專利名稱：檢測(cè)ppn/mg61表達(dá)的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于在人類細(xì)胞中對(duì)PPN/MG61的表達(dá)和活性水平進(jìn)行測(cè)量的方法，通過(guò)抑制酶活性而治療癌癥的方法，以及這些方法的應(yīng)用。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種用于對(duì)正常細(xì)胞和癌癥細(xì)胞中的PPN/MG61的表達(dá)和活性水平進(jìn)行對(duì)比測(cè)量的方法，通過(guò)抑制酶活性而治療癌癥的方法以及這些方法的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Wnt(wingless and int homologue)是一個(gè)富含半胱氨酸的分泌糖蛋白家族，該家族已在多種脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中被鑒定。它們已被證明對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)的確定以及發(fā)育和癌癥中多個(gè)階段的細(xì)胞行為起著重要的作用。它們與細(xì)胞表面的一個(gè)特異的受體家族(Frizzled(Fz)家族)進(jìn)行結(jié)合，并且激活信號(hào)通路以施加其效應(yīng)，例如，作用于基因轉(zhuǎn)錄(Cadigan KM和Nusse R，1997；Polakis P，2000)。Wnt家族的特征之一為在該蛋白質(zhì)分子的保守位點(diǎn)存在23或者24個(gè)半胱氨酸殘基。據(jù)設(shè)想這些半胱氨酸殘基可通過(guò)二硫鍵的形成對(duì)Wnt蛋白的折疊起著關(guān)鍵性作用。
使用經(jīng)加工處理而表達(dá)多種Wnt的培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)Wnt蛋白的加工和分泌進(jìn)行了研究(Smolich BD，et al，1993；Burrus LW和McMahonAP，1995)。在多數(shù)細(xì)胞類型中Wnt的加工效率很低，這是因?yàn)榇嬖谥喾N加工中間體。因此Wnt并未很好地分泌到細(xì)胞之外。大多數(shù)Wnt蛋白同一種HSP70蛋白-BiP-相結(jié)合并且留在ER中(KitajewskiJ，et al，1992)。通過(guò)果蠅缺陷試劑盒對(duì)參與Wg(果蠅同源物)信號(hào)傳導(dǎo)的基因的篩選還鑒定了一種新的基因，其產(chǎn)物為Wg的加工和分泌所需(Muller H，et al，1999)。這些結(jié)果提示，Wnt的加工和分泌是復(fù)雜的，并且有多種特異性因子參與這些事件。
果蠅體節(jié)極性基因之一porcupine(porc)編碼了一種多跨膜ER蛋白，該蛋白為Wg在胚中的的正常分布所需(Kadowaki T，et al，1996)。在porc突變體胚中，Wg被隔離于其合成細(xì)胞內(nèi)并且不分布于周邊細(xì)胞中。Wg信號(hào)組件在多細(xì)胞生物體內(nèi)相當(dāng)保守，并且porc類似物同樣在其它物種中存在。線蟲(chóng)porc類似物mom-1在產(chǎn)Mom-2細(xì)胞中是必需的，因?yàn)镻orc為Wg合成細(xì)胞所需(Thorpe CJ，et al，1997)。脊椎動(dòng)物(小鼠和爪蟾)的porc類似物已在培養(yǎng)的細(xì)胞中被證明可修飾Wg以及小鼠Wnt蛋白的N-糖基化(Tanaka K，et al，2000)。
果蠅基因Porcupine(Porc)的人類類似物近來(lái)也已被克隆(Caricasole A，et al，2002)。人類Porcupine基因座(PPN/MG61)橫跨15個(gè)內(nèi)含子，在Xp11.23的基因組序列中約12kb。與其小鼠和爪蟾類似物相近，PPN/MG61以組織特異性方式表達(dá)。證據(jù)還顯示，在T-細(xì)胞因子應(yīng)答報(bào)告者分析中(T-cell factor-responsive reporterassay)人類PPN/MG61可影響人類Wnt7A表達(dá)構(gòu)建體的活性。這些結(jié)果證明porc基因家族編碼了進(jìn)化上保守的ER膜蛋白，該蛋白參與了Wnt家族的加工。
根據(jù)Porc和其它膜結(jié)合的?；D(zhuǎn)移酶超家族之間的氨基酸序列保守性，Porc有可能作為Wnt的?；D(zhuǎn)移酶發(fā)揮功能(Hofmann K，2000)。Porc對(duì)Wnt蛋白進(jìn)行酰化并且將它們錨定于ER膜之上以刺激他們的轉(zhuǎn)錄后N-糖基化，該過(guò)程對(duì)于分泌是必需的。在缺乏porc的情況下，Wnt蛋白并不從合成細(xì)胞中分泌，并且因此Wnt信號(hào)傳導(dǎo)不在周邊細(xì)胞中激活。
所有經(jīng)生化鑒定的膜結(jié)合的?；D(zhuǎn)移酶超家族成員都編碼酶類，這些酶將有機(jī)酸轉(zhuǎn)移至膜包埋的目標(biāo)的羥基基團(tuán)之上，在典型情況下有機(jī)酸為脂肪酸。這樣的例子包括ACAT(膽固醇?；D(zhuǎn)移酶；將脂肪酸轉(zhuǎn)移至膽固醇)、Are1/2(將脂肪酸轉(zhuǎn)移至酵母甾醇上)、DGAT(二酰基甘油O-?；D(zhuǎn)移酶；將脂肪酸轉(zhuǎn)移至二?；视蜕?、蠟合成酶(將脂肪酸轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)鏈醇上)、DltB(參與向磷壁酸質(zhì)中摻入丙氨酸)以及AlgI(參與藻酸鹽的O-?；?(Hofmann K，2000)。該蛋白質(zhì)家族的據(jù)推測(cè)的酶作用得到膜內(nèi)和膜附近極性殘基的保守性的支持。最顯著的是，位于一個(gè)長(zhǎng)疏水區(qū)域中的組氨酸是不變的，這使得它很可能是一個(gè)活性位點(diǎn)殘基。
該超家族的其它成員僅在基因上被鑒定。這些成員包括果蠅基因porcupine以及其線蟲(chóng)類似物mom-1。Porcupine對(duì)于Wingless信號(hào)傳導(dǎo)很關(guān)鍵，它影響Wingless加工以及分泌(Kadowaki T，et al，1996)。mom-1是在對(duì)內(nèi)胚層分化突變體進(jìn)行的基因篩選中與mom-2(一種wingless類似物)和mom-5(一種frizzled類似物)一同被鑒定的(Thorpe CJ，et al，1997)。Porcupine樣蛋白在Wingless信號(hào)傳導(dǎo)的一個(gè)功能已被確認(rèn)。根據(jù)同源性它們作為一種?；D(zhuǎn)移酶的作用方式看來(lái)似乎是可信的。但是，該底物的性質(zhì)還是個(gè)待決的問(wèn)題。這些觀察結(jié)果并不是酰基化和Wnt信號(hào)傳遞間的僅有的聯(lián)系。Wnt抑制劑的Dickkopf(DKK)家族的成員被發(fā)現(xiàn)與輔脂酶有關(guān)(Aravind L和Koonin EV，1998)。因此，暗示了由Dickkopf(DKK)蛋白介導(dǎo)的脫?；赡軐?duì)Porcupine(Porc；PPN/MG61)介導(dǎo)的?；修卓棺饔?。
Wnt/Frizzled受體途徑涉及到一些重要的調(diào)控基因，這些基因造成同原發(fā)癌癥(primary carcinomas)相關(guān)的多態(tài)性現(xiàn)象。在下游信號(hào)傳導(dǎo)期間胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白(catenin)進(jìn)行積累，轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，并且隨后通過(guò)與其它轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物而增強(qiáng)基因的表達(dá)。在缺乏Wnt信號(hào)的情況下，游離的胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白被并入一種復(fù)合體，該復(fù)合體由Axin、結(jié)直腸腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli，APC)基因產(chǎn)物以及糖原合成酶激酶(GSK)-3β所組成。通過(guò)GSK-3β所進(jìn)行的Axin、APC和β-連環(huán)蛋白的連接磷酸化將β-連環(huán)蛋白設(shè)定于泛素途徑以及通過(guò)蛋白酶體進(jìn)行的降解。
已知Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)在多種細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞的存活。Wnt信號(hào)途徑還被認(rèn)為同腫瘤的發(fā)育和/或發(fā)展相關(guān)聯(lián)。Wnt信號(hào)通路的異常激活與多種人類癌癥相關(guān)。例如，基因APC的突變對(duì)于散發(fā)的和遺傳的直腸結(jié)腸腫瘤發(fā)生均是一種起始事件。APC突變體同腫瘤發(fā)生有關(guān)是因?yàn)樵摦惓５鞍资荳nt-信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的組成部分。該蛋白質(zhì)產(chǎn)物含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域作為β-連環(huán)蛋白結(jié)合和降解位點(diǎn)發(fā)揮作用。發(fā)生在β-連環(huán)蛋白的氨基末端片段的突變通常參與了依賴于磷酸化的泛素介導(dǎo)的降解，并且由此而使β-連環(huán)蛋白穩(wěn)定。當(dāng)穩(wěn)定化的胞質(zhì)連環(huán)蛋白積累時(shí)，該蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核同Tcf/Lef高速泳動(dòng)族(high-mobility group)轉(zhuǎn)錄因子相作用，這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控諸如c-Myc這樣的癌基因的表達(dá)。證據(jù)還顯示，Wnt蛋白在多種癌癥中被過(guò)表達(dá)和異常激活。但是，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路在癌癥發(fā)生中的角色尚不清楚。
本發(fā)明的方法證明，果蠅Porcupine基因的人類類似物PPN/MG61在多種人類癌癥細(xì)胞系中豐富地表達(dá)，這些癌癥包括肺癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、間皮瘤、頭頸癌(head and neck cancer)以及惡性黑素瘤。與之相比，在培養(yǎng)的正常細(xì)胞中未觀察到PPN/MG61的表達(dá)。本方法進(jìn)一步表明，PPN/MG61在初期的肺癌和間皮瘤組織樣本中過(guò)量表達(dá)，而在對(duì)應(yīng)的正常組織樣本(來(lái)自同一患者)中未表達(dá)。
另外，在來(lái)自于多種癌癥患者的血清中檢測(cè)到了PPN/MG61的表達(dá)，這些癌癥包括肺癌和甲狀腺癌等等，但在正常血清樣本中未檢測(cè)到。
本發(fā)明的方法還表明，人類PPN/MG61的過(guò)表達(dá)對(duì)于癌細(xì)胞的存活是必需的。敲低(Knocking-down)PPN/MG61 mRNA和/或抑制PPN/MG61蛋白的?；D(zhuǎn)移酶的活性在多種癌癥中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。特別是在肺癌和間皮瘤中。這些數(shù)據(jù)提示，通過(guò)PPN/MG61進(jìn)行的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)分子的脂化修飾對(duì)于該途徑在腫瘤發(fā)生中的功能十分重要，并且提示PPN/MG61可能是一種激發(fā)療效的醫(yī)療目標(biāo)。因此，PPN/MG61表達(dá)的檢測(cè)以及PPN/MG61酶活性的抑制對(duì)于人類癌癥的分子診斷、早期檢測(cè)和治療具有廣泛的可能。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了在人類細(xì)胞、組織和包括血清和唾液在內(nèi)的體液中檢測(cè)PPN/MG61表達(dá)和/或酶活性以及通過(guò)抑制酰基轉(zhuǎn)移酶活性而抑制過(guò)表達(dá)PPN/MG61的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的診斷方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測(cè)量PPN/MG61的基因轉(zhuǎn)錄本(例如mRNA)的方法，該方法通過(guò)使用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)進(jìn)行或者通過(guò)使用基于擴(kuò)增(例如PCR)來(lái)直接估測(cè)DNA拷貝數(shù)的方法來(lái)實(shí)施。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)量PPN/MG61蛋白的數(shù)量或者測(cè)量表達(dá)這些蛋白的細(xì)胞的數(shù)量的方法，該方法使用任何一種廣為認(rèn)可的免疫結(jié)合分析而進(jìn)行，這些分析包括使用同PPN/MG61相結(jié)合的單特異性抗體進(jìn)行的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)。
PPN/MG61的翻譯蛋白水平還可以通過(guò)使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的任何手段而進(jìn)行檢測(cè)。這些手段包括分析性生化方法如電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴(kuò)散(hyperdiffusion)色譜等等。被分離的蛋白還可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)序以鑒定多態(tài)性(polymorphisms)。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于對(duì)PPN/MG61的酶(O-?；D(zhuǎn)移酶)活性進(jìn)行測(cè)量和/或定量的方法，該方法通過(guò)使用其底物的轉(zhuǎn)換而進(jìn)行。
第一和第二細(xì)胞的PPN/MG61表達(dá)水平和/或酶活性的差異被用于檢測(cè)或者診斷某種癌癥、診斷某種癌癥的轉(zhuǎn)移可能性、監(jiān)測(cè)某種癌癥的預(yù)后和發(fā)展或者監(jiān)測(cè)對(duì)某種癌癥的治療的療效。這些癌癥包括，肺癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、類癌瘤(carcinoid)、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、頭頸癌、陰道或睪丸癌、腦瘤、子宮頸癌、食道癌、淋巴瘤、惡性黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、眼癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化瘤以及白血病，但不限于這些。
在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制造檢測(cè)本發(fā)明所披露的PPN/MG61表達(dá)水平和/或酶活性的試劑盒的方法，該試劑盒可被用于檢測(cè)或者診斷某種癌癥、診斷某種癌癥的轉(zhuǎn)移可能性、監(jiān)測(cè)某種癌癥的預(yù)后和發(fā)展或者監(jiān)測(cè)對(duì)某種癌癥的治療的療效。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本方法提供了一種用于在體外和體內(nèi)對(duì)某種組織進(jìn)行成像的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法和/或本發(fā)明所披露的試劑盒，該方法和/或試劑盒用于對(duì)抑制PPN/MG61的醫(yī)療有效的化合物進(jìn)行篩選。
本發(fā)明所包括的PPN/MG61特異性化合物包括，某種與PPN/MG61結(jié)合、模擬其底物并抑制其酶活性的小分子化合物，某種與PPN/MG61蛋白結(jié)合的肽或者單特異性抗體，或者同PPN/MG61的mRNA/cDNA進(jìn)行雜交的核酸探針/引物，但不限于這些。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案包括一種對(duì)需要進(jìn)行治療的受試者的PPN/MG61所介導(dǎo)的癌癥進(jìn)行治療的方法，該方法包括以治療有效量的PPN/MG61抑制劑化合物的藥學(xué)制劑對(duì)該受試者進(jìn)行給藥；其中該P(yáng)PN/MG61抑制劑化合物根據(jù)情況可具細(xì)胞毒性。優(yōu)選的PPN/MG61抑制劑化合物包括PPN/MG61特異性化合物，但不限于此。在本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該藥學(xué)制劑被包埋入一種氣囊導(dǎo)管(balloon catheter)或者stent之中，并且以時(shí)間依賴性方式進(jìn)行釋放。該實(shí)施方案進(jìn)一步包括單獨(dú)地給癌癥患者施用所述藥學(xué)制劑，或者同第二種治療藥物(例如化療藥物)和/或放療一起施用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.PPN/MG61在人類正常和癌細(xì)胞系中的表達(dá)。在多種癌細(xì)胞系中的PPN/MG61表達(dá)的RT-PCR分析，所使用的細(xì)胞系包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系(A549、H460、H838和H1703)、乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7，BT474和HuL100)、惡性多間皮瘤細(xì)胞系(H513，H2052，H290，MS-1和H28)、結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480)、頭頸癌細(xì)胞系(U87)、Hela細(xì)胞系、肉瘤細(xì)胞系(Mes-SA)以及正常細(xì)胞(小氣管上皮細(xì)胞(SAEC)，支氣管上皮細(xì)胞(NHBE))。制備了來(lái)自各個(gè)細(xì)胞類型的總RNA。
圖2.PPN/MG61在人類正常和癌細(xì)胞組織樣本中的表達(dá)。在初期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織樣本中的PPN/MG61 mRNA水平的RT-PCR分析。總RNA從新鮮切除的肺癌和同一患者體內(nèi)的同源匹配的正常肺組織中制備。
圖3.初期人類間皮瘤組織樣本中的PPN/MG61表達(dá)水平的RT-PCR分析?？俁NA從新鮮切除的癌癥患者中制備。
圖4.正常人類血清和來(lái)自癌癥患者的血清樣本中的PPN/MG61mRNA水平的RT-PCR分析，該癌癥包括NSCLC、間皮瘤、結(jié)腸癌、惡性黑素瘤、腎癌、食道癌、甲狀腺癌、肉瘤、卵巢癌。總RNA從血清樣本中制備并且被用于該反應(yīng)。
圖5.正常人類血清和來(lái)自癌癥患者的血清樣本中的PPN/MG61mRNA水平的RT-PCR分析。血清樣本未經(jīng)處理并被直接用于該反應(yīng)。
圖6.正常人類血清和來(lái)自癌癥患者的血清樣本中的PPN/MG61mRNA水平的RT-PCR分析。血清樣本在被用于該反應(yīng)之前經(jīng)熱處理。
圖7.靶向于PPN/MG61的siRNA在NSCLC細(xì)胞系H460中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。A)該H460細(xì)胞在100nM的PPN/MG61 siRNA處理后(6天后)通過(guò)使用0.5％的龍膽紫進(jìn)行染色。B)對(duì)PPN/MG61siRNA所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行的流式細(xì)胞儀分析(膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色)。從左到右，H460癌細(xì)胞分別受到100nM的非沉默(non-silencing)參照siRNA和PPN/MG61 siRNA的處理。C)PPN/MG61siRNA處理后在H460細(xì)胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作為參照。β-肌動(dòng)蛋白被用作為加樣量對(duì)照。
圖8.靶向于PPN/MG61的siRNA在NSCLC細(xì)胞系H1703中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。A)該H1703細(xì)胞在100nM的PPN/MG61 siRNA處理后(4天后)通過(guò)使用0.5％的龍膽紫進(jìn)行染色。B)對(duì)PPN/MG61 siRNA所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行的流式細(xì)胞儀分析(膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色)。從左到右，H1703癌細(xì)胞分別受到100nM的非沉默參照siRNA和PPN/MG61 siRNA的處理。C)PPN/MG61 siRNA處理后在H1703細(xì)胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作為參照。β-肌動(dòng)蛋白被用作為加樣量對(duì)照。
