專利名稱：生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年首先從牛眼玻璃體中分離出的一種高粘性物質(zhì)(Meyer K.，Palmer J.W.The polysaccharideof the vitreous humor.J.biol.chem，1934，107629-634)。此后，人們又對(duì)HA的分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)、生理功能和臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，特別是Balazs于1960年首次將HA用于復(fù)雜的視網(wǎng)膜脫離手術(shù)，并取得了理想的療效之后，有關(guān)HA在醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域的研究又取得了一系列重大的進(jìn)展。HA作為一種生化藥物，不僅在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用廣泛，在日化工業(yè)，特別是化妝品工業(yè)中也有廣闊的應(yīng)用前景(陳同來(lái)。41種生物化學(xué)制品。北京大學(xué)出版社，1996)。
HA最初的生產(chǎn)方法是從動(dòng)物組織(主要是雞冠、牛眼)中提取。這種動(dòng)物組織提取法成本高、HA含量低(一般1kg新鮮雞冠僅可以提取到4gHA)，且分離純化復(fù)雜，提取的HA的分子量也比較小。1937年，Kendall等發(fā)現(xiàn)溶血性鏈球菌streptococcushaemolyticus可以合成透明質(zhì)酸并分泌到胞外形成莢膜(Kendall F.E.Heidelberger M.Dawson M.H.A serologically inactive polysaccharide elaborated by mucoid strain ofgroup A hemolytic Streptococcus.J.Biol.Chem.1937，118(1)61-69)；其后，又陸續(xù)報(bào)道了能合成HA的微生物菌種。由于許多鏈球菌都可以合成以HA多糖為唯一成分的莢膜，使得鏈球菌(特別是對(duì)人體危害較小的C型)成為研究最多的HA生產(chǎn)菌，已報(bào)道的能作為HA生產(chǎn)菌的鏈球菌有溶血性鏈球菌(A型)，獸疫鏈球菌(C型)，馬鏈球菌(C型)，糞馬鏈球菌(C型)，缺乳鏈球菌(C型)以及雞霍亂桿菌(C型)等；其中A型為人體致病菌，C型則只能感染畜類。1983年，首次報(bào)道了日本的資生堂用鏈球菌生產(chǎn)HA(赤坂日出道，駒崎久幸，柳光男，株式會(huì)社資生堂。アルロン酸の制造方法。日本公開(kāi)特許公報(bào)，昭58-56692，1983)，隨后，英美等國(guó)相繼報(bào)道了采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA的方法，大大拓寬了HA的來(lái)源，推動(dòng)了HA的研究和應(yīng)用。微生物發(fā)酵生產(chǎn)HA的實(shí)現(xiàn)是HA生產(chǎn)領(lǐng)域在近年來(lái)取得的最重大的進(jìn)展。
鏈球菌屬于兼性厭氧菌，在有氧、無(wú)氧條件下都可以生長(zhǎng)。HA在鏈球菌內(nèi)的生物合成路線表明，透明質(zhì)酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖在透明質(zhì)酸合成酶作用下通過(guò)β-1-3和β-1-4糖苷鍵連接而成的二糖單體重復(fù)構(gòu)建而形成的直鏈高分子多糖，如圖1所示。在有氧條件下，鏈球菌利用氧分子將NADH氧化為NAD，同時(shí)ADP轉(zhuǎn)化為ATP。ATP的積累有利于UTP的生成，而UTP是合成HA的兩個(gè)前體化合物(UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖)所必須的物質(zhì)，因而從代謝調(diào)控的角度來(lái)說(shuō)，有氧發(fā)酵有利于HA的合成(Goh，L.T.Fermentation studies of hyaluronic acidfermentation by Streptococcus zooepidemicus.In Chemical Engineering；BrisbaneUniversity of Queensland，1998)。但是，細(xì)胞在合成HA的同時(shí)也合成大量的小分子有機(jī)酸，其中大部分是乳酸和乙酸，使得發(fā)酵過(guò)程中pH值以0.01-0.15/min的速度降低。一方面大量的碳源流向乳酸合成，使得碳源向透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)化率很低；另一方面當(dāng)發(fā)酵液pH值低于5.0時(shí)，菌體生長(zhǎng)和代謝很慢或停止，限制了發(fā)酵生產(chǎn)中HA的產(chǎn)率(高海軍，Streptococcus zooepidemicus，生物合成透明質(zhì)酸的過(guò)程優(yōu)化與代謝網(wǎng)絡(luò)分析，無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)，1999)，這也成為了限制透明質(zhì)酸發(fā)酵工業(yè)的一個(gè)重要因素。
