴增到的特異性片段即得。
4.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其中步驟1)所述的特異性引物具有序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所述的序列。
5.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其中步驟2)所述的突變引物具有序列表SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所述的序列。
6.含有權(quán)利要求1所述DNA的表達(dá)載體。
7.按照權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為含有權(quán)利要求1所述DNA的Pet22b、Pet30a、PGEX-6p-1、pProEXHTa、Pet32a載體。
8.按照權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為含有權(quán)利要求1所述DNA的Pet32a載體。
9.含有權(quán)利要求1所述DNA的細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求1所述DNA或/和權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)在制備牛傳染性胸膜肺炎血清學(xué)檢測試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的編碼絲狀支原體絲狀亞種N端脂蛋白的DNA、其制備方法、其編碼的蛋白質(zhì)及其在牛傳染性胸膜肺炎血清學(xué)檢測中的用途。本發(fā)明利用體外誘變技術(shù)將支原體脂蛋白LppQ基因閱讀框架N端582個核苷酸其中1個UGA核苷酸誘變?yōu)閁GG，將誘變后的脂蛋白LppQ DNA序列與表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進行體外表達(dá)，所表達(dá)的重組蛋白可作為抗原應(yīng)用于牛傳染性胸膜肺炎的血清學(xué)診斷。
文檔編號C12N15/64GK1730656SQ20041007001
公開日2006年2月8日 申請日期2004年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月5日
發(fā)明者辛九慶, 高玉龍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所