圖9.靶向于PPN/MG61的siRNA在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。A)對(duì)PPN/MG61siRNA所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行的流式細(xì)胞儀分析(膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色)。從左到右，A549癌細(xì)胞分別受到100nM的非沉默參照siRNA和PPN/MG61 siRNA的處理。B)PPN/MG61 siRNA處理后在A549細(xì)胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作為參照。
圖10.靶向于PPN/MG61的siRNA在間皮瘤細(xì)胞系H2052中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。A)對(duì)PPN/MG61siRNA所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行的流式細(xì)胞儀分析(膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色)。從左到右，H2052癌細(xì)胞分別受到100nM的非沉默參照siRNA和PPN/MG61 siRNA的處理。B)PPN/MG61 siRNA處理后在H2052細(xì)胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作為參照。β-肌動(dòng)蛋白被用作為加樣量對(duì)照。
圖11.靶向于PPN/MG61的siRNA在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。A)對(duì)PPN/MG61siRNA所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行的流式細(xì)胞儀分析(膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色)。從左到右，MCF-7乳腺癌細(xì)胞分別受到100nM的非沉默參照siRNA和PPN/MG61 siRNA的處理。B)PPN/MG61 siRNA處理后在MCF-7細(xì)胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作為參照。β-肌動(dòng)蛋白被用作為加樣量對(duì)照。
圖12.陰性參照實(shí)驗(yàn)靶向于PPN/MG61的siRNA在缺乏PPN/MG61表達(dá)的正常細(xì)胞培養(yǎng)物SAEC和NHBE中并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且不阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。A)流式細(xì)胞儀分析(膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI染色)。從左到右，SAEC(頂部)和NHBE(底部)分別受到100nM的非沉默參照siRNA和PPN/MG61 siRNA的處理。B)PPN/MG61 siRNA處理后在正常細(xì)胞中(SAEC和NHBE)的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作為參照。β-肌動(dòng)蛋白被用作為加樣量對(duì)照。
圖13.在膜結(jié)合的O-?；D(zhuǎn)移酶家族中的一個(gè)保守區(qū)域的多排列比較。所示的僅為被選擇的蛋白質(zhì)。物種和酶的名稱為簡(jiǎn)寫(xiě)AT，擬南芥；BS，枯草芽胞桿菌；CE，線蟲(chóng)；DM，果蠅；HS，人類；MM，小鼠；PA，綠膿桿菌；SA，金黃色葡萄球菌；SC，釀酒酵母；SI，Simmondsia chinensis；TP，梅毒螺旋體；ACAT，膽固醇?；D(zhuǎn)移酶；DGAT，二?；视蚈-?；D(zhuǎn)移酶；WaxSyn，蠟合成酶。
定義與另一種多聚核苷酸或者多肽具有特定百分比的“序列相同性”的一種多聚核苷酸或者多肽，指的是當(dāng)進(jìn)行排列比較時(shí)，對(duì)兩種序列進(jìn)行比較時(shí)的相同堿基或者氨基酸的百分比。序列相似性可以以多種不同的方式進(jìn)行測(cè)定。為測(cè)定序列相等性，使用一些方法和計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列排列比較，這些方法和程序包括BLAST，可通過(guò)萬(wàn)維網(wǎng)上于http//ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/獲得。另一種排列比較算法為FASTA，可在來(lái)自Madison，Wis.，USA，a wholly owned subsidiary ofOxford Molecular Group，Inc.的遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG)包中獲得。用于排列比較的其他方法在Methods in Enzymology，vol.266Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996)，ed.Doolittle，Academic Press，Inc.，a division of Harcourt Brace & Co.，SanDiego，Calif.，USA.中有所描述。在序列中允許空位的排列比較程序特別令人感興趣。Smith-Waterman是一種在序列排列中允許空位的算法。見(jiàn)，Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。另外，使用Needleman和Wunsch排列比較方法的GAP程序可被用于進(jìn)行序列的排列比較(見(jiàn)，J.Mol.Biol.48443-453(1970))。使用Smith Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981))以測(cè)定序列相等性的BestFit程序令人感興趣。空位產(chǎn)生罰分(gapgeneration penalty)一般介于1到5，通常介于2到4，在多個(gè)實(shí)施方案中為3?？瘴谎由炝P分(gap extension penalty)一般介于0.01到0.20，并且在多種情況下為0.10。該程序的缺省參數(shù)通過(guò)待比較的輸入序列進(jìn)行測(cè)定。在優(yōu)選的情況下，該序列相同性使用程序所決定的缺省參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。該程序可獲自Genetics Computing Group(GCG)package，from Madison，Wis.，USA。該排列比較區(qū)域長(zhǎng)度的百分比通過(guò)對(duì)最強(qiáng)排列中的個(gè)體序列的殘基數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)算。該數(shù)除以目標(biāo)或者受測(cè)(query)的序列的總殘基數(shù)以得一個(gè)百分比。序列百分相等性通過(guò)對(duì)目標(biāo)和受測(cè)多核苷酸序列之間的匹配殘基數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且將最強(qiáng)排列區(qū)域中的總匹配數(shù)除以目標(biāo)或者受測(cè)序列的殘基數(shù)而計(jì)算。
“PPN/MG61特異性化合物”指的是，例如，合成或者天然的氨基酸多肽、蛋白質(zhì)、小的合成有機(jī)分子或者脫氧核糖核酸或者核糖核酸序列，這些化合物與PPN/MG61結(jié)合的親和性是其它蛋白質(zhì)和核酸的20倍或者更高。例如，抗PPN/MG61蛋白或者其肽片段的多克隆或者單克隆(包括經(jīng)典的或者噬菌體展示)抗體，或者同PPN/MG61mRNA雜交的核酸探針，但不限于這些。優(yōu)選地，PPN/MG61特異性化合物選自結(jié)合PPN/MG61(Seq ID No1，或者任何與Seq ID No1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列)的小分子化合物、單特異性抗體或者結(jié)合PPN/MG61的scFv以及核酸探針，所述核酸探針包括反義寡聚物、siRNA以及shRNA，這些探針應(yīng)與PPN/MG61 mRNA和/或cDNA(Seq ID No2，或者任何與Seq IDNo2具有至少80％相同性的序列)雜交。特別優(yōu)選地，小分子是棕櫚酸鹽或溴代棕櫚酸鹽或其他棕櫚酸鹽衍生物。與PPN/MG61 mRNA和/或cDNA結(jié)合的核酸序列的長(zhǎng)度可以是6bp或6bp以上，優(yōu)選6至1386bp，更優(yōu)選6至50bp，更優(yōu)選6至20bp，更優(yōu)選6至15bp，特別優(yōu)選6至10bp。優(yōu)選地，與PPN/MG61 mRNA和/或cDNA結(jié)合的核酸序列與PPN/MG61基因(SEQ ID NO2)，或它的互補(bǔ)序列，有至少80％，優(yōu)選至少90，更優(yōu)選95％，最優(yōu)選100％的序列同源性?；蛘?，與PPN/MG61 mRNA和/或cDNA結(jié)合的核酸序列與PPN/MG61基因(SEQ ID NO2)的互補(bǔ)序列中的某段序列有至少80％，優(yōu)選至少90，更優(yōu)選95％，最優(yōu)選100％的序列相同性。
在本發(fā)明中，除非另外說(shuō)明，“PPN/MG61”表示PPN/MG61蛋白或多肽，斜體字“PPN/MG61”表示編碼PPN/MG61蛋白的基因。
本文所使用的“醫(yī)療有效量”的藥物組合物或其中的化合物指的是一種抑制PPN/MG61活性的量。該藥物組合物一般含有介于約0.001到約100mg/kg的每劑單位(例如，藥片、膠囊、粉末、注射劑、藥匙量等等)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物含有約0.01到約50mg/kg化合物的每劑量單位，在優(yōu)選的情況下為約0.05到約20mg/kg。用于測(cè)定該藥物組合物的醫(yī)療有效劑量的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，用于以該藥物組合物對(duì)人類進(jìn)行給藥的有效劑量可從動(dòng)物研究的結(jié)果中進(jìn)行數(shù)學(xué)計(jì)算。進(jìn)一步，本發(fā)明的化合物可以以鼻腔內(nèi)形式進(jìn)行給藥，該給藥通過(guò)適當(dāng)?shù)谋乔粌?nèi)載體的局部應(yīng)用，或者通過(guò)透皮路線使用透皮皮膚貼的形式進(jìn)行，該透皮皮膚貼為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。為以透皮遞送系統(tǒng)的方式進(jìn)行給藥，該劑量給藥應(yīng)為連續(xù)的，而非通過(guò)劑量方案(dosage regimen)間斷進(jìn)行。
本文中可交替使用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“受試者”、“宿主(host)”和“患者”指的是哺乳動(dòng)物，包括，小鼠、猿、人類、貓、犬、馬、牛、哺乳類牲畜、哺乳類競(jìng)技動(dòng)物和哺乳類寵物，但不限于這些。
發(fā)明詳述本發(fā)明首次提供了證據(jù)表明，可能作為酰基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮功能的人類PPN/MG61在特定的組織病患狀態(tài)下被上行調(diào)節(jié)(upregulated)。特別地，PPN/MG61在多種人類癌癥中被豐富地表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、間皮瘤、頭頸癌和惡性黑素瘤。與之對(duì)比，在培養(yǎng)的正常細(xì)胞中觀察不到PPN/MG61的表達(dá)。
本發(fā)明還首次提供了證據(jù)表明，人類PPN/MG61的過(guò)表達(dá)為癌細(xì)胞存活所必需。敲低PPN/MG61 mRNA和/或抑制PPN/MG61的?；D(zhuǎn)移酶活性在多種類型癌癥中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，特別是在肺癌中。
因此，在某種細(xì)胞中對(duì)PPN/MG61存在的檢測(cè)以及定量或者在體內(nèi)對(duì)PPN/MG61存在的檢測(cè)提供了一種方法，該方法用于對(duì)疾病狀態(tài)進(jìn)行診斷或者監(jiān)測(cè)，這些疾病包括，癌癥和腫瘤轉(zhuǎn)移，但不限于這些。因此，對(duì)PPN/MG61的上行調(diào)節(jié)或者上調(diào)的過(guò)表達(dá)進(jìn)行抑制提供了一種方法，該方法用于治療某種疾病狀態(tài)，特別是由PPN/MG61的表達(dá)所介導(dǎo)的癌癥。
本發(fā)明涉及的人類細(xì)胞選自腎上腺細(xì)胞、腦細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、脾細(xì)胞、胃細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、子宮細(xì)胞和脈管細(xì)胞；上皮細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、非膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、腎臟的近小管(proximal tubules)細(xì)胞、前列腺的平滑肌細(xì)胞、子宮的平滑肌細(xì)胞以及睪丸的平滑肌細(xì)胞；免疫細(xì)胞選自多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞(epitheloid cells)、巨大細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞(Kupffer cell)和肺泡巨噬細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一些組合物，這些組合物包括藥物組合物，該藥物組合物包括本發(fā)明的多肽、多聚核苷酸、抗體、重組載體以及宿主細(xì)胞。這些組合物可包括某種緩沖液，該緩沖液根據(jù)多肽、多聚核苷酸、抗體、重組載體以及宿主細(xì)胞所需的應(yīng)用而進(jìn)行選擇，并且可包括其它適于目的應(yīng)用的物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地選擇適當(dāng)?shù)倪m于目的應(yīng)用的緩沖液，其中很多種在本領(lǐng)域中是已知的。在某些情況下，該組合物可含有一種藥用賦形劑，其在本領(lǐng)域中是已知的并且在此無(wú)需詳細(xì)討論。
本發(fā)明提供了一些特異于PPN/MG61的抗體。適當(dāng)?shù)目贵w通過(guò)對(duì)某種宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫而獲得，該免疫使用含有目的蛋白的全部或者某一部分的肽而進(jìn)行。適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物包括，小鼠、大鼠、綿羊、山羊、倉(cāng)鼠、兔等等。該蛋白質(zhì)免疫原的來(lái)源可以是小鼠、人類、兔、猴等等。該宿主動(dòng)物一般應(yīng)為該免疫原不同的物種，例如使用人類蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，等等。
該免疫原可包括完整的蛋白或片段以及其衍生物。優(yōu)選的免疫原包括該目的蛋白的全部或者一部分，其中這些殘基含有存在于天然目的蛋白中的翻譯后修飾，例如糖基化。包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的免疫原通過(guò)本領(lǐng)域所指的多種方法進(jìn)行生產(chǎn)，例如，使用傳統(tǒng)重組方法進(jìn)行的克隆基因的表達(dá)，從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清中分離，等等。
為進(jìn)行多克隆抗體的制備，第一個(gè)步驟為使用目的蛋白對(duì)宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫化，其中該目的蛋白在優(yōu)選的情況下應(yīng)基本上純凈，含有低于約1％的雜質(zhì)。該免疫原可包括完整的目的蛋白，其片段或者衍生物。為提高該宿主動(dòng)物的免疫反應(yīng)，該目的蛋白可同佐劑進(jìn)行組合，其中適當(dāng)?shù)淖魟┌ǎ鞯\、葡聚糖、硫酸鹽、大多聚陰離子、油和水乳液，例如福氏佐劑、福氏完全佐劑等。該目的蛋白也可同合成的載體蛋白或者合成的抗原進(jìn)行偶聯(lián)?？蓪?duì)多種宿主進(jìn)行免疫化以產(chǎn)生多克隆抗體。這樣的宿主包括，兔、豚鼠、諸如小鼠、大鼠這樣的嚙齒類、綿羊、山羊等等。通常以該目的蛋白對(duì)該宿主進(jìn)行皮內(nèi)給藥，一次初始劑量后繼之以一次或者多次的額外加強(qiáng)劑量，該加強(qiáng)劑量通常為兩次。免疫化之后，從該宿主體內(nèi)收集血液，隨后將血清同血細(xì)胞分離。在所產(chǎn)生的抗血清中存在的Ig可進(jìn)一步進(jìn)行級(jí)分分離，該分離使用已知的方法進(jìn)行，例如ELISA、銨鹽分離、DEAE層析等等。
單克隆抗體通過(guò)傳統(tǒng)的方法而產(chǎn)生。通常情況下，免疫化的宿主動(dòng)物的脾臟和淋巴結(jié)提供了血細(xì)胞的來(lái)源。該血細(xì)胞通過(guò)與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合而永生化，從而產(chǎn)生了雜交瘤細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)來(lái)自個(gè)體雜交瘤的培養(yǎng)物上清進(jìn)行篩選以鑒定產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細(xì)胞。用于抗人類蛋白單克隆抗體的適當(dāng)動(dòng)物包括小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、兔等等。該抗體可從雜交瘤細(xì)胞上清或者從腹水中進(jìn)行純化，該純化通過(guò)傳統(tǒng)方法進(jìn)行，例如，使用結(jié)合于不可溶介質(zhì)的蛋白質(zhì)進(jìn)行的親合層析，使用蛋白質(zhì)A瓊脂糖、蛋白質(zhì)G瓊脂糖等等進(jìn)行的親合層析。
抗體可以以單鏈形式產(chǎn)生而非正常的多聚體結(jié)構(gòu)。單鏈抗體的設(shè)計(jì)見(jiàn)Jost et al.(1994)J.B.C.26926267-73和其它文獻(xiàn)。編碼該重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA序列被連接于一個(gè)間隔區(qū)(spacer)，該間隔區(qū)編碼至少約4個(gè)小中性氨基酸殘基，這些氨基酸包括甘氨酸和/或絲氨酸。通過(guò)這種融合而編碼的蛋白質(zhì)允許保持原抗體特異性和親合性的功能性可變區(qū)組裝。
為進(jìn)行體內(nèi)應(yīng)用，特別是用于對(duì)人類的注射，需要降低該抗體的抗原性。某種受體對(duì)抗該封閉藥劑的免疫反應(yīng)將會(huì)顯著地降低該治療的有效期。對(duì)抗體進(jìn)行人源化的方法在本領(lǐng)域中是已知的。人源化抗體可以是具有轉(zhuǎn)基因人類免疫球蛋白恒定區(qū)基因的動(dòng)物的產(chǎn)物(例見(jiàn)，美國(guó)專利申請(qǐng)WO 90/10077和WO 90/04036)。或者，該目的抗體可通過(guò)重組DNA方法進(jìn)行加工處理以將CH1、CH2、CH3、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或框架結(jié)構(gòu)域使用對(duì)應(yīng)的人類序列進(jìn)行替換(見(jiàn)，WO92/02190)。