通過(guò)對(duì)獸疫鏈球菌代謝網(wǎng)絡(luò)的分析發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中，鏈球菌產(chǎn)生大量乳酸的原因是為了獲得NAD的再生?？刂戚^高溶氧時(shí)，乳酸產(chǎn)量下降，而溶氧降低時(shí)，乳酸產(chǎn)量增加。因?yàn)榧?xì)菌的另一條NAD再生途徑是通過(guò)O2直接氧化NADH，這個(gè)過(guò)程需要NADH氧化酶的作用，在獸疫鏈球菌內(nèi)過(guò)表達(dá)NADH氧化酶能降低乳酸合成(ChongB.F.，Nielsen L.K.Amplifying the cellular reduction potential ofStreptococcus zooepidemicus.J.Biotech.2003，10033-41)，這個(gè)現(xiàn)象證明了當(dāng)細(xì)菌有足夠氧化力的時(shí)候乳酸產(chǎn)量能夠下降。但是由于發(fā)酵液粘度非常高，溶氧很低，而且O2以及一些中間產(chǎn)物過(guò)氧化物都是對(duì)細(xì)胞有毒性的，限制了透明質(zhì)酸產(chǎn)量的提高。
聚羥基丁酸(Polyhydroxyalkanoic acids，PHB)的合成是大多數(shù)細(xì)菌在NADH/NAD水平升高時(shí)有普遍意義的代謝反應(yīng)。在合成PHB時(shí)可以將NADH氧化成NAD，從而完成NAD循環(huán)避免NADH的堆積(Lafferty R.M.，Korsatko B.，Korsatko W.1988，Biotechnology.Vol.6)。Ralstonia.eutropha的PHB合成途徑是目前研究得最清楚的PHB合成途徑。它的PHB合成酶系統(tǒng)由phbCAB基因(見(jiàn)序列表中的序列1)編碼，包含三種酶3-酮基硫解酶(3-ketothiolase)、NDPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶(acetoacyl-CoA reductase)和PHB合成酶(PHB synthase)；上述三種酶分別由phbA、phbB和phbC基因編碼，且位于同一個(gè)操縱子上，如圖2所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法及其專用菌株。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的專用菌株為含有phbCAB基因的重組鏈球菌。
所述鏈球菌為溶血性鏈球菌、獸疫鏈球菌、馬鏈球菌、糞馬鏈球菌、缺乳鏈球菌和雞霍亂桿菌中的任意一種。其中優(yōu)選為A型溶血性鏈球菌、C型獸疫鏈球菌、C型馬鏈球菌、C型糞馬鏈球菌、C型缺乳鏈球菌和C型雞霍亂桿菌中的任意一種。獸疫鏈球菌ATCC 39920是最優(yōu)選的。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，是構(gòu)建含有phbCAB基因的質(zhì)粒表達(dá)載體，將構(gòu)建的載體導(dǎo)入鏈球菌中，獲得重組鏈球菌，發(fā)酵重組鏈球菌得到透明質(zhì)酸。
所構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體優(yōu)選的是將phbCAB基因插入到載體pEU308(EichenbaumZ.，F(xiàn)ederle M.J.1998.Use of the lactococcal nisA promoter to regulate geneexpression in Gram-positive bacteriacomparison of induction level andpromoter strength.Appl.Environ.Microbiol.642763-2769)的多克隆位點(diǎn)獲得的pEUHB。
為提高轉(zhuǎn)化效率，將重組質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入鏈球菌中的方法優(yōu)選為電轉(zhuǎn)化法，但也可以采用其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，例如熱激法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)化法等。
為了提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，在發(fā)酵重組鏈球菌時(shí)還可以加入抗生素或/和IPTG，實(shí)驗(yàn)表明，同時(shí)加入抗生素和IPTG的情況下效果最好。一般情況下抗生素優(yōu)選的是壯觀霉素，所加入的抗生素的濃度一般為80-120mg/l；IPTG的濃度一般為15-25mM?？股氐氖褂每梢云鸬椒€(wěn)定質(zhì)粒的作用，IPTG的作用是誘導(dǎo)基因的表達(dá)。