Ig cDNA對(duì)于雜合免疫球蛋白基因構(gòu)建的應(yīng)用在本領(lǐng)域中是已知的(Liu et al.(1987)P.N.A.S.843439和(1987)J.Immunol.1393521)。從雜交瘤或者其它產(chǎn)生抗體的細(xì)胞中分離出mRNA并且將之用于產(chǎn)生cDNA。目的cDNA可使用特異性引物(美國(guó)專利號(hào)4,683,195 and 4,683,202)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。或者，產(chǎn)生一個(gè)文庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行篩選以分離目的序列。編碼該抗體可變區(qū)的DNA序列隨后同人類恒定區(qū)序列進(jìn)行融合。該人類恒定區(qū)基因的序列可見(jiàn)于Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，N.I.H.publication no.91-3242。人類C區(qū)域基因從已知的克隆中可容易獲得。對(duì)同種型的選擇應(yīng)根據(jù)所需效應(yīng)器功能的指導(dǎo)進(jìn)行，例如補(bǔ)體結(jié)合或者在受體依賴的細(xì)胞毒作用中的活性。優(yōu)選的同種型為IgG1、IgG3和IgG4。人類輕鏈恒定區(qū)，κ或者λ均可被使用。隨后通過(guò)傳統(tǒng)方法對(duì)該雜合人源化抗體進(jìn)行表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體可以全部為人類抗體。例如，可以應(yīng)用與人類抗體相同的異種人類抗體(xenogenic human antibodies)。異種人類抗體指的是與人類抗體相同的抗體，即，它們完全是人類抗體，不同之處在于它們使用非人類宿主產(chǎn)生，這些宿主經(jīng)過(guò)遺傳工程處理以表達(dá)人類抗體。例見(jiàn)，WO 98150433；WO 98,24893和WO99/53049，這些文獻(xiàn)在此引為參考。
諸如Fv、F(ab′)2和Fab這樣的抗體片段可通過(guò)對(duì)完整蛋白的切割而制備，例如，通過(guò)蛋白酶或者化學(xué)切割。或者設(shè)計(jì)一種截短的基因。例如，編碼F(ab′)2片段的一部分的雜合基因可包括編碼H鏈的CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)DNA序列，繼之以一個(gè)翻譯終止密碼子，從而產(chǎn)生截短分子。
H和L鏈的J區(qū)域的共有序列可被用于設(shè)計(jì)寡核苷酸，用作為引物以向該J區(qū)域中引入限制性位點(diǎn)，從而用于隨后的V區(qū)片段同人類C區(qū)片段的連接。C區(qū)域的cDNA可通過(guò)定點(diǎn)誘變而進(jìn)行修飾，從而將一個(gè)限制性位點(diǎn)置于該人類序列的同源位置。
表達(dá)載體包括質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、YAC、EBV衍生的附加體(episomes)等等。方便的載體編碼功能性的完整人類CH或者CL免疫球蛋白序列，攜帶有適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)以便于任何VH或者VL序列可被方便地插入和表達(dá)。在這樣的載體中，剪切通常在被插入的J區(qū)剪切供體位點(diǎn)和人類C區(qū)之前的剪切受體位點(diǎn)之間發(fā)生，該剪切同樣還在人類CH外顯子中的剪切區(qū)域中進(jìn)行。多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止在編碼區(qū)域下游的天然染色體位點(diǎn)處存在。所產(chǎn)生的雜合抗體可加入任何強(qiáng)啟動(dòng)子，包括反轉(zhuǎn)錄LTR，例如SV-40早期啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒LTR和莫洛尼氏小鼠白血病毒LTR；天然Ig啟動(dòng)子等等。
本發(fā)明的多肽和核酸組合物可用于多種不同的用途。目的應(yīng)用包括研究、診斷和治療藥物的篩選/發(fā)現(xiàn)/制備應(yīng)用，以及醫(yī)療組合物。目的應(yīng)用還包括PPN/MG61同源物的鑒定；作為新啟動(dòng)子元件的來(lái)源；表達(dá)調(diào)控因子的鑒定；在諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)這樣的雜交應(yīng)用中作為探針和引物；生物物種中表達(dá)模式的鑒定；用于PPN/MG61功能的細(xì)胞或者動(dòng)物模型的制備；用于PPN/MG61功能的體外模型的制備。
通過(guò)多種方法可鑒定出同源物。所提供的cDNA的片段可被用作為針對(duì)來(lái)自于目標(biāo)有機(jī)體的cDNA文庫(kù)的雜交探針。該引物可為一個(gè)大片段，或者一個(gè)或多個(gè)小簡(jiǎn)并引物。具有序列相似性的核酸通過(guò)在低嚴(yán)苛性的條件下，如，50℃下以及6×SSC(0.9M氯化鈉/0.09M檸檬酸鈉)中的雜交并且當(dāng)在55℃下以及1×SSC(0.15mM氯化鈉/0.015M檸檬酸鈉)中保持結(jié)合而被檢測(cè)。序列的相等性可通過(guò)在嚴(yán)苛性條件下，如，50℃或更高溫度下以及0.01×SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)中的雜交而被檢測(cè)。與提供的核酸序列，例如同Seq ID No2具有基本相同的核酸，以及與該基因的遺傳變化版本具有基本相同的核酸同所提供的序列在嚴(yán)苛的雜交條件下結(jié)合。通過(guò)使用這些探針，特別是使用DNA序列的標(biāo)記探針，同源或者相關(guān)基因可被分離。
5′側(cè)生(flanking)區(qū)域的序列可被用于包括增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的啟動(dòng)子元件，該元件在表達(dá)基因的組織中提供了發(fā)育的調(diào)控。該組織特異性表達(dá)可被用于測(cè)定表達(dá)模式以及用于提供模擬天然表達(dá)模式的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子區(qū)域中天然存在的多態(tài)性可被用于測(cè)定表達(dá)中的天然變化，特別是同疾病(尤其是癌癥)相關(guān)的表達(dá)變化。
或者，可將突變引入該啟動(dòng)子區(qū)域以在實(shí)驗(yàn)定義(experimentallydefined)系統(tǒng)中測(cè)定改變表達(dá)的作用。用于對(duì)參與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的特定DNA基元進(jìn)行鑒定的方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如，與已知結(jié)合基元的序列相似性、凝膠延遲(gel retardation)研究等。
調(diào)控序列可被用于鑒定表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控所需的順式作用序列，特別是在不同的組織和發(fā)育的不同階段進(jìn)行的鑒定，并且可被用于鑒定調(diào)控和介導(dǎo)表達(dá)的順式作用序列和反式作用序列。這樣的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制區(qū)域可被可操作地連接于一種基因，從而促進(jìn)野生型或者目的蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞、胚組織、胎組織或者成體組織中的表達(dá)，并且用于基因治療。
小DNA片段可被用作為PCR引物，雜交篩選探針等等。較大的DNA片段，即，大于100nt的片段可被用于所編碼多肽的生產(chǎn)。對(duì)于諸如PCR這樣的擴(kuò)增反應(yīng)，應(yīng)使用一對(duì)引物。在優(yōu)選的情況下所選擇的引物對(duì)應(yīng)產(chǎn)生一種至少約為50nt的擴(kuò)增產(chǎn)物，在優(yōu)選的情況下至少約為100-300nt。用于引物序列的選擇的算法通常是已知的，并且可在商品化的軟件包中獲得。擴(kuò)增引物同DNA的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交并且將進(jìn)行相向引導(dǎo)。
DNA可被用于在生物物種中鑒定基因的表達(dá)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特定核苷酸序列的存在，例如基因組DNA或RNA的存在進(jìn)行檢定的方法在文獻(xiàn)中已經(jīng)被較好地確立。簡(jiǎn)而言之，從細(xì)胞樣品中分離DNA或者mRNA。通過(guò)RT-PCR對(duì)該mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，使用反轉(zhuǎn)錄酶以形成一個(gè)互補(bǔ)DNA鏈，隨后使用對(duì)DNA序列特異的引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增?；蛘?，通過(guò)凝膠電泳分離該mRNA序列，將其轉(zhuǎn)移至一個(gè)適當(dāng)?shù)闹С治?，例如硝酸纖維素、尼龍等，并且隨后使用該DNA的片段作為探針進(jìn)行檢定。還可使用其它的方法，例如寡核苷酸連接分析、原位雜交以及對(duì)陣列于固體芯片上的DNA探針進(jìn)行雜交等等。同序列進(jìn)行雜交的mRNA的檢測(cè)指示了樣品中的基因表達(dá)。
本發(fā)明的基因序列，包括側(cè)生啟動(dòng)子區(qū)域和編碼區(qū)域，可通過(guò)多種本領(lǐng)域所知的方式進(jìn)行突變，從而在啟動(dòng)子強(qiáng)度、編碼蛋白序列等等中產(chǎn)生目的變化。具有這樣的突變的DNA序列或者蛋白質(zhì)產(chǎn)物通?；旧项愃朴诒疚乃峁┑男蛄?，即，分別只在至少一個(gè)核苷酸或者氨基酸上有變化，可能在至少兩個(gè)但不多于十個(gè)核苷酸或者氨基酸上有變化。該序列變化可為替換、插入、缺失或者它們的組合。這些缺失可進(jìn)一步包括較大的變化，例如缺失某個(gè)區(qū)域或者外顯子。其它的目的修飾包括表位標(biāo)記，例如，通過(guò)FLAG系統(tǒng)、HA等等進(jìn)行的表位標(biāo)記。對(duì)于亞細(xì)胞定位的研究，可使用具有綠色熒光蛋白(GFP)的融合蛋白。
本發(fā)明的核酸可被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的非人類動(dòng)物或者在細(xì)胞系中產(chǎn)生位點(diǎn)特異性基因修飾。由此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非人類的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該動(dòng)物含有一種核酸分子作為整合入該動(dòng)物基因組的轉(zhuǎn)基因，該核酸分子含有一種PPN/MG61序列，該序列同一種啟動(dòng)子可操作性地連接從而使編碼PPN/MG61的核酸分子在細(xì)胞或者動(dòng)物中表達(dá)。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可通過(guò)同源重組產(chǎn)生，其中內(nèi)源基因座有所改變?；蛘撸瑢⒁环N核酸分子隨機(jī)地整合進(jìn)入該基因組。用于穩(wěn)定整合的載體包括質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒和其它動(dòng)物病毒，YAC等等。
經(jīng)修飾的細(xì)胞或者動(dòng)物可用于基因功能和調(diào)控的研究。例如，可在宿主的天然基因中產(chǎn)生一系列小規(guī)模缺失和/或替換以測(cè)定不同的外顯子在癌癥發(fā)生、信號(hào)傳導(dǎo)等中的作用。令人產(chǎn)生興趣的是這些基因?qū)τ跇?gòu)建用于癌癥的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的應(yīng)用，其中該蛋白的表達(dá)特異性地降低或者缺乏。具體的目的構(gòu)建體包括反義構(gòu)建體、小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)卡RNA(shRNA)，該RNA阻斷PPN/MG61的表達(dá)；顯性隱性突變的表達(dá)；以及基因的過(guò)表達(dá)。當(dāng)引入某個(gè)序列時(shí)，被引入的序列可以是宿主動(dòng)物的天然基因序列的全部或者部分，或者是對(duì)于宿主動(dòng)物來(lái)說(shuō)是外源序列的全部或者部分，例如本發(fā)明的人類序列。諸如Lac Z這樣的可檢測(cè)標(biāo)記可被引入該基因座，其表達(dá)的上調(diào)將導(dǎo)致表型上易于檢測(cè)的變化。
還可以在一些細(xì)胞或者組織中表達(dá)基因，例如PPN/MG61基因或其變體，其表達(dá)水平在所述細(xì)胞或者組織中的正常情況下不存在，或者在發(fā)育的異常時(shí)間內(nèi)表達(dá)。還可以產(chǎn)生一些宿主細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的宿主細(xì)胞)，這些細(xì)胞含有一種異源核酸分子，該分子編碼一種多肽，該多肽具有調(diào)控內(nèi)源PPN/MG61啟動(dòng)子或者其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的功能。
用于同源重組的DNA構(gòu)建體應(yīng)含有人類基因的至少一部分或者宿主動(dòng)物天然基因的至少一部分，其中該基因具有所需的遺傳修飾，并且含有目標(biāo)基因座的同源區(qū)域。用于進(jìn)行隨機(jī)整合的DNA構(gòu)建體不需要含有介導(dǎo)重組的同源區(qū)域。為方便起見(jiàn)，包括入用于陽(yáng)性和陰性選擇的標(biāo)記。用于通過(guò)同源重組而產(chǎn)生具有目的基因修飾的方法在本領(lǐng)域中是已知的。
對(duì)于胚性干細(xì)胞(ES)，可利用ES細(xì)胞系或者可從宿主中新鮮獲得胚細(xì)胞，宿主的例子如小鼠、大鼠、豚鼠等。這樣的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)睦w維原細(xì)胞飼養(yǎng)(fibroblast-feeder)層上進(jìn)行生長(zhǎng)或者在存在白細(xì)胞抑制因子(LIF)的情況下生長(zhǎng)。當(dāng)ES或者胚細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化時(shí)，它們可被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在轉(zhuǎn)化之后，這些細(xì)胞可被鋪于適當(dāng)培養(yǎng)基的飼養(yǎng)層上。含有該構(gòu)建體的細(xì)胞可通過(guò)使用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。在使這些克隆生長(zhǎng)的充分時(shí)間后，將這些細(xì)胞檢出并且分析是否發(fā)生該構(gòu)建體的同源重組或者整合。陽(yáng)性克隆可隨后被用于胚操作和胚泡注射。胚泡獲自4到6周大的排卵過(guò)度的雌體。用胰酶處理ES細(xì)胞，并且將經(jīng)修飾的細(xì)胞注射進(jìn)入該胚泡的囊胚腔。注射之后，將該胚泡返回偽孕雌體的各個(gè)子宮角。隨后使該雌體足月分娩并對(duì)所產(chǎn)生的后代進(jìn)行該構(gòu)建體的篩選。通過(guò)提供不同表現(xiàn)型的胚泡和遺傳修飾的細(xì)胞可容易地檢測(cè)雜合(chimeric)后代。
對(duì)該雜合動(dòng)物進(jìn)行針對(duì)修飾基因的篩選并且將具有該修飾的雌體和雄體進(jìn)行交配以產(chǎn)生純合后代。如果該基因變化在發(fā)育的某些點(diǎn)上致死，可獲得組織或者器官作為同種異體或者同類系的移植物或者移植體，或者獲得體外培養(yǎng)物。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是任何非人類的哺乳類動(dòng)物，例如實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物、家養(yǎng)動(dòng)物等等。該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可被用于功能性研究、藥物篩選等等，例如，對(duì)某種作用于PPN/MG61活性的候選藥物的效果進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明還提供了一種診斷疾病狀態(tài)的方法，特別是診斷癌癥的方法，該方法基于在目標(biāo)生物樣本中所觀察到的PPN/MG61水平和/或活性以及/或者PPN/MG61多核苷酸的水平而進(jìn)行。本文所使用的樣本包括生物液體，例如血液、腦脊髓液、眼淚、唾液、淋巴液、滲出液、乳腺導(dǎo)管灌洗液(breast ductal lavage fluid)、精液等等；細(xì)胞；器官或者組織培養(yǎng)物所產(chǎn)生的液體；腫瘤活組織檢查樣本；糞便樣品；以及從生理組織中抽提的液體。所述樣本還包括這些液體的衍生物和組分。對(duì)于固體組織可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解離，或者對(duì)組織切片進(jìn)行分析。在替代的情況下可制備這些細(xì)胞的裂解物。
本發(fā)明的檢測(cè)方法可以定性或者定量。因此，本文所使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”、“測(cè)定”等等指的是定性和定量測(cè)定，并且包括“測(cè)量”。
本發(fā)明的檢測(cè)方法包括用于在生物樣品中檢測(cè)PPN/MG61多肽的方法、在生物樣品中檢測(cè)PPN/MG61 mRNA的方法以及在生物樣品中檢測(cè)PPN/MG61的酶活性的方法。
在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)方法提供了在生物樣品(例如血液、血清)中對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法。根據(jù)實(shí)施例中的描述，人類PPN/MG61 mRNA水平在特定癌癥中有所提高，例如在肺癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌和間皮瘤中。由此，同正常(非癌)組織相比較，檢測(cè)到編碼PPN/MG61的mRNA的水平升高，則檢測(cè)到生物樣品中存在癌組織。
這些檢測(cè)方法可作為試劑盒的一部分提供。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于在生物樣品中檢測(cè)PPN/MG61多肽或PPN/MG61多聚核苷酸的存在和水平的試劑盒。使用這些試劑盒的程序方法可被臨床實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)學(xué)從業(yè)人員和個(gè)人所實(shí)施。本發(fā)明的用于檢測(cè)PPN/MG61多肽的試劑盒包括可特異性結(jié)合于PPN/MG61的一個(gè)部分(moiety)，包括PPN/MG61特異性化合物或者抗體，但不限于這些。本發(fā)明的用于檢測(cè)PPN/MG61多聚核苷酸的試劑盒包括特異性與PPN/MG61多聚核苷酸雜交的一個(gè)部分。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的用于檢測(cè)PPN/MG61寡核苷酸的試劑盒，例如檢測(cè)編碼PPN/MG61的mRNA的試劑盒包括一對(duì)核酸，其作為“正向”和“反向”引物發(fā)揮功能，這些引物特異性地對(duì)編碼PPN/MG61的mRNA的cDNA拷貝進(jìn)行擴(kuò)增。這些“正向”和“反向”引物作為一對(duì)被分離的核酸分子提供，各長(zhǎng)約10到200個(gè)核苷酸，該引物對(duì)中的第一核酸分子含有至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，該序列同SEQ ID NO02中的一段核酸序列具有100％的核苷酸相同性，該引物對(duì)中的第二核酸分子含有一個(gè)至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，該序列同SEQ ID NO02中的一段核酸序列的反向互補(bǔ)序列具有100％的核苷酸相同性，其中該第二核酸分子的序列在SEQ ID NO02中位于第一核酸分子的核酸序列的3′。該引物核酸分子可使用任何已知的方法進(jìn)行制備，例如，自動(dòng)合成等等。SEQ ID NO3，4，5，6，7，8，9，10，11和12是正向”和“反向”引物的一些例子。
本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒含有如上所述的一對(duì)核酸。這些核酸存在于適當(dāng)?shù)馁A存介質(zhì)中，例如緩沖溶液，在典型情況下貯存于適當(dāng)?shù)娜萜髦小Ｔ撛噭┖邪ㄔ摵怂釋?duì)，并且可進(jìn)一步包括一種緩沖液、用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的試劑(例如脫氧核苷三磷酸(dATP，dTTP，dCTP，和dGTP)、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、適于PCR的緩沖液，含有離子Mg2+的溶液(例如MgCl2)以及其它本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的用于進(jìn)行PCR，或者反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)或者實(shí)時(shí)RT-PCR的成分)。該試劑盒進(jìn)一步包括該試劑盒的使用指導(dǎo)，該指導(dǎo)可以以多種形式提供，例如印刷資料或者在光盤(pán)上等等。該試劑盒可進(jìn)一步包括從生物樣品(例如，血液、血清樣本、活組織切片樣本等等)中抽提DNA所必需的試劑，以及包括產(chǎn)生mRNA的cDNA拷貝的試劑。根據(jù)下文更為詳盡的描述，該試劑盒可用于診斷應(yīng)用。被分離的核酸分子對(duì)在擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR、RT-PCR或者實(shí)時(shí)RT-PCR)中作為引物使用。
在一些實(shí)施方案中，該第一和/或第二核酸分子含有一種可檢測(cè)標(biāo)記物。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物包括熒光染料，例如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、得克薩斯紅、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、6-羧基熒光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-2′，4，4′，5，7，7′-六氯羧基熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或者N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)，還包括放射活性標(biāo)記物，例如32P、35S、3H等等。該標(biāo)記物可為一種雙程系統(tǒng)(two stage system)，其中該擴(kuò)增DNA被連接于生物素、半抗原等，它們具有一種高親合性結(jié)合配對(duì)分子，例如親合素、特異性抗體等等，其中該結(jié)合配對(duì)分子同一種可檢測(cè)標(biāo)記物連接。該標(biāo)記物可同引物之一或者兩者均連接。或者，在擴(kuò)增中所使用的核苷酸合并物(pool)被標(biāo)記，從而將該標(biāo)記物引入擴(kuò)增產(chǎn)物。
試劑盒可根據(jù)情況提供附加的組分，這些組分可用于所述方法，所述組分包括緩沖液、顯色試劑、標(biāo)記物、反應(yīng)表面、檢測(cè)手段、參照樣品、標(biāo)準(zhǔn)物、指導(dǎo)說(shuō)明以及解釋信息，但不限于這些。
當(dāng)試劑盒提供對(duì)PPN/MG61多肽的檢測(cè)時(shí)，該試劑盒包括一種或者多種特異于該P(yáng)PN/MG61的抗體。在一些實(shí)施方案中，特異于該P(yáng)PN/MG61的抗體受到可檢測(cè)的標(biāo)記。在其它的實(shí)施方案中，特異于該P(yáng)PN/MG61的抗體未受標(biāo)記；而是提供了第二種可檢測(cè)標(biāo)記的抗體，該抗體可同特異于該P(yáng)PN/MG61的抗體(“第一”抗體)結(jié)合。該試劑盒可進(jìn)一步包括封閉試劑、緩沖液以及用于顯色的試劑和/或用于檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)記物的試劑。該試劑盒可進(jìn)一步包括使用指導(dǎo)、參照以及解釋性信息。
當(dāng)試劑盒提供對(duì)PPN/MG61酶活性的檢測(cè)時(shí)，該試劑盒包括一種底物，該底物在受到PPN/MG61作用時(shí)提供一種可檢測(cè)的產(chǎn)物。該試劑盒可進(jìn)一步包括可檢測(cè)標(biāo)記物顯色和檢測(cè)所必需的試劑。該試劑盒可進(jìn)一步包括使用指導(dǎo)、參照以及解釋性信息。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于在生物樣品中檢測(cè)PPN/MG61多肽的存在和/或測(cè)量PPN/MG61多肽的水平的方法，該方法使用一種PPN/MG61特異性抗體。該方法一般包括a)將該樣品同特異于PPN/MG61多肽的抗體進(jìn)行接觸；以及b)檢測(cè)該抗體同該樣品分子之間的結(jié)合。
當(dāng)于適當(dāng)?shù)膮⒄者M(jìn)行對(duì)比時(shí)，PPN/MG61特異性抗體的特異性結(jié)合的檢測(cè)是在該樣品中存在PPN/MG61多肽的跡象。適當(dāng)?shù)膮⒄瞻ㄒ阎缓蠵PN/MG61多肽的樣品；以及一種同非特異于PPN/MG61的抗體相接觸的樣品，例如同抗特異性抗體(anti-idiotypeantibody)接觸的樣品。多種用于檢測(cè)特異性抗體抗原作用的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且可被用于該方法，該檢測(cè)方法包括，標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)方法、免疫沉淀、酶法免疫分析以及放射性免疫，但不限于這些。通常情況下該P(yáng)PN/MG61特異性抗體應(yīng)直接或者間接地進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。直接標(biāo)記包括放射性同位素；具有可檢測(cè)產(chǎn)物的酶(例如，熒光素酶、β-半乳糖苷酶等等)；熒光標(biāo)記(例如，異氰酸熒光素，羅丹明、藻紅蛋白等等)；熒光發(fā)射金屬，例如152Eu或者鑭系的其它金屬，這些金屬通過(guò)諸如EDTA這樣的金屬螯合基團(tuán)連接于抗體；化學(xué)發(fā)光化合物，例如發(fā)光氨、isoluminol、acridinium鹽等等；生物發(fā)光化合物，例如蟲(chóng)熒光素、綠色熒光蛋白等等。
該抗體可連接(偶聯(lián))于某種不溶支持物，例如聚苯乙烯平板或者微球。間接標(biāo)記包括特異于PPN/MG61特異性抗體的二抗，其中該二抗根據(jù)上文描述進(jìn)行標(biāo)記；以及特異性結(jié)合分子對(duì)的成員，例如生物素-親合素等等。該生物學(xué)樣品可同一種固體支持物或者載體之上的固定物進(jìn)行接觸，例如硝酸纖維素，這些支持物或者載體能夠固定化細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)或者可溶蛋白。該支持物可隨后使用適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行洗滌，隨后與PPN/MG61特異性抗體進(jìn)行接觸，該抗體經(jīng)過(guò)可檢測(cè)標(biāo)記。檢測(cè)方法在本領(lǐng)域中已知，并且應(yīng)經(jīng)選擇適合于該可檢測(cè)標(biāo)記所發(fā)射的信號(hào)。通常與適當(dāng)?shù)膮⒄蘸瓦m當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比以完成檢測(cè)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一些方法，這些方法適于在生物樣品中檢測(cè)PPN/MG61酶活性的存在和/或測(cè)量PPN/MG61酶活性的水平。這些方法一般涉及到a)將該樣品同一種底物相接觸，該底物在受到PPN/MG61作用時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的產(chǎn)物；以及b)檢測(cè)該酶反應(yīng)的產(chǎn)物。
任何?；衔锞m于本分析的應(yīng)用，所述?；衔镌谕ㄟ^(guò)PPN/MG61的酰基轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行?；呀獾那闆r下，導(dǎo)致吸收度、熒光或者其它適于檢測(cè)的物理性質(zhì)變化。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一些方法，這些方法用于在生物樣品中檢測(cè)PPN/MG61 mRNA的存在。這些方法可被用于，例如，對(duì)影響PPN/MG61基因表達(dá)的某種化合物進(jìn)行直接或者間接估測(cè)。這些方法一般包括a)在允許雜交的條件下將該樣品同本發(fā)明的PPN/MG61多聚核苷酸進(jìn)行接觸；以及b)對(duì)可能存在的雜交進(jìn)行檢測(cè)。
在同適當(dāng)?shù)膮⒄者M(jìn)行對(duì)比的情況下對(duì)雜交的檢測(cè)是PPN/MG61多聚核苷酸存在的顯示跡象。適當(dāng)?shù)膮⒄瞻?，例如，已知不含有PPN/MG61 mRNA的樣品，以及使用與PPN/MG61 mRNA“同義”的標(biāo)記多聚核苷酸。允許雜交的條件在本領(lǐng)域中已知，并且在上文中有更詳盡的描述。使用經(jīng)標(biāo)記的PPN/MG61多聚核苷酸可以通過(guò)任何已知的方法完成檢測(cè)，這些方法包括，原位雜交、PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR和“Northern”或者RNA印跡，或者這些方法的組合，但不限于這些。用于這些多聚核苷酸的多種標(biāo)記物和標(biāo)記方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且可被用于本發(fā)明的分析方法。特異性雜交可通過(guò)與適當(dāng)?shù)膮⒄者M(jìn)行對(duì)比而進(jìn)行測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，這些方法涉及到在生物樣品中產(chǎn)生某種mRNA的一個(gè)cDNA拷貝，并且使用一對(duì)分離的核酸作為擴(kuò)增反應(yīng)(例如，PCR)中的正向和反向引物對(duì)該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。該核酸對(duì)中的各個(gè)核酸分子長(zhǎng)度介于10到200核苷酸之間，該引物對(duì)中的第一核酸分子含有一個(gè)至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，該序列同SEQ IDNO02中的一段核酸序列具有100％的核苷酸相同性，該引物對(duì)中的第二核酸分子含有一個(gè)至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，該序列同SEQID NO02中的一段核酸序列的反向互補(bǔ)序列具有100％的核苷酸相同性，其中該第二核酸分子的序列位于SEQ ID NO02中第一核酸分子的核酸序列的3’。該引物核酸分子使用任何已知的方法進(jìn)行制備，例如，自動(dòng)合成等等。SEQ ID NO3，4，5，6，7，8，9，10，11和12是正向”和“反向”引物的一些例子。
使用PCR擴(kuò)增的方法可對(duì)于單一細(xì)胞中的DNA進(jìn)行，盡管使用至少約105個(gè)細(xì)胞比較方便。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的使用的描述見(jiàn)Saiki etal.(1985)Science 239487，當(dāng)前方法的綜述可見(jiàn)于Sambrook，et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，CSH Press 1989，pp.14.2-14.33。在該擴(kuò)增反應(yīng)中可含有一種可檢測(cè)標(biāo)記物。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物包括熒光染料，例如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、得克薩斯紅、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、6-羧基熒光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-2′，4，4′，5，7，7′-六氯羧基熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或者N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)，還包括放射活性標(biāo)記物，例如32P、35S、3H等等。該標(biāo)記物可為一種雙程系統(tǒng)(two stagesystem)，其中該擴(kuò)增DNA被連接于生物素等，它們具有一種高親合性結(jié)合配對(duì)分子，例如親合素、特異性抗體等等，其中該結(jié)合配對(duì)分子同一種可檢測(cè)標(biāo)記物連接。該標(biāo)記物可同引物之一或者兩者均連接。或者，在擴(kuò)增中所使用的核苷酸合并物被標(biāo)記，從而將該標(biāo)記物引入擴(kuò)增產(chǎn)物。
多種方法可用于在特定的組織中測(cè)定某種基因或者蛋白質(zhì)的表達(dá)水平?？赏ㄟ^(guò)多種方法進(jìn)行診斷從而在患者的樣品中測(cè)定正?；蛘弋惓５腜PN/MG61的存在與否或者量的改變。例如，檢測(cè)可利用對(duì)細(xì)胞或者組織切片進(jìn)行染色根據(jù)傳統(tǒng)方法而實(shí)施，該染色使用標(biāo)記抗體進(jìn)行。細(xì)胞受到透化處理以對(duì)胞質(zhì)分子染色。向該細(xì)胞樣品中加入目的抗體，并且保溫足夠的時(shí)間以允許對(duì)表位的結(jié)合，該時(shí)間通常為約10分鐘。該抗體可使用放射性同位素、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光物或者其它用于直接檢測(cè)的標(biāo)記?；蛘?，使用第二抗體或者試劑擴(kuò)增該信號(hào)。這樣的試劑在本領(lǐng)域中為人所熟知。例如，第一抗體可同生物素進(jìn)行偶聯(lián)，加入同辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的親合素作為第二試劑?；蛘撸诙贵w偶聯(lián)于一種熒光化合物，例如熒光素、羅丹明、得克薩斯紅等等。最終的檢測(cè)使用一種在過(guò)氧化物酶存在下發(fā)生顏色變化的底物。結(jié)合抗體的存在與否可通過(guò)多種方法進(jìn)行檢測(cè)，這些方法包括對(duì)分散細(xì)胞的流式細(xì)胞儀、顯微鏡、放射顯影、閃爍計(jì)數(shù)等等。
在替代的情況下可以著眼于PPN/MG61基因的表達(dá)?？梢赃M(jìn)行生化研究以測(cè)定在編碼區(qū)域或者控制區(qū)域的序列多態(tài)性是否同疾病相關(guān)。同疾病相關(guān)的多態(tài)性可能包括影響蛋白質(zhì)活性的基因缺失或者截短，改變表達(dá)水平的突變等等。
可能影響基因的表達(dá)水平的啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列的變化可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的多種方法與正常的等位基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。用于測(cè)定啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子強(qiáng)度的方法包括對(duì)被表達(dá)的天然蛋白的定量；將多種控制元件插入具有報(bào)告基因的載體，該報(bào)告基因的例子如氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、熒光素酶、β-半乳糖苷酶等等，該基因可提供方便的定量；等等。
用于對(duì)特異性序列，例如對(duì)疾病相關(guān)的多態(tài)性進(jìn)行核酸分析的方法有很多。在可以獲得大量DNA的情況下，直接使用基因組DNA?；蛘?，將該目標(biāo)區(qū)域克隆進(jìn)入適當(dāng)?shù)妮d體并且增長(zhǎng)至足以用于分析的量。表達(dá)該基因的細(xì)胞可被用作為mRNA的來(lái)源，該mRNA可被直接分析或者進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成為cDNA以用于分析。該核酸可以通過(guò)傳統(tǒng)的方法，例如PCR，進(jìn)行擴(kuò)增以提供足以用于分析的量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的使用的描述見(jiàn)Saiki et al.(1985)Science 239487，當(dāng)前方法的綜述可見(jiàn)于Sambrook，et al.Molecular CloningA LaboratoryManual，CSH Press 1989，pp.14.2-14.33?；蛘撸诒绢I(lǐng)域中已知多種方法可以利用寡核苷酸連接作為檢測(cè)多態(tài)性的方法，例如Riley et al.(1990)，Nucl.Acids Res.182887-2890；以及Delahunty et al.(1996)，Am.J Hum.Genet.581239-1246。
在該擴(kuò)增反應(yīng)中可含有一種可檢測(cè)標(biāo)記物。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物包括熒光染料，例如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、得克薩斯紅、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、6-羧基熒光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-2′，4，4′，5，7，7′-六氯羧基熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或者N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)，還包括放射活性標(biāo)記物，例如32P、35S、3H等等。該標(biāo)記物可為一種雙程系統(tǒng)(two stagesystem)，其中該擴(kuò)增DNA被連接于生物素等，它們具有一種高親合性結(jié)合配對(duì)分子，例如親合素、特異性抗體等等，其中該結(jié)合配對(duì)分子同一種可檢測(cè)標(biāo)記物連接。該標(biāo)記物可同引物之一或者兩者均連接?；蛘撸跀U(kuò)增中所使用的核苷酸合并物被標(biāo)記，從而將該標(biāo)記物引入擴(kuò)增產(chǎn)物。
核酸分子，例如經(jīng)擴(kuò)增或者克隆的片段，通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行分析。核酸可以通過(guò)雙脫氧或者其它方法進(jìn)行測(cè)序，并且將堿基序列同野生型序列相比較。通過(guò)Southern印跡、點(diǎn)印跡等方法與變化序列的雜交也可已被用于測(cè)定其存在。參照組以及多種變化序列與固定化于固體支持物的寡核苷酸探針陣列的雜交模式可被用作為檢測(cè)變化序列的存在的手段。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)以及凝膠基質(zhì)中的異源雙鏈分析可被用于根據(jù)電泳遷移率而檢測(cè)由DNA序列變化所導(dǎo)致的構(gòu)象變化。或者，當(dāng)多態(tài)性產(chǎn)生或者破壞了某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)的情況下，使用該內(nèi)切酶消化該樣品并且對(duì)該產(chǎn)物大小進(jìn)行分級(jí)以測(cè)定是否該片段被消化。分級(jí)可通過(guò)凝膠或者毛細(xì)管電泳而進(jìn)行，特別是丙烯酰胺或者瓊脂糖凝膠。
在該基因中對(duì)突變的篩選可根據(jù)該蛋白的功能性或者抗原性特征而進(jìn)行。蛋白質(zhì)截短分析可被用于檢測(cè)可影響該蛋白質(zhì)生物活性的缺失。篩選中可使用多種設(shè)計(jì)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)多態(tài)性的免疫分析。在多種不同的遺傳突變導(dǎo)致某種特定的疾病表現(xiàn)型的情況下，功能性蛋白質(zhì)分析已證明是有效的篩選工具。該編碼蛋白的活性可通過(guò)與野生型蛋白質(zhì)的比較而測(cè)定。
本發(fā)明的針對(duì)表達(dá)水平的診斷方法在典型的情況下涉及到目的樣品的核酸豐度同參照值的比較，從而測(cè)定任何相對(duì)變化，其中該變化可被定量和/或定性測(cè)定，隨后將該變化同某種異常的表達(dá)模式的存在與否相關(guān)聯(lián)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知多種在樣品中測(cè)定核酸豐度的不同方法，其中令人感興趣的特定方法包括在Pietu et al.，Genome Res.(June 1996)6492-503；Zhao et al.，Gene(Apr.24，1995)156207-213；Soares，Curr.Opin.Biotechnol.(October 1997)8542-546；Raval，J.Pharmacol Toxicol Methods(November 1994)32125-127；以及Chalifour et al.，Anal.Biochem(Feb.1，1994)216299-304中所描述的方法。
本發(fā)明提供了用于對(duì)調(diào)控PPN/MG61酶活性的藥物進(jìn)行鑒定的篩選方法，提供了用于對(duì)在細(xì)胞中調(diào)控PPN/MG61多肽水平的藥物進(jìn)行鑒定的篩選方法；以及提供了用于對(duì)在細(xì)胞中調(diào)控PPN/MG61mRNA水平的藥物進(jìn)行鑒定的篩選方法；用于對(duì)調(diào)控PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放的藥物進(jìn)行鑒定的篩選方法。在一些實(shí)施方案中，該分析為無(wú)細(xì)胞分析。在其它的實(shí)施方案中，該分析為基于細(xì)胞的分析。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)控”包括“提高”和“降低”。在一些實(shí)施方案中，受到關(guān)注的是抑制PPN/MG61活性的藥物，以及/或者在細(xì)胞中降低PPN/MG61多肽的水平，和/或在細(xì)胞中降低PPN/MG61mRNA的水平以及/或者降低PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放的藥物。這樣的藥物作為治療癌癥的候選物受到關(guān)注。在其它的實(shí)施方案中，受到關(guān)注的是提高PPN/MG61活性的藥物，這樣的藥物可用于治療某些失調(diào)，這些失調(diào)可通過(guò)提高血管發(fā)生而進(jìn)行治療，例如，局部缺血癥狀。
術(shù)語(yǔ)“候選藥物”、“藥物”、“物質(zhì)”和“化合物”在本文可互換使用。候選藥物包括多種化學(xué)類別，在典型情況下為合成、半合成或天然存在的有機(jī)或者無(wú)機(jī)分子。候選藥物可為有機(jī)小化合物，其分子量高于50并且低于約2,500道爾頓。候選藥物可含有一些功能性基團(tuán)，這些基團(tuán)是與蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)作用所必需的，特別是氫鍵，并且可包括至少一種氨基、羰基、羥基或者羧基基團(tuán)，并且可含有至少兩種這些功能性化學(xué)基團(tuán)。該候選藥物可含有碳環(huán)或者雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香族或者多芳香族結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)中受到一種或者多種上述功能性基團(tuán)的取代。候選藥物同樣可從生物分子中尋求，這些分子包括肽、糖、脂肪酸、固醇、嘌呤、嘧啶，這些分子的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或者它們的組合。
候選藥物可從多種來(lái)源中獲得，這些來(lái)源包括合成或者天然化合物的庫(kù)(libraries)。例如，多種手段可被用于大量有機(jī)化合物和生物分子的隨機(jī)合成或者定向合成，這包括隨機(jī)寡核苷酸和寡肽的表達(dá)?；蛘?，可獲得或者容易地產(chǎn)生以細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物抽提物的形式存在的天然化合物的庫(kù)。另外，天然或者合成產(chǎn)生的庫(kù)和化合物可通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法進(jìn)行方便地修飾，并且可被用于產(chǎn)生組合庫(kù)。已知的藥學(xué)試劑可被用于直接或者隨機(jī)的化學(xué)修飾，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等等，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
在篩選分析是一種結(jié)合分析的情況下，一種或者多種這些分子可被連接于一種標(biāo)記物，其中該標(biāo)記物可直接或者間接提供一種可檢測(cè)信號(hào)。多種標(biāo)記物包括放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光物、酶、特異性結(jié)合分子、顆粒，例如磁性顆粒，等等。特異性結(jié)合分子包括分子對(duì)，例如生物素和鏈親合素、地高辛和抗地高辛等等。對(duì)于特異性結(jié)合成員，互補(bǔ)性的成員在正常情況下使用可根據(jù)已知程序進(jìn)行檢測(cè)的分子進(jìn)行標(biāo)記。
該篩選分析中可包括多種其它試劑。這些試劑包括的例子如鹽、中性蛋白(例如白蛋白)、去污劑等等，這些試劑被用于輔助蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的最佳結(jié)合和/或降低非特異性或者背景相互作用?？梢允褂靡恍┨岣叻治鲂实脑噭?，例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物藥物等等。這些成分的混合物可以以任何可以產(chǎn)生必需結(jié)合的次序進(jìn)行添加。保溫在任何適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行，典型情況下介于4℃到40℃。保溫耗時(shí)可針對(duì)最佳活性進(jìn)行選擇，但也可以經(jīng)優(yōu)化而輔助迅速的高通量篩選。典型情況下0.1到1小時(shí)應(yīng)當(dāng)是充足的。
本發(fā)明提供了一些方法對(duì)調(diào)控本發(fā)明的PPN/MG61多肽的酶活性的藥物進(jìn)行鑒定。該術(shù)語(yǔ)“調(diào)控”包括被測(cè)PPN/MG61活性同適當(dāng)參照相比有所提高或者降低。
上文提及的方法一般包括a)將測(cè)試藥物與含有PPN/MG61多肽的樣品進(jìn)行接觸；以及b)在存在該物質(zhì)的情況下對(duì)PPN/MG61的?；D(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行分析。同適當(dāng)?shù)膮⒄盏腜PN/MG61活性(例如，在缺乏被測(cè)物質(zhì)的情況下含有PPN/MG61多肽的樣品)相比PPN/MG61活性的降低顯示該物質(zhì)調(diào)控PPN/MG61的酶活性。
本文所使用的“調(diào)控PPN/MG61多肽的?；D(zhuǎn)移酶活性的藥物”描述的是任意的分子，例如合成或者天然的有機(jī)或者無(wú)機(jī)化合物、蛋白質(zhì)或者藥物，這些分子根據(jù)本文所述具有改變調(diào)控PPN/MG61多肽的?；D(zhuǎn)移酶活性的能力。一般情況下，多種分析混合物可在不同的藥物濃度下進(jìn)行平行作用以獲得對(duì)不同濃度的不同反應(yīng)。在典型的情況下，一種濃度可作為陰性參照，即，在零濃度或者低于檢測(cè)水平的濃度。?；D(zhuǎn)移酶活性可以使用本領(lǐng)域所知的任何激酶分析進(jìn)行測(cè)量。
在通過(guò)?；D(zhuǎn)移酶活性對(duì)?；牧呀庾饔孟拢a(chǎn)生吸光度、熒光或者其它易于檢測(cè)的物理性質(zhì)的任何?；衔锞m于本分析的應(yīng)用。
在特定的實(shí)施方案中，使用了一種含35S標(biāo)記的物質(zhì)。35S的釋放使用任何適當(dāng)?shù)姆治鲞M(jìn)行測(cè)量，例如閃爍計(jì)數(shù)等等。
在其它實(shí)施方案中，該物質(zhì)含有一種?；糠郑坏；ㄟ^(guò)?；D(zhuǎn)移酶的作用而被釋放，該部分便提供一種可檢測(cè)信號(hào)。?；D(zhuǎn)移酶活性可通過(guò)測(cè)量熒光進(jìn)行檢測(cè)。該分析可特別適用于高通量形式(high-through-put format)。
同適當(dāng)?shù)膮⒄战M相比較，調(diào)控PPN/MG61多肽的酰基轉(zhuǎn)移酶活性的藥物將活性提高或者降低了至少約10％，至少約15％，至少約20％，至少約25％，較為優(yōu)選的情況下至少約50％，更為優(yōu)選的情況下至少約100％或者兩倍，更為優(yōu)選的情況下至少約5倍，更為優(yōu)選的情況下至少約10倍或更多。
在理想程度上提高或者降低PPN/MG61多肽的酰基轉(zhuǎn)移酶活性的藥物可經(jīng)選擇用于進(jìn)一步研究，并且對(duì)細(xì)胞可用性(availability)、細(xì)胞毒作用、生物相容性等等進(jìn)行估測(cè)。
在某些實(shí)施方案中，降低PPN/MG61多肽的?；D(zhuǎn)移酶活性的藥物受到特別關(guān)注。在產(chǎn)生療效的各種情況下，對(duì)?；D(zhuǎn)移酶活性的最大抑制通常不是必需的，或者甚至并不理想。降低PPN/MG61多肽的?；D(zhuǎn)移酶活性的藥物可用于降低腫瘤細(xì)胞所刺激的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和/或血管發(fā)生，并且由此而可被用于治療癌癥。
在某些實(shí)施方案中，提高PPN/MG61多肽的酰基轉(zhuǎn)移酶活性的藥物受到特別關(guān)注。提高PPN/MG61多肽的酰基轉(zhuǎn)移酶活性的藥物可用于提高血管發(fā)生，并且由此而可被用于治療局部缺血癥狀。
基于細(xì)胞的方法包括對(duì)調(diào)控PPN/MG61 mRNA水平和/或PPN/MG61多肽水平的藥物進(jìn)行檢測(cè)的方法以及對(duì)調(diào)控PPN/MG61從真核細(xì)胞中釋放的藥物進(jìn)行檢測(cè)的方法。
對(duì)候選藥物可能對(duì)分析中使用的細(xì)胞產(chǎn)生的任何細(xì)胞毒作用進(jìn)行分析，該分析使用眾所周知的分析而進(jìn)行，例如臺(tái)盼藍(lán)染色排除，MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物)分析等等。不表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性的藥物被視作為候選藥物。
分析中使用的細(xì)胞通常為哺乳細(xì)胞，這些細(xì)胞包括人類細(xì)胞，但不限于此。這些細(xì)胞可為原代細(xì)胞培養(yǎng)物或者為永生化細(xì)胞系。
多種基于細(xì)胞的分析可被用于對(duì)調(diào)控PPN/MG61 mRNA水平的藥物進(jìn)行鑒定以及對(duì)調(diào)控PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放的藥物進(jìn)行鑒定，這些方法使用，例如，以含有編碼PPN/MG61的cDNA的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化哺乳類細(xì)胞從而使該cDNA過(guò)表達(dá)，或者，在替代的情況下，使用一種含有PPN/MG61啟動(dòng)子的構(gòu)建體，該啟動(dòng)子同一種報(bào)告基因連接。
因此，本發(fā)明提供了一種用于鑒定藥物，特別是鑒定生物活性藥物的方法，該藥物在細(xì)胞中調(diào)控PPN/MG61表達(dá)水平，該方法包括將待測(cè)的候選藥物同一種細(xì)胞進(jìn)行組合，該細(xì)胞含有一種編碼PPN/MG61多肽的核酸；以及測(cè)定所述的藥物對(duì)于PPN/MG61表達(dá)的效果。PPN/MG61表達(dá)水平的“調(diào)控”包括，同缺乏該待測(cè)藥物的參照組相比，提高或者降低PPN/MG61 mRNA水平和/或提高或者降低該P(yáng)PN/MG61多核苷酸所編碼的PPN/MG61多肽水平。與未加入藥物的參照相比較，在將該細(xì)胞與待測(cè)候選藥物進(jìn)行接觸后，在PPN/MG61 mRNA和/或PPN/MG61多肽水平(即含量)上提高或者降低約1.25倍，通常至少約1.5倍，通常至少約2倍，通常至少約5倍，通常至少為約10倍或者更多是該藥物調(diào)控了PPN/MG61表達(dá)的指示跡象。
受到測(cè)量的PPN/MG61 mRNA和/或PPN/MG61多肽可以由內(nèi)源PPN/MG61多核苷酸編碼或者可以由包含于重組載體并且引入該細(xì)胞的PPN/MG61多核苷酸編碼，即，該P(yáng)PN/MG61 mRNA和/或PPN/MG61多肽可被外源PPN/MG61多核苷酸編碼。例如，一個(gè)重組載體可含有經(jīng)分離的PPN/MG61轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子序列，該序列與一種報(bào)告基因(例如，β-半乳糖苷酶、CAT熒光酶或者其它易于進(jìn)行表達(dá)分析的基因)可操作地連接。在這些實(shí)施方案中，用于對(duì)在細(xì)胞中調(diào)控PPN/MG61表達(dá)水平的藥物進(jìn)行鑒定的方法包括將待測(cè)的候選藥物同一種細(xì)胞相組合，該細(xì)胞含有一種核酸，該核酸含有一種PPN/MG61轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，該元件同報(bào)告基因可操作地連接；以及測(cè)定所述的藥物對(duì)于該報(bào)告基因表達(dá)的效果。重組載體可含有一種被分離的的PPN/MG61轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如啟動(dòng)子序列，該序列與編碼PPN/MG61多肽的序列可操作地連接，或者該轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列同某種PPN/MG61融合蛋白的編碼序列可操作地連接，該融合蛋白含有PPN/MG61多肽，該P(yáng)PN/MG61多肽與可以輔助檢測(cè)的多肽進(jìn)行融合。在這些實(shí)施方案中，該方法包括，將待測(cè)的候選藥物同一種細(xì)胞相組合，該細(xì)胞含有一種核酸，該核酸含有一種PPN/MG61轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，該元件同PPN/MG61多肽編碼序列可操作地連接；以及測(cè)定所述的藥物對(duì)于PPN/MG61表達(dá)的效果，該測(cè)定可通過(guò)測(cè)量該細(xì)胞所產(chǎn)生的PPN/MG61 mRNA、PPN/MG61多肽或者PPN/MG61融合多肽的量而進(jìn)行。
基于細(xì)胞的分析一般包括的步驟有將該細(xì)胞同待測(cè)藥物進(jìn)行接觸、形成測(cè)試樣品以及在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后估測(cè)該藥物對(duì)PPN/MG61表達(dá)的效果。參照樣品含有相同的細(xì)胞但不添加入候選藥物。在該測(cè)試樣品和參照樣品中測(cè)量PPN/MG61的表達(dá)水平。在該測(cè)試樣品和參照樣品的PPN/MG61表達(dá)水平之間進(jìn)行比較。例如，當(dāng)使用產(chǎn)生PPN/MG61的表達(dá)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化哺乳細(xì)胞系時(shí)，可根據(jù)上文描述對(duì)PPN/MG61 mRNA的水平進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量。用于使該藥物與細(xì)胞相接觸的適當(dāng)?shù)臅r(shí)間長(zhǎng)度可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，并且一般為足以使該藥物進(jìn)入該細(xì)胞并且使該藥物對(duì)PPN/MG61 mRNA和/或多肽水平具有可測(cè)量的效果的時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間介于10分鐘和24小時(shí)，更典型的情況下約1-8小時(shí)。
測(cè)量PPN/MG61 mRNA水平的方法在本領(lǐng)域中是已知的，其中多種方法在上文有所描述，這些方法中的任何一種均可被用于本發(fā)明的方法以對(duì)在細(xì)胞中調(diào)控PPN/MG61 mRNA水平的藥物進(jìn)行鑒定，這些方法包括，PCR，例如使用經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記的寡核苷酸引物進(jìn)行的PCR，RT-PCR，實(shí)時(shí)RT-PCR以及多種雜交分析，但不限于這些。類似地，PPN/MG61多肽水平可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)量，其中多種方法在上文有所描述，這些方法包括諸如ELISA這樣的免疫分析，例如使用一種經(jīng)可檢測(cè)標(biāo)記的特異于PPN/MG61多肽的抗體進(jìn)行的ELISA，但不限于這些。
篩選分析可以包括多種其它的試劑。所包括的試劑如鹽、諸如白蛋白這樣的中性蛋白，去污劑等等，這些試劑可用于輔助最佳的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合和/或降低非特異性或者背景相互作用?？梢允褂锰岣咴摲治龅男实脑噭?，例如蛋白酶抑制劑、核酸抑制劑、抗微生物藥物等等。
這些篩選方法可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種不同的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，其中可以使用多種分析配置和方案。例如，這些組分之一可結(jié)合于某種固體支持物，并且其余的組分同結(jié)合于該支持物的組分進(jìn)行接觸。該方法的上述組分可基本上同時(shí)或者在不同時(shí)間進(jìn)行組合。保溫在任何適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行；典型的情況下介于4到40℃。保溫耗時(shí)可針對(duì)最佳活性進(jìn)行選擇，但也可以經(jīng)優(yōu)化而促進(jìn)迅速的高通量篩選。典型情況下0.1到1小時(shí)應(yīng)當(dāng)是充足的。在這些接觸和保溫步驟之后，本方法在一般情況下進(jìn)一步包括一個(gè)洗滌步驟以除去會(huì)在檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生背景信號(hào)的標(biāo)記，例如放射活性或者熒光標(biāo)記的非特異性結(jié)合的組分，但并非必須如此。在根據(jù)情況而進(jìn)行的洗滌步驟之后，隨即檢測(cè)結(jié)合復(fù)合物的存在。
通過(guò)上述方法可對(duì)多種不同的候選藥物進(jìn)行篩選。候選藥物包括多種化學(xué)類別，在典型情況下為合成、半合成或天然存在的有機(jī)或者無(wú)機(jī)分子。候選藥物可為有機(jī)小化合物，其分子量高于50并且低于約2,500道爾頓。候選藥物可含有一些功能性基團(tuán)，這些基團(tuán)是與蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)作用所必需的，特別是氫鍵，并且可包括至少一種氨基、羰基、羥基或者羧基基團(tuán)，并且可含有至少兩種這些功能性化學(xué)基團(tuán)。該候選藥物可含有碳環(huán)或者雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香族或者多芳香族結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)中受到一種或者多種上述功能性基團(tuán)的取代。候選藥物同樣可從生物分子中尋求，這些分子包括肽、糖、脂肪酸、固醇、嘌呤、嘧啶，這些分子的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或者它們的組合。
候選藥物可從多種來(lái)源中獲得，這些來(lái)源包括合成或者天然化合物的庫(kù)。例如，多種手段可被用于大量有機(jī)化合物和生物分子的隨機(jī)合成或者定向合成，這包括隨機(jī)化寡核苷酸和寡肽的表達(dá)?；蛘?，可獲得或者容易地產(chǎn)生以細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物抽提物的形式存在的天然化合物的庫(kù)。另外，天然或者合成產(chǎn)生的庫(kù)和化合物可通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法進(jìn)行方便地修飾，并且可被用于產(chǎn)生組合庫(kù)。已知的藥學(xué)試劑可被用于直接或者隨機(jī)的化學(xué)修飾，例如?；⑼榛ⅤセⅤ０坊鹊?，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
用于對(duì)調(diào)控PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放的藥物進(jìn)行鑒定的方法一般包括將正常產(chǎn)生PPN/MG61的細(xì)胞同測(cè)試藥物進(jìn)行接觸，并且對(duì)PPN/MG61釋放的影響進(jìn)行測(cè)定。
PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放的“調(diào)控”包括，同缺乏該待測(cè)藥物的參照組相比，提高或者降低PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放。與未加入藥物的參照相比較，在將該細(xì)胞與待測(cè)候選藥物進(jìn)行接觸后，在PPN/MG61 mRNA和/或PPN/MG61多肽水平(即含量)上提高或者降低約1.25倍，通常至少約1.5倍，通常至少約2倍，通常至少約5倍，通常至少約10倍或者更多是該藥物調(diào)控了PPN/MG61表達(dá)的指示跡象。
基于細(xì)胞的分析一般包括的步驟有將該細(xì)胞同待測(cè)藥物進(jìn)行接觸、形成測(cè)試樣品以及在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后估測(cè)該藥物對(duì)PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放的效果。參照樣品含有相同的細(xì)胞但不添加入候選藥物。在該測(cè)試樣品和參照樣品中測(cè)量PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放。在該測(cè)試樣品和參照樣品的PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放之間進(jìn)行比較?？梢允褂脗鹘y(tǒng)的方法測(cè)量PPN/MG61的活性，以此估測(cè)PPN/MG61從真核細(xì)胞中的釋放。例如，當(dāng)使用產(chǎn)生PPN/MG61的表達(dá)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化哺乳細(xì)胞系時(shí)，可根據(jù)上文描述對(duì)從真核細(xì)胞中的釋放的PPN/MG61酶活性進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量，或者可根據(jù)上文描述對(duì)PPN/MG61多肽的水平進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量。用于使該藥物與細(xì)胞相接觸的適當(dāng)?shù)臅r(shí)間長(zhǎng)度可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，并且一般為足以使該藥物進(jìn)入該細(xì)胞(如果必需)，或者同該細(xì)胞進(jìn)行其它的作用(例如，與細(xì)胞表面成分)并且使該藥物對(duì)PPN/MG61釋放具有可測(cè)量的效果的時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，適當(dāng)?shù)臅r(shí)間介于10分鐘和24小時(shí)，更典型的情況下約1-8小時(shí)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用本發(fā)明的篩選分析而鑒定出的藥物，以及含有這些藥物的組合物，這些組合物包括藥物組合物。這些組合物可以使用眾所周知的試劑和方法進(jìn)行配制。在一些實(shí)施方案中，這些組合物以制劑形式提供，該制劑含有藥用賦形劑。本領(lǐng)域中已知多種藥用賦形劑，并且在本文中無(wú)需進(jìn)一步討論。藥用賦形劑在多種出版物中易被充分地描述，這些出版物包括，例如，A.Gennaro(2000)“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，”20th edition，Lippincott，Williams，& Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(1999)H.C.Ansel et al.，eds.，7thed.，Lippincott，Williams，& Wilkins；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.，eds.，3rded.Amer.Pharmaceutical Assoc.。
這些藥用賦形劑，例如佐劑、載體或者稀釋劑，易于為公眾所獲得。更進(jìn)一步，藥用物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、滲透液調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑等等，易于為公眾所獲得。
本發(fā)明的核酸組合物和多肽組合物還可以在需要提高宿主體內(nèi)PPN/MG61活性的情況下作為藥物，特別是提高該多肽的活性，或者用于在特定的解剖位置提供PPN/MG61活性。
在一些實(shí)施方案中，PPN/MG61在一種藥物組合物中被提供，該藥物組合物具有一種藥用賦形劑。
這些基因、基因片段或者被編碼的蛋白或者蛋白質(zhì)片段可用于治療同PPN/MG61相關(guān)的失調(diào)?？梢允褂帽磉_(dá)載體向細(xì)胞內(nèi)引入該基因。這樣的載體一般在該啟動(dòng)子序列附近具有方便的限制性位點(diǎn)，用于提供核酸序列的插入。轉(zhuǎn)錄盒可經(jīng)制備而含有一種轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、該目標(biāo)基因或其片段，以及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。可將該轉(zhuǎn)錄盒引入多種載體，例如質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒；腺病毒等等，其中該載體在這些細(xì)胞中瞬時(shí)地或者穩(wěn)定地維持，通常維持至少約一天的時(shí)間，更通常的情況下維持至少約數(shù)天到數(shù)周。
基因或者蛋白質(zhì)可以通過(guò)多種途徑被引入組織或者宿主細(xì)胞，這些途徑包括病毒感染、微注射或者囊泡融合。噴射(jet)注射也可被用于肌肉間給藥，描述見(jiàn)Furth et al.(1992)，Anal Biochem 205365-368。該DNA可被包被于金微粒之上，并且通過(guò)顆粒轟擊設(shè)備(particlebombardment device)或者“基因槍”進(jìn)行皮內(nèi)遞送，描述見(jiàn)文獻(xiàn)(例見(jiàn)，Tang et al.(1992)，Nature 356152-154)，其中這些金微粒被DNA所包埋，隨后被轟擊進(jìn)入皮膚細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該活性藥物在宿主體內(nèi)調(diào)控編碼目的蛋白的基因的表達(dá)，通常情況下對(duì)其進(jìn)行削弱或者下行調(diào)節(jié)。例如，反義分子、小干擾RNA(siRNA)、短發(fā)卡RNA(shRNA)可被用于在細(xì)胞中對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行下行調(diào)節(jié)。該反義試劑可以是反義寡核苷酸(ODN)，特別是來(lái)自天然核酸而具有化學(xué)修飾的合成的ODN，或者是這樣的RNA形式反義分子的核酸構(gòu)建體。該ODN、siRNA和shRNA序列同該目標(biāo)基因的mRNA或者cDNA互補(bǔ)，并且抑制該目標(biāo)基因產(chǎn)物的表達(dá)?？梢杂肙DN、siRNA和shRNA分子之一或者組合進(jìn)行給藥，其中一種組合可以包括多種不同的序列。
反義序列、siRNA和shRNA分子可以通過(guò)對(duì)適當(dāng)?shù)妮d體中的目的基因序列的全部或者部分進(jìn)行表達(dá)而產(chǎn)生，其中該轉(zhuǎn)錄起始的定向使得一個(gè)反義鏈作為RNA分子而產(chǎn)生。或者，反義、siRNA和shRNA分子是合成的。
反義寡核苷酸、siRNA和shRNA分子可以通過(guò)本領(lǐng)域中所示的方法進(jìn)行合成。優(yōu)選的寡核苷酸來(lái)自天然磷酸二酯結(jié)構(gòu)并有化學(xué)修飾，從而提高這些核苷酸的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和結(jié)合親合性。本領(lǐng)域中已對(duì)多種這樣的改變骨架、糖或者雜環(huán)堿基的化學(xué)性的修飾進(jìn)行了描述。
在骨架化學(xué)性上的有用變化有硫代磷酸酯；非橋(non-bridging)氧被硫所取代的二硫代磷酸酯；亞磷酰胺；烷基磷酸三酯以及boranophosphates。非手性磷酸衍生物包括3′-O′-5′-S-硫代磷酸酯、3′-S-5′-O-硫代磷酸酯、3′-CH2-5′-O-膦酸鹽以及3′-NH-5′-O-亞磷酰胺。肽核酸以肽的連接取代了整個(gè)核糖磷酸二酯骨架。糖修飾也可被用于增強(qiáng)穩(wěn)定性和親合性?？梢允褂妹撗鹾颂堑摩?異頭物(anomer)，其中堿基依天然α-異頭物進(jìn)行反轉(zhuǎn)。該核糖的2′-OH可經(jīng)改變以形成2′-O-甲基或者2′-O-烯丙基糖，該糖提供了對(duì)降解的抗性而不損害親和性。雜環(huán)堿基的修飾必須維持適當(dāng)?shù)膲A基配對(duì)。一些可用的替換包括以脫氧尿嘧啶代替脫氧胸腺嘧啶；以5-甲基-2′-脫氧胞嘧啶和5-溴-2′-脫氧胞嘧啶代替脫氧胞嘧啶。5-丙炔基-2′-脫氧尿苷和5-丙炔基-2′-脫氧胞苷已被證明當(dāng)分別替代脫氧胸腺嘧啶和脫氧胞嘧啶時(shí)提高了親合性和生物活性。
本發(fā)明提供了多種治療方法。在一些實(shí)施方案中，提供了調(diào)控蛋白質(zhì)的酶活性的方法，包括對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)和抑制。本方法在對(duì)多種不同病癥的治療中找到用途，這些病癥包括，癌癥；炎癥；可通過(guò)提高Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和/或血管發(fā)生而影響的失調(diào)，如局部缺血性失調(diào)；以及血栓癥，但不限于這些。
宿主或者患者可來(lái)自于任何哺乳類物種，例如靈長(zhǎng)類，特別是人類。用于實(shí)驗(yàn)性探索的動(dòng)物模型令人關(guān)注，這些模型提供了人類疾病治療的模型。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“藥物”指的是調(diào)控具有酶學(xué)活性的PPN/MG61的水平的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，藥物為通過(guò)本發(fā)明的篩選分析所鑒定的藥物?！罢{(diào)控具有酶學(xué)活性的本PPN/MG61的水平”包括提高或者降低PPN/MG61的酶活性；提高或和降低具有酶學(xué)活性PPN/MG61蛋白的水平；以及提高或者降低編碼具有酶學(xué)活性的PPN/MG61蛋白的mRNA水平。在一些實(shí)施方案中，藥物為PPN/MG61，其中該P(yáng)PN/MG61自身被用于對(duì)個(gè)體進(jìn)行給藥。在一些實(shí)施方案中，藥物為特異于PPN/MG61的抗體。
可通過(guò)降低PPN/MG61活性和/或降低PPN/MG61多肽或者mRNA水平而影響的病癥包括與腫瘤中的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和/或血管發(fā)生的促進(jìn)相關(guān)的病癥或由其導(dǎo)致的病癥。由此，本方法可用于降低Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和/或血管發(fā)生所誘導(dǎo)的腫瘤。在一些實(shí)施方案中提供了一些方法用于治療癌癥。這些實(shí)施方案中的某些方案中，提供了用于降低腫瘤生長(zhǎng)的方法。在其它的實(shí)施方案中提供了用于降低分化因子從ECM中的釋放的方法。
降低腫瘤生長(zhǎng)的方法以及降低PPN/MG61活性的方法通常包括，以某種降低酶活性PPN/MG61的水平的藥物對(duì)個(gè)體進(jìn)行給藥。同適當(dāng)?shù)膮⒄障啾龋行Я康乃幬锝档土嗣富钚訮PN/MG61水平至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約40％，至少約50％或者更多。同適當(dāng)?shù)膮⒄障啾龋行Я康乃幬锝档土四[瘤生長(zhǎng)至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約40％，至少約50％或者更多。
提供了降低因子從ECM中的釋放的方法，這些因子的例子如生長(zhǎng)因子和分化因子。這些方法一般包括，以某種降低酶活性PPN/MG61水平的藥物對(duì)個(gè)體進(jìn)行給藥，其中酶活性PPN/MG61水平的降低導(dǎo)致了因子從腫瘤附近或者周邊的ECM中釋放的降低。
分化和生長(zhǎng)因子包括，Wnt、纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、肝素結(jié)合的類EGF生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、Wnt家族的分泌糖蛋白的成員，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-β、骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白、GM-CSF以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，但不限于這些可以使用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療的腫瘤包括，惡性瘤，例如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、惡性黑素瘤、導(dǎo)管瘤、子宮內(nèi)膜瘤、胃癌、胰腺癌、間皮瘤、口腔黏膜發(fā)育異常(dysplastic oralmucosa)、侵入性口腔癌、transitional and squamous cell urinarycarcinoma等等；還包括神經(jīng)惡性增生，例如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等等；血液惡性病變，例如兒童急性白血病、非霍杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、惡性皮膚T細(xì)胞(malignant cutaneous T-cells)、蕈樣霉菌病、非MF皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、T細(xì)胞富集皮膚淋巴增生(T-cell rich cutaneouslymphoid hyperplasia)、大皰性類天皰瘡、盤(pán)狀紅斑狼瘡、扁平苔癬等等。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何手段可對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)是否被抑制或者降低進(jìn)行估測(cè)，這些方法包括，測(cè)量腫瘤體積；對(duì)腫瘤是否增殖進(jìn)行測(cè)定，例如使用3H-摻入分析；以及/或者對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，但不限于這些。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低炎癥的方法，該方法包括提高酶活性PPN/MG61的水平。在一些實(shí)施方案中，該方法包括以PPN/MG61對(duì)個(gè)體進(jìn)行給藥。在其它的實(shí)施方案中，該方法包括以藥物(例如，通過(guò)上文所述的篩選方法所鑒定的藥物)對(duì)個(gè)體進(jìn)行給藥，其中所述的藥物為在個(gè)體中提高酶活性PPN/MG61水平的藥物。醫(yī)療有效量的藥物的量足以從相當(dāng)比例的配基中除去?；糠郑瑥亩寡装Y被防止或者改善。由此，本文在炎癥的上下文中所使用的“治療”應(yīng)指的是防止或者改善炎癥以及/或者炎癥相關(guān)的癥狀。
為測(cè)定用于給藥的PPN/MG61或者藥物的劑量，必須注意不可指望完全除去所有的?；鶊F(tuán)。為進(jìn)行正常的治療，在發(fā)生傷口、感染或者疾病狀態(tài)的區(qū)域的組織中必須送入至少一部分白血細(xì)胞或者嗜中性細(xì)胞。用于給藥PPN/MG61或者藥物的量根據(jù)患者的特定需求而進(jìn)行調(diào)整，同時(shí)應(yīng)考慮多種因素，例如待治療的疾病類型。
這些PPN/MG61和/或藥物可被用于治療多種疾病，包括諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、類肉狀瘤病、過(guò)敏性肺炎、多發(fā)性硬化、同種異體移植物排異以及淋巴瘤向皮膚位置的擴(kuò)布。本發(fā)明的組合物應(yīng)可應(yīng)用于治療任何疾病狀態(tài)，其中該免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)而對(duì)抗身體，導(dǎo)致了白細(xì)胞在組織中積累的程度使之引發(fā)組織損傷、腫脹、炎癥和/或病痛。例如，當(dāng)大量白血細(xì)胞迅速進(jìn)入患病區(qū)域的關(guān)節(jié)并且進(jìn)攻周邊組織時(shí)產(chǎn)生了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥。
在一些實(shí)施方案中，該發(fā)明提供了用于增強(qiáng)血管發(fā)生的方法。這些方法一般涉及到，以一種有效量的PPN/MG61對(duì)患有癥狀的哺乳動(dòng)物進(jìn)行給藥，該癥狀可通過(guò)增強(qiáng)血管發(fā)生而進(jìn)行治療。在許多實(shí)施方案中，PPN/MG61對(duì)某一解剖位置進(jìn)行局部給藥。
根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行的治療所影響的癥狀和疾病的例子包括與血管阻塞相關(guān)的任何癥狀，例如動(dòng)脈、靜脈或者毛細(xì)系統(tǒng)的阻塞。這樣的癥狀和疾病的具體例子包括，冠狀動(dòng)脈阻塞疾病、頸動(dòng)脈阻塞疾病、動(dòng)脈阻塞疾病、末梢動(dòng)脈阻塞疾病、動(dòng)脈硬化癥、myointimalhyperplasia(例如，由于血管手術(shù)或者氣囊血管成形術(shù)或者vascularstenting)、閉塞性血栓性管炎、成血栓失調(diào)、脈管炎等等，但未必限于這些。使用本發(fā)明的方法可以預(yù)防的癥狀和疾病的例子包括，多種局部缺血癥狀中(例如，心肌缺血、四肢缺血、中風(fēng)相關(guān)的缺血)的任何一種，心臟病發(fā)作(心肌梗塞)或者其它與血流減弱相關(guān)的血管壞死、中風(fēng)、四肢壞死或者喪失等等，但未必限于這些。
由此，本發(fā)明提供了治療缺血癥狀的方法。以有效量的PPN/MG61進(jìn)行的給藥促進(jìn)了血管發(fā)生，其結(jié)果是對(duì)缺血組織血液供應(yīng)的提高。同適當(dāng)?shù)膮⒄障啾?，在以PPN/MG61進(jìn)行給藥之后，對(duì)缺血組織的血液供應(yīng)(血流)提高了至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約50％，至少約75％，至少約100％或者更多?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域所已知的任何方法對(duì)局部缺血組織的血液供應(yīng)是否提高進(jìn)行測(cè)量，這些方法包括，溫度記錄(thermnography)、紅外記錄；透皮PO2，透皮PCO2、激光多普勒、多普勒波形、距肱指數(shù)(ankle brachial index)、脈搏體積記錄(pulse volume recording)、趾壓(toe pressure)、雙波形(duplex waveform)、磁共振成像影、同位素沖失(isotope washout)以及NAD/NADH熒光分光密度，但不限于這些。這些方法在本領(lǐng)域中為人所熟知，并且在多個(gè)出版物中已被描述。
血管發(fā)生是否有所提高可以使用本領(lǐng)域中任何已知的方法進(jìn)行測(cè)定，這些方法包括，例如，刺激新生血管向浸以松弛素的植入物內(nèi)的生成；刺激血管在角膜或者前眼室內(nèi)的生長(zhǎng)；刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移或者體外管形成；以及雞絨膜尿囊膜分析；倉(cāng)鼠頰囊分析；聚乙烯醇綿盤(pán)分析(polyvinyl alcohol sponge disk assay)。這些分析在本領(lǐng)域中為人熟知并且在多種出版物中有所描述，這些出版物包括，例如Auerbach et al.((1991)Pharmac.Ther.511-11)，在此引為參考。
如上所述，一種有效量的活性藥物(例如，小分子、抗PPN/MG61抗體或者PPN/MG61)被用于對(duì)該宿主進(jìn)行該藥，其中“有效量”指的是足以產(chǎn)生所需結(jié)果的劑量。在一些實(shí)施方案中，所需的結(jié)果至少為PPN/MG61酶活性同參照相比的降低。在其它的實(shí)施方案中，該所需結(jié)果為PPN/MG61酶活性同參照相比的提高(在個(gè)體中，或者在該個(gè)體的局部解剖位置)。
在典型的情況下，本發(fā)明的組合物應(yīng)含有的活性成分介于低于1％到約95％，優(yōu)選的情況下介于約10％到約50％之間。一般情況下，對(duì)兒童應(yīng)以約100mg到約500mg進(jìn)行給藥，對(duì)成人應(yīng)以約500mg到約5g進(jìn)行給藥。給藥一般情況下通過(guò)注射進(jìn)行并且通常通過(guò)注射對(duì)局部區(qū)域進(jìn)行給藥。給藥的頻率應(yīng)當(dāng)基于患者反應(yīng)考慮決定。其它有效劑量可由本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通過(guò)試驗(yàn)產(chǎn)生的劑量反應(yīng)曲線容易地測(cè)定。
為計(jì)算PPN/MG61的量，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用容易獲得的有關(guān)除去給定量PPN/MG61所必需的酶量的信息。例如，如果給定的酶具有的活性可使一個(gè)單位的酶在生理pH下從底物中進(jìn)行1微摩爾/分鐘的SO4的消除，則出于治療目的應(yīng)對(duì)70kg的人類以1到10單位進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。提高酶活性PPN/MG61水平所必需的藥物的量可以通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。例如，通過(guò)對(duì)提高?；鶊F(tuán)從給定量的底物中的去除所必需的藥物量進(jìn)行計(jì)算并且估測(cè)待治療區(qū)域中該底物(或其體內(nèi)對(duì)應(yīng)物)的量，可以測(cè)定用于給藥的藥物的量。該藥物量理應(yīng)根據(jù)所使用的特定藥物而有所變化。
在本發(fā)明的方法中，活性藥物可以使用任何方便的手段進(jìn)行給藥，該手段能夠?qū)е滤璧腜PN/MG61活性抑制。由此，該藥物可被引入用于治療性給藥的多種制劑。更特定的情況下，本發(fā)明的藥物可通過(guò)與適當(dāng)?shù)乃幱幂d體或者稀釋劑進(jìn)行組合而被配制入藥物組合物，并且可被配制入固體、半固體、液體或者氣體形式的制劑，例如藥片、膠囊、粉末、顆粒、藥膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑和氣溶膠。
同樣地，這些藥物的施用可以以多種方式完成，包括經(jīng)口、口腔、直腸、非腸胃道、皮內(nèi)、透皮、intracheal等等給藥。
在藥學(xué)藥劑的形式下，該藥物可以以其藥用鹽的形式進(jìn)行給藥，或者它們可被單獨(dú)使用或者同其它的藥學(xué)活性化合物進(jìn)行適當(dāng)?shù)仃P(guān)聯(lián)使用以及組合使用。以下的方法和賦形劑僅是例子，絕非限制。
對(duì)于口腔制劑，該藥物可被單獨(dú)使用或與適當(dāng)?shù)奶砑觿┙M合使用，從而產(chǎn)生藥片、粉末、顆粒和膠囊，例如與傳統(tǒng)添加劑組合，如乳糖、甘露糖、玉米淀粉或者馬鈴薯淀粉；與粘合劑相組合，例如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹(shù)膠、玉米淀粉或者明膠；與崩解劑(disintegrator)相組合，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或者羧甲基纖維素鈉；與潤(rùn)滑劑相組合，例如滑石或者硬脂酸鎂；并且如果需要，與稀釋劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑和調(diào)味劑相組合。
適當(dāng)?shù)馁x形劑載體為，例如，水、鹽、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及它們之間的組合。另外，如果需要，該載體可含有最小量的輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或者乳化劑或者pH緩沖劑。制備這些藥劑形式的實(shí)際方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知或者顯而易見(jiàn)。例見(jiàn)Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，17thedition，1985。用于給藥的組合物或者制劑在任何情況下應(yīng)含有一定量足以在待治療對(duì)象體內(nèi)獲得所需狀態(tài)的氯酸鹽/硒酸鹽以及/或者PPN/MG61。
通過(guò)溶解、懸浮或者乳化于含水溶劑或者非水溶劑中，該藥物可被配制成為用于注射的制劑，非水溶劑的例子如植物油或者其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、丙二醇或者高級(jí)脂肪酸酯；如果需要，可含有傳統(tǒng)的添加劑，例如增溶劑、等滲藥物、懸浮藥物、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。
該藥物可被用于氣溶膠制劑從而通過(guò)吸入進(jìn)行給藥。本發(fā)明的化合物可被配制進(jìn)入可加壓的推進(jìn)劑，例如二氟二氯甲烷、丙烷、氮等等。
進(jìn)一步，該藥物可通過(guò)與多種基質(zhì)進(jìn)行混合而被制入栓劑，例如與乳化基質(zhì)或者水溶基質(zhì)混合。本發(fā)明的化合物可通過(guò)栓劑進(jìn)行直腸給藥。該栓劑可包括的載體如可可油、碳蠟和聚乙二醇，這些栓劑在體溫下融化，而在室溫下為固態(tài)。
所提供的用于口腔或者直腸給藥的單位劑量形式，例如糖漿、酏劑以及懸浮物，其中每劑量單位，如每茶匙量、每湯匙量、每片或者每栓，含有預(yù)定量的組合物，該組合物含有一種或者多種抑制劑。類似地，用于注射或者靜脈內(nèi)給藥的單位劑量可在組合物中含有抑制劑，該組合物為無(wú)菌水溶液、生理鹽水或者另一種藥用載體。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“單位劑量形式”指的是實(shí)際中不連續(xù)的單位，該單位適用作人類或者動(dòng)物對(duì)象的一個(gè)單元的劑量，每單位含有預(yù)定量的本發(fā)明的化合物，該量經(jīng)計(jì)算足以產(chǎn)生所需的效果，該化合物同藥用稀釋劑、載體或者負(fù)載物聯(lián)合。用于本發(fā)明的新單位劑量形式的規(guī)格取決于所使用的特定化合物以及需獲得的效果，以及各化合物在宿主體內(nèi)所關(guān)聯(lián)的藥效學(xué)。
藥用賦形劑，例如佐劑、載體或者稀釋劑，易于為公眾所得。進(jìn)一步，藥學(xué)上可接受的輔助性物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑等等，易于為公眾所得。
當(dāng)藥物為一種多肽、多聚核苷酸，它們的類似物或者擬似物(mimetic)，例如反義序列、siRNA或者shRNA組合物的情況下，該藥物可通過(guò)任意途徑被引入組織或者宿主細(xì)胞，這些途徑包括病毒感染、微注射或者囊泡融合。噴射注射也可被用于肌肉間給藥，描述見(jiàn)Furth et al.(1992)，Anal Biochem 205365-368。該DNA可被包被于金微粒之上，并且通過(guò)顆粒轟擊設(shè)備或者“基因槍”進(jìn)行皮內(nèi)遞送，描述見(jiàn)文獻(xiàn)(例見(jiàn)，Tang et al.(1992)，Nature 356152-154)，其中這些金微粒被DNA所包埋，隨后被轟擊進(jìn)入皮膚細(xì)胞。
技術(shù)人員應(yīng)會(huì)認(rèn)同，劑量水平可根據(jù)具體化合物、癥狀嚴(yán)重程度以及受試者對(duì)副作用的敏感度而變化。對(duì)于給定化合物的優(yōu)選的劑量易于被本領(lǐng)域中的技術(shù)人員通過(guò)多種手段所測(cè)定。
治療指的是使與困擾該對(duì)象的病癥相關(guān)的癥狀至少有所緩和，其中的緩和被廣義地用于指同待治療的病癥相關(guān)的某一參數(shù)，例如癥狀，程度的降低，病癥的例子如炎癥及其相關(guān)的病痛。同樣，治療還包括該病癥或者至少其相關(guān)的癥狀被完全抑制，例如，防止其發(fā)生，或者完全停止，例如被終止，從而使該宿主不再罹患該病癥或至少不再罹患該病癥的特征癥狀。
多種宿主根據(jù)本方法是可治療的。一般情況下，這些宿主是“哺乳動(dòng)物”或者“哺乳類”，其中這些術(shù)語(yǔ)被廣義地用于描述一些屬于哺乳類的有機(jī)體，這些有機(jī)體包括食肉目(例如，犬和貓)、嚙齒目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)以及靈長(zhǎng)動(dòng)物(例如人類、黑猩猩和猴)。在許多實(shí)施方案中，該宿主為人類。
根據(jù)上文描述，本發(fā)明的PPN/MG61和藥物自身可被使用，可相互一起使用，或者同藥用賦形劑材料聯(lián)合使用。
提供了具有單位劑量活性藥物的試劑盒，通常是口服或者可注射藥劑。在這些試劑盒中，除含有單位劑量的容器外還應(yīng)有說(shuō)明書(shū)，該說(shuō)明書(shū)描述了該藥物在治療目的病癥中的應(yīng)用和附加優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的化合物和單位劑量為本文上文所述。
在有利的情況下，本發(fā)明的PPN/MG61和藥物可以與至少一種其它的非鉑和含鉑的抗腫瘤藥物一起被用于對(duì)患有惡性增生的對(duì)象進(jìn)行給藥。例如，一種抗PPN/MG61的化合物可以在劑量方案(dosingregimen)中與一種細(xì)胞毒性化合物，例如DNA烷基化藥物，或者與一種抗血管發(fā)生藥物或者抗腫瘤藥物(化合物或者單克隆抗體)一起進(jìn)行給藥，但本發(fā)明不限于此。優(yōu)選的抗腫瘤藥物選自cladribine(2-氯-2′-脫氧-β-D-腺苷)、苯丁酸氮芥((4-[雙(2-氯乙基)氨基]苯丁酸)、DTIC-Dome(5-(3，3-二甲基-1-triazeno)-咪唑-4-甲酰胺)、鉑類化療藥物以及非鉑類化療藥物。含鉑的抗腫瘤藥物包括順鉑(順-二氨絡(luò)二氯鉑)，但不限于此。不含鉑的抗腫瘤藥物包括環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶、表柔比星、氨甲蝶呤、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、博來(lái)霉素和鬼臼乙叉苷，但不限于這些。各種抗腫瘤藥物以醫(yī)療有效量?jī)?nèi)給藥，該量在本領(lǐng)域中為人所熟知，并且根據(jù)所使用的藥物、惡性增生類型以及其它癥狀有所變化。
實(shí)施例以下的實(shí)施例用于為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員提供有關(guān)如何實(shí)施和使用本發(fā)明的完整披露和描述，并且這些例子并非意在對(duì)本發(fā)明者所認(rèn)為的發(fā)明范圍進(jìn)行限制，亦非意指下文的實(shí)驗(yàn)是被實(shí)施的全部實(shí)驗(yàn)而且是僅可實(shí)施的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例1人類正常和癌細(xì)胞系中的PPN/MG61表達(dá)我們使用半定量RT-PCR研究了PPN/MG61 mRNA在多種人類癌細(xì)胞系中的表達(dá)以及在正常人類原代細(xì)胞中的表達(dá)(圖1)。我們所測(cè)試的人類癌細(xì)胞系包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)(A549、H460、H838和H1703)、乳腺癌(MCF-7，BT474和HuL100)、惡性多間皮瘤細(xì)胞系(H513，H2052，H290，MS-1和H28)、結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480)、頭頸癌細(xì)胞系(U87)、子宮頸癌(Hela)、肉瘤細(xì)胞系(Mes-SA、Saos-2和A204)。我們所測(cè)試的正常人類原代細(xì)胞為小氣管上皮細(xì)胞(SAEC)、支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)以及正常的間皮細(xì)胞(LP-9)。制備了來(lái)自各個(gè)細(xì)胞類型的總RNA并且等量的總RNA被用于各個(gè)RT-PCR分析。在各個(gè)樣品中對(duì)一種持家(housekeeping)基因GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增并被用作為內(nèi)參和加樣量對(duì)照。在所有三種正常的人類細(xì)胞培養(yǎng)物中，未見(jiàn)到PPN/MG61 mRNA的表達(dá)(圖1)。與之對(duì)比，在我們所測(cè)試的所有人類癌細(xì)胞系中均觀察到了高水平的PPN/MG61 mRNA的表達(dá)(圖1)。這些結(jié)果提示，PPN/MG61在多種或者所有人類癌細(xì)胞系中被高度表達(dá)，但在正常人類細(xì)胞中未檢測(cè)到。
實(shí)施例2PPN/MG61在人類正常和癌癥肺組織樣品中的表達(dá)我們下一步使用半定量RT-PCR在原代非小細(xì)胞癌(NSCLC)組織樣品和它們?cè)谕瑯踊颊唧w內(nèi)所對(duì)應(yīng)的正常肺樣品中檢測(cè)了PPN/MG61 mRNA的表達(dá)(圖2)。經(jīng)受對(duì)腫瘤的治療性初步切除的患者的新鮮肺癌組織和鄰近的正常肺組織在手術(shù)時(shí)被收集，并且立即速凍于液氮之中。這些組織樣品，在液氮冷凍器中保存于-170℃直至使用。
隨后從這些新鮮切除的肺癌和同樣患者的自體對(duì)應(yīng)的正常肺組織中制備總RNA，并且將等量的總RNA用于各個(gè)RT-PCR分析。在我們所測(cè)試的24個(gè)對(duì)應(yīng)人類非癌和癌化肺組織樣品中，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)應(yīng)的正常肺組織樣品相比，幾乎所有的(23個(gè))肺癌組織樣品(95.8％)過(guò)表達(dá)了PPN/MG61 mRNA(圖2)。在所有的正常肺樣品中僅觀察到了最低的或者無(wú)PPN/MG61表達(dá)。
實(shí)施例3在原代人類間皮瘤組織樣品中的PPN/MG61表達(dá)水平的RT-PCR分析我們還通過(guò)使用半定量RT-PCR在原代間皮瘤組織和正常復(fù)合(plural)組織樣品中檢測(cè)了PPN/MG61 mRNA的表達(dá)。經(jīng)受對(duì)腫瘤的治療性初步切除的患者的新鮮間皮瘤組織和鄰近的正常復(fù)合組織在手術(shù)時(shí)被收集，并且立即速凍于液氮之中。這些組織樣品，在液氮冷凍器中保存于-170℃直至使用。隨后從該患者的新鮮切除的間皮瘤和正常組織中制備總RNA，并且將等量的總RNA用于各個(gè)RT-PCR分析。在我們檢測(cè)的所有的癌化間皮瘤組織樣品中，我們發(fā)現(xiàn)64.7％(17中的11個(gè))的間皮瘤組織樣品過(guò)表達(dá)了PPN/MG61 mRNA(圖3)。在所有的正常組織中未觀察到PPN/MG61表達(dá)。
實(shí)施例4在正常人類血清和來(lái)自癌癥患者的血清樣品中的PPN/MG61表達(dá)水平的RT-PCR分析隨后我們測(cè)試在癌癥患者的血清樣品中是否檢測(cè)到PN/MG61mRNA的頻繁過(guò)表達(dá)。血清樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序從多種癌癥患者中進(jìn)行收集，包括NSCLC、間皮瘤、結(jié)腸癌、惡性黑素瘤、腎癌、食道癌、甲狀腺癌、惡性毒瘤和卵巢癌。隨后在收集血清的三個(gè)小時(shí)內(nèi)從這些血清樣品中制備總RNA，并且用于RT-PCR反應(yīng)(圖4)。在我們所測(cè)試的來(lái)自癌癥患者血清的32個(gè)樣品中，我們發(fā)現(xiàn)93.8％(32中的30個(gè))的樣品過(guò)表達(dá)了PPN/MG61 mRNA(圖4)。在全部八個(gè)正常參照組中未觀察到PPN/MG61的表達(dá)，在參照組中總RNA從八個(gè)不同的正常人的血清中制備(圖4)。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了PPN/MG61 mRNA的過(guò)表達(dá)是否可通過(guò)使用RT-PCR從癌癥患者的血清樣品中直接檢測(cè)而無(wú)需總RNA的分離(圖5)。在該實(shí)驗(yàn)中，所有的血清樣品在收集后未經(jīng)進(jìn)一步處理被直接加入該RT-PCR反應(yīng)(每25μl反應(yīng)系統(tǒng)中1μl血清)。該實(shí)驗(yàn)在血清收集后三個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。36個(gè)循環(huán)之后，我們?cè)?6個(gè)癌癥患者的血清樣品中的10個(gè)(62.5％)檢測(cè)到了PPN/MG61 mRNA的過(guò)表達(dá)。與之對(duì)比，同樣的實(shí)驗(yàn)條件下在全部四個(gè)正常血清樣品中未觀察到PPN/MG61的表達(dá)(圖5)。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了PPN/MG61 mRNA的過(guò)表達(dá)是否可通過(guò)使用RT-PCR從癌癥患者的經(jīng)熱處理的血清樣品中直接檢測(cè)而無(wú)需總RNA的分離(圖6)。在該實(shí)驗(yàn)中，在血清收集后所有的血清樣品在75℃下加熱了10分鐘并且隨后被加入該RT-PCR反應(yīng)(每25μl反應(yīng)系統(tǒng)中1μl熱處理的血清)。該實(shí)驗(yàn)同樣在血清收集后三個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。36個(gè)循環(huán)之后，我們?cè)?2個(gè)癌癥患者的血清樣品中的12個(gè)(54.5％)檢測(cè)到了PPN/MG61 mRNA的過(guò)表達(dá)。與之對(duì)比，同樣的實(shí)驗(yàn)條件下在全部四個(gè)正常血清樣品中未觀察到PPN/MG61的表達(dá)(圖6)。綜上所述，通過(guò)使用不同的方法，我們能夠在收集自癌癥患者的血清樣品中直接以較高的頻率(超過(guò)55％)檢測(cè)到PPN/MG61 mRNA的過(guò)表達(dá)。但是，在相同的條件下，我們?cè)谑占圆煌姆前┌Y人的所有正常血清樣品中未檢測(cè)到PPN/MG61的表達(dá)。
實(shí)施例5PPN/MG61 siRNA在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡并且阻斷了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)為進(jìn)一步理解PPN/MG61在人類NSCLC發(fā)展期間所扮演的角色，我們檢測(cè)了PPN/MG61對(duì)于NSCLC細(xì)胞存活和增殖是否必需，該檢測(cè)通過(guò)使用RNA干擾(RNAi)進(jìn)行的PPN/MG61表達(dá)的敲低而完成。小干擾RNA(siRNA)經(jīng)設(shè)計(jì)并在Qiagen，Inc.合成。隨后遵照Elbashir等人(2001)所描述的方案進(jìn)行RNAi。以PPN/MG61siRNA進(jìn)行4-6天的處理在我們所測(cè)試的表達(dá)PPN/MG61的NSCLC細(xì)胞系中誘導(dǎo)了顯著的細(xì)胞死亡(圖7A和8A，P＜0.001)。但是，在經(jīng)參照siRNA處理后我們未見(jiàn)到顯著的效果。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的殺傷很大程度上是由于在這些細(xì)胞系中所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所致。100nM的PPN/MG61 siRNA誘導(dǎo)了顯著的細(xì)胞凋亡，非沉默siRNA參照未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(100nM)(P＜0.01)(圖7B，8B，和9B)。我們還通過(guò)RT-PCR分析證實(shí)了PPN/MG61 siRNA處理后(100nM，72小時(shí))PPN/MG61表達(dá)的沉默(圖7C、8C、和9C)。非沉默性siRNA用作為參照(100nM，72小時(shí))。為檢測(cè)該細(xì)胞凋亡效果是否與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的抑制相關(guān)，我們顯示在經(jīng)PPN/MG61 siRNA處理(圖7C、8C、和9C)后胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白和存活蛋白(survivin)的表達(dá)水平被下調(diào)。β-肌動(dòng)蛋白在所有實(shí)驗(yàn)中被作為加樣量對(duì)照。
實(shí)施例6PPN/MG61 siRNA在間皮瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡并且阻斷了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。
為進(jìn)一步理解PPN/MG61在人類間皮瘤發(fā)展期間所扮演的角色，我們檢測(cè)了PPN/MG61對(duì)于間皮瘤細(xì)胞的存活和增殖是否必需，該檢測(cè)通過(guò)使用RNAi進(jìn)行的PPN/MG61表達(dá)的敲低而完成。所使用的siRNA與上文描述相同。隨后遵照Elbashir等人(2001)所描述的方案進(jìn)行RNAi。以PPN/MG61 siRNA進(jìn)行4-6天的處理在我們所測(cè)試的表達(dá)PPN/MG61的間皮瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡(圖10)。100nM PPN/MG61 siRNA誘導(dǎo)了顯著的細(xì)胞凋亡，非沉默性siRNA參照未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(100nM)(P＜0.01)(圖10A)。我們還通過(guò)RT-PCR分析證實(shí)了PPN/MG61 siRNA處理后(100nM，72小時(shí))PPN/MG61表達(dá)的沉默(圖10B)。非沉默性siRNA用作為參照(100nM，72小時(shí))。為檢測(cè)該細(xì)胞凋亡效果是否與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的抑制相關(guān)，我們顯示在經(jīng)PPN/MG61 siRNA處理(圖10B)后胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白和存活蛋白的表達(dá)水平被下調(diào)。同樣，β-肌動(dòng)蛋白在所有實(shí)驗(yàn)中被作為加樣量對(duì)照。
實(shí)施例7PPN/MG61 siRNA在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡并且阻斷了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)為進(jìn)一步理解PPN/MG61在人類乳腺癌發(fā)展期間所扮演的角色，我們檢測(cè)了PPN/MG61對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的存活和增殖是否必需，該檢測(cè)通過(guò)使用RNAi進(jìn)行的PPN/MG61表達(dá)的敲低而完成。所使用的siRNA與上文描述相同。隨后遵照Elbashir等人(2001)所描述的方案進(jìn)行RNAi。以PPN/MG61 siRNA進(jìn)行4-6天的處理在我們所測(cè)試的表達(dá)PPN/MG61的乳腺癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡(圖11)。100nM PPN/MG61 siRNA誘導(dǎo)了顯著的細(xì)胞凋亡，非沉默性siRNA參照未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(100nM)(P＜0.01)(圖11A)。我們還通過(guò)RT-PCR分析證實(shí)了PPN/MG61 siRNA處理后(100nM，72小時(shí))PPN/MG61表達(dá)的沉默(圖11B)。非沉默性siRNA用作為參照(100nM，72小時(shí))。為檢測(cè)該細(xì)胞凋亡效果是否與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的抑制相關(guān)，我們顯示在經(jīng)PPN/MG61 siRNA處理(圖11B)后胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白和存活蛋白的表達(dá)水平被下調(diào)。同樣，β-肌動(dòng)蛋白在所有實(shí)驗(yàn)中被作為加樣量對(duì)照。
實(shí)施例8陰性對(duì)照PPN/MG61 siRNA在缺乏PPN/MG61表達(dá)的正常細(xì)胞中未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且來(lái)阻斷Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)為在未觀察到PPN/MG61表達(dá)的正常細(xì)胞中測(cè)試PPN/MG61siRNA的效果，我們將PPN/MG61 siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入兩種不同的缺乏PPN/MG61表達(dá)的正常細(xì)胞培養(yǎng)物(圖12)。在100nM PPN/MG61siRNA處理4-6天之后，與非沉默性siRNA(100nM)參照相比較我們未觀察到顯著的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)(圖12A)。在這些正常的組織中通過(guò)半定量RT-PCR在siRNA處理之前和之后未檢測(cè)到PPN/MG61表達(dá)(100nM，72小時(shí))(圖12B)。非沉默性siRNA用作為參照(100nM，72小時(shí))。通過(guò)證實(shí)胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白和存活蛋白的表達(dá)水平在經(jīng)PPN/MG61 siRNA處理后無(wú)變化，我們還發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)無(wú)抑制(圖12B)。同樣，β-肌動(dòng)蛋白在所有實(shí)驗(yàn)中被用作為加樣量對(duì)照。綜合來(lái)說(shuō)，我們的結(jié)果顯示PPN/MG61的抑制可在表達(dá)PPN/MG61的癌細(xì)胞中特異地和選擇性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在不表達(dá)PPN/MG61的正常細(xì)胞則非如此。這些結(jié)果還提示了PPN/MG61功能和癌細(xì)胞存活之間的強(qiáng)烈聯(lián)系。
實(shí)施例9膜結(jié)合O-?；D(zhuǎn)移酶家族的保守區(qū)域的多排列比較僅顯示了被選擇的蛋白(圖13)。物種和酶的名稱為簡(jiǎn)寫(xiě)AT，擬南芥；BS，枯草芽胞桿菌；CE，線蟲(chóng)；DM，果蠅；HS，人類；MM，小鼠；PA，綠膿桿菌；SA，金黃色葡萄球菌；SC，釀酒酵母；SI，西蒙得木(Simmondsia chinensis)；TP，梅毒螺旋體；ACAT，膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶；DGAT，二?；视蚈-酰基轉(zhuǎn)移酶；WaxSyn，蠟合成酶。在超過(guò)50％的序列中的變化殘基和保守殘基分別以黑色和灰色背景顯示，高度保守的極性殘基以有色背景顯示。排列比較的左側(cè)數(shù)字顯示了在序列中的位置，頂部的黑色條柱顯示了長(zhǎng)疏水區(qū)域。
序列表<110>北京雅康博生物科技有限公司<120>檢測(cè)PPN/MG61表達(dá)的方法及其應(yīng)用<130>
<150>
<151>2004-08-19<160>9<210>1<211>461<212>PRT<213>人PPN/MG61肽序列<400>1matfsrqeff qqllqgcllp taqqgldqiw lllaiclacr llwrlglpsy lkhastvagg 60ffslyhffql hmvwvvllsl lcylvlflcr hsshrgvfls vtiliyllmg emhmvdtvtw 120hkmrgaqmiv amkavslgfd ldrgevgtvp spvefmgyly fvgtivfgpw isfhsylqtv 180qgrplscrwl qkvarslala llclvlstcv gpylfpyfip lngdrllrnk krkargtmvr 240wlrayesavs fhfsnyfvgf lseatatlag agfteekdhl ewdltvskpl nvelprsmve 300vvtswnlpms ywlnnyvfkn alrlgtfsav lvtyaasall hgfsfhlaav llslafityv 360ehvlrkrlar ilsacvlskr cppdcshqhr lglgvralnl lfgalaifhl aylgslfdvd 420vddtteeqgy gmaytvhkws elswashwvt fgcwifyrli g 461<210>2<211>1386<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA序列<400>2
atggccacct ttagccgcca ggaatttttc cagcagctac tgcaaggctg tctcctgcct 60actgcccagc agggccttga ccagatctgg ctgctccttg ccatctgcct cgcctgccgc 120ctcctctgga ggctcgggtt gccatcctac ctgaagcatg caagcaccgt ggcaggcggg 180ttcttcagcc tctaccactt cttccagctg cacatggttt gggtcgtgct gctcagcctc 240ctgtgctacc tcgtgctgtt cctctgccga cattcctccc atcgaggcgt cttcctatcc 300gtcaccatcc tcatctacct actcatgggt gagatgcaca tggtagacac cgtgacatgg 360cacaagatgc gaggggcaca gatgattgtg gccatgaagg cagtgtctct gggcttcgac 420ctggaccggg gcgaggtggg tacggtgccc tcgccagtgg agttcatggg ctacctctac 480ttcgtgggca ccatcgtctt cgggccctgg atatccttcc acagctacct acaaactgtc 540caaggccgcc cactgagctg ccggtggctg cagaaggtgg cccggagcct ggcactggcc 600ctgctgtgcc ttgtgctgtc cacttgcgtg ggcccctacc tcttcccgta cttcatcccc 660ctcaacggtg accgcctcct tcgcaacaag aaacgcaaag ccaggggcac catggtaagg 720tggctgcgag cctacgagag tgctgtctcc ttccacttca gcaactattt tgtgggcttt 780ctttccgagg ccacggccac gttggcgggg gctggcttta ccgaggagaa ggatcacctg 840gaatgggacc tgacggtgtc caagccactg aatgtggagc tgcctcggtc aatggtggaa 900gttgtcacaa gctggaacct gcccatgtct tattggctaa ataactatgt tttcaagaat 960gctctccgcc tggggacctt ctcggctgtg ctggtcacct atgcagccag cgccctccta 1020catggcttca gtttccacct ggctgcggtc ctgctgtccc tggcttttat cacttacgtg 1080gagcatgtcc tccggaagcg cctggctcgg atcctcagtg cctgtgtctt gtcaaagcgg 1140tgcccgccag actgttcgca ccagcatcgc ttgggcctgg gggtgcgagc cttaaacttg 1200ctctttggag ctctggccat cttccacctg gcctacctgg gctccctgtt tgatgtcgat 1260gtggatgaca ccacagagga gcagggctac ggcatggcat acactgtcca caagtggtca 1320gagctcagct gggccagtca ctgggtcact tttggatgct ggatcttcta ccgtctcata 1380ggctga 1386<210>3<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#1_1<400>35’-tacctgaagcatgcaagcac-3’<210>4<211>20
<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#1_2<400>45’-cggtgtctaccatgtgcatc-3’<210>5<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#2_1<400>55’-tcctcagtgcctgtgtcttg-3’<210>6<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#2_2<400>65’-gcatccaaaagtgacccagt-3’<210>7<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#3_1<400>75’-ctcggtcaatggtggaagtt-3’<210>8<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#3_2
<400>85’-caagacacaggcactgagga-3’<210>9<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#4_1<400>95’-tgcctgtgtcttgtcaaagc-3’<210>10<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#4_2<400>105’-gcatccaaaagtgacccagt-3’<210>11<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#5_1<400>115’-ctcggtcaatggtggaagtt-3’<210>12<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物對(duì)#5_2<400>125’-ggtggaaactgaagccatgt-3’
<210>13<211>21<212>RNA<213>人PPN/MG61 siRNA靶序列#1<400>135’-aagttgtcacaagctggaacc-3’<210>14<211>21<212>RNA<213>人PPN/MG61 siRNA靶序列#2<400>145’-aacaagaaacgcaaagccagg-3’
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)量人類PPN/MG61的表達(dá)和酶水平的方法，該方法包括(a)以一種人類PPN/MG61特異性化合物與人類細(xì)胞相接觸從而形成化合物-PPN/MG61的多復(fù)合物；以及(b)通過(guò)檢測(cè)該復(fù)合物的存在而對(duì)該細(xì)胞所表達(dá)的PPN/MG61水平進(jìn)行測(cè)量；其中PPN/MG61特異性化合物選自結(jié)合PPN/MG61的小分子化合物、單特異性抗體或者結(jié)合PPN/MG61的scFv以及核酸探針，所述核酸探針包括反義寡聚物、siRNA以及shRNA，這些探針應(yīng)與PPN/MG61mRNA和/或cDNA雜交，其中PPN/MG61的氨基酸序列為SEQ ID No1，或者任何與Seq ID No1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列。
2.一種用于檢測(cè)人類PPN/MG61的活性和表達(dá)的方法，該方法包括(a)以一種PPN/MG61特異性化合物與第一種細(xì)胞進(jìn)行接觸以形成第一種化合物-PPN/MG61的多復(fù)合物，該細(xì)胞在基礎(chǔ)水平上表達(dá)PPN/MG61；(b)以一種PPN/MG61特異性化合物與第二種細(xì)胞進(jìn)行接觸以形成第二種化合物-PPN/MG61的多復(fù)合物，該細(xì)胞在過(guò)度擴(kuò)增的水平上表達(dá)PPN/MG61；(c)通過(guò)檢測(cè)第一種和第二種多復(fù)合體的存在而對(duì)該第一種和第二種細(xì)胞所表達(dá)的PPN/MG61水平進(jìn)行測(cè)定；(d)對(duì)第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的PPN/MG61水平的差異進(jìn)行測(cè)量；其中PPN/MG61特異性化合物選自結(jié)合PPN/MG61的小分子化合物、單特異性抗體或者結(jié)合PPN/MG61的scFv以及核酸探針，所述核酸探針包括反義寡聚物、siRNA以及shRNA，這些探針應(yīng)與PPN/MG61 mRNA和/或cDNA雜交，其中PPN/MG61的氨基酸序列為SEQ ID No1，或者任何與Seq ID No1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列。
3.一種對(duì)組織進(jìn)行體內(nèi)成像的方法，該方法包括(a)以一種PPN/MG61特異性化合物對(duì)人類進(jìn)行給藥，其中該化合物含有一種可檢測(cè)標(biāo)記物，并且其中該化合物與一種人類細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，該細(xì)胞在過(guò)度擴(kuò)增的水平上表達(dá)PPN/MG61；以及(b)對(duì)該人類組織中的這些細(xì)胞的定位進(jìn)行測(cè)定，該測(cè)定通過(guò)使該可檢測(cè)標(biāo)記物成像而進(jìn)行；其中PPN/MG61特異性化合物選自結(jié)合PPN/MG61的小分子化合物、單特異性抗體或者結(jié)合PPN/MG61的scFv以及核酸探針，所述核酸探針包括反義寡聚物、siRNA以及shRNA，這些探針應(yīng)與PPN/MG61 mRNA和/或cDNA雜交，其中PPN/MG61的氨基酸序列為SEQ ID No1，或者任何與Seq ID No1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列。
4.一種對(duì)抑制PPN/MG61的醫(yī)療有效化合物進(jìn)行篩選的方法，該方法包括(a)以一種PPN/MG61特異性化合物與第一種細(xì)胞進(jìn)行接觸以形成第一種化合物-PPN/MG61的多復(fù)合物，該細(xì)胞在過(guò)度擴(kuò)增的水平上表達(dá)PPN/MG61；(b)以一種PPN/MG61的潛在抑制劑第二種細(xì)胞進(jìn)行接觸以形成第二種化合物-PPN/MG61的多復(fù)合物，該細(xì)胞在過(guò)度擴(kuò)增的水平上表達(dá)PPN/MG61；(c)通過(guò)檢測(cè)第一種和第二種多復(fù)合體的存在而對(duì)該第一種和第二種細(xì)胞所表達(dá)的PPN/MG61水平進(jìn)行測(cè)定；(d)對(duì)第一種和第二種細(xì)胞表達(dá)的PPN/MG61水平的差異進(jìn)行測(cè)量，從而測(cè)定該潛在的抑制化合物對(duì)PPN/MG61的表達(dá)和/或活性的抑制；其中PPN/MG61特異性化合物選自結(jié)合PPN/MG61的小分子化合物、單特異性抗體或者結(jié)合PPN/MG61的scFv以及核酸探針，所述核酸探針包括反義寡聚物、siRNA以及shRNA，這些探針應(yīng)與PPN/MG61 mRNA和/或cDNA雜交，其中PPN/MG61的氨基酸序列為SEQ ID No1，或者任何與Seq IDNo1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞選自腎上腺細(xì)胞、腦細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、脾細(xì)胞、胃細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、子宮細(xì)胞和脈管細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中上皮細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、非膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、腎臟的近小管細(xì)胞、前列腺的平滑肌細(xì)胞、子宮的平滑肌細(xì)胞以及睪丸的平滑肌細(xì)胞。
7.權(quán)利要求5的方法，其中免疫細(xì)胞選自多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、巨大細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞。
8.權(quán)利要求2的方法，其中在過(guò)度擴(kuò)增的水平上表達(dá)PPN/MG61的人類細(xì)胞是癌細(xì)胞或處于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中該癌細(xì)胞選自肺癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、類癌瘤、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、頭頸癌、陰道或睪丸癌、腦瘤、子宮頸癌、食道癌、淋巴瘤、惡性黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎細(xì)胞癌、眼癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化瘤以及白血病。
10.權(quán)利要求8的方法，其中該處于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞選自膠質(zhì)纖維原細(xì)胞、膠質(zhì)單核細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞。
11.PPN/MG61抑制劑化合物在制備用于治療PPN/MG61介導(dǎo)的癌癥的藥物中的用途，其中PPN/MG61抑制劑化合物選自小分子、抗體、scFv、反義寡聚物、小干擾RNA、小發(fā)卡RNA。
12.權(quán)利要求11的用途，其中該P(yáng)PN/MG61抑制劑化合物為一種PPN/MG61特異性化合物。
13.權(quán)利要求12的用途，其中該P(yáng)PN/MG61特異性化合物為一種小分子、肽或單鏈Fv片段。
14.權(quán)利要求12的用途，其中該P(yáng)PN/MG61特異性化合物選自單特異性抗體，該抗體根據(jù)情況經(jīng)一種細(xì)胞毒性藥物的標(biāo)記，該P(yáng)PN/MG61特異性化合物還選自一種核酸探針，該核酸探針根據(jù)情況與PPN/MG61 mRNA雜交。
15.權(quán)利要求11的用途，其中所述藥物與第二種醫(yī)療藥物組合或與化療組合。
16.權(quán)利要求15的用途，其中該第二種醫(yī)療藥物為一種化療藥物。
17.一種藥物組合物，其包含抑制PPN/MG61的化合物和藥用賦形劑。
18.一種藥物組合物，其包含PPN/MG61蛋白和藥用賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)人類Porcupine(PPN)/MG61的水平進(jìn)行比較性檢測(cè)的方法及其應(yīng)用，Porcupine(PPN)/MG61蛋白為膜結(jié)合的O－酰基轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)家族成員，它是果蠅極性基因Porcupine(Porc)的人類同源物。
文檔編號(hào)C12Q1/48GK1737159SQ20041007008
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月19日
發(fā)明者許軍普, 秦曉華 申請(qǐng)人:北京雅康博生物科技有限公司