本發(fā)明通過(guò)在鏈球菌中表達(dá)phbCAB基因，獲得了新的NAD再生途徑，從而避免了NADH堆積，減少了乳酸的生成；同時(shí)NAD是合成透明質(zhì)酸所需的，因而也促進(jìn)了透明質(zhì)酸的合成，搖瓶中透明質(zhì)酸的產(chǎn)量提高29％的同時(shí)乳酸產(chǎn)量降低29％。將本發(fā)明應(yīng)用到透明質(zhì)酸的發(fā)酵工業(yè)中，一方面可以解決乳酸產(chǎn)量過(guò)高，消耗大量碳源，降低發(fā)酵液pH值，抑制菌株生長(zhǎng)的問(wèn)題；另一方面還能夠促進(jìn)透明質(zhì)酸合成，提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


圖1為鏈球菌中心代謝途徑與HA合成的關(guān)系2為編碼PHB的生物合成酶基因操縱子示意3為表達(dá)載體pEUHB的構(gòu)建圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、含有phbCAB基因的載體pEUHB的構(gòu)建菌種大腸桿菌E.coli JM109
構(gòu)建質(zhì)粒所用的培養(yǎng)基為(g/l)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10，壯觀霉素100μg/l。
構(gòu)建pEUHB的過(guò)程如圖3所示，包括以下步驟1)在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以pBHR68質(zhì)粒(supplied by Steinbüchel of Münster University in Germany)為模板，以PphbCAB-upATAAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGGCGACCGGCAAAGGC和PphbCAB-doGTTATCGAT(ClaI)CGGCAGGTCAGCCCATAT為引物得到3884bp的DNA擴(kuò)增片段，其基因序列為基因序列表中的SEQ ID NO1。
PCR反應(yīng)條件96℃45秒，66℃1分鐘，72℃4分30秒，共30個(gè)循環(huán)。
2)將上述包含有phbCAB基因的DNA擴(kuò)增片段，用限制性內(nèi)切酶HindIII，ClaI酶切處理后，插入到質(zhì)粒pEU308的HindIII，ClaI位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pEUHB。
實(shí)施例2、獸疫鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞的制備以及電轉(zhuǎn)化方法菌種獸疫鏈球菌ATCC 39920轉(zhuǎn)化中所用培養(yǎng)基為THYB(g/l)todd-hewitt broth 36.4，酵母浸出物0.5％(w/v)，壯觀霉素100mg/l。
1)感受態(tài)細(xì)胞的制備I) 將獸疫鏈球菌ATCC 39920在THYB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜；II)將其接種到50ml新鮮的THYB培養(yǎng)基中，接種后D530不超過(guò)0.05，培養(yǎng)到OD530約0.25左右即可；III)在培養(yǎng)結(jié)束前半小時(shí)加入透明質(zhì)酸酶0.4mg/ml；IV) 4℃，8000g，離心10分鐘，棄上清，用20mL 0.5M蔗糖溶液重懸細(xì)胞；V) 4℃，8000g，離心10分鐘，棄上清，用1mL 0.5M蔗糖溶液重懸細(xì)胞，再離心，棄上清；VI) 將細(xì)胞重懸在250uL含有10％甘油的0.5M蔗糖溶液中，按使用體積分裝到eppendorf管中；VII)迅速置于-80℃保存。
2) 獸疫鏈球菌的電轉(zhuǎn)化I) 在200uL感受態(tài)細(xì)胞中加入500-5000ng質(zhì)粒pEUHB，冰浴10分鐘；II) 將混合體系轉(zhuǎn)移到2mm電激杯中電激，電壓設(shè)為2.5kv；III)用1mL冰冷的THYB將混合體系轉(zhuǎn)移到10mlTHYB中，冰浴30-60分鐘；IV) 37℃靜置培養(yǎng)1小時(shí)；V) 14℃，6000g，離心10分鐘，菌體用1mlTHYB重懸并涂于抗性平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，得到重組獸疫鏈球菌。
實(shí)施例3、重組菌中PhbB(乙酰乙酰輔酶A還原酶)酶活的檢測(cè)菌種重組獸疫鏈球菌外源基因phbCAB所用培養(yǎng)基為THYB(g/l)todd-hewitt broth 36.4，酵母浸出物0.5％(w/v)，壯觀霉素100mg/l，IPTG 20mM。
1)酶活測(cè)定方法反應(yīng)總體積500ul，包括12.5ul 10mmol/l NADPH，12.5ul7mmol/l乙酰輔酶A和425ul的緩沖液(120mmol/l磷酸鉀，24mmol/l氯化鎂，1mmol/l二硫蘇糖醇)，先30℃預(yù)熱1分鐘，然后加入50ul酶粗提液，立即檢測(cè)340nm的吸光度值變化。一個(gè)PhbB酶活單位(U)定義為1分鐘降解1umol NADPH。酶粗提液的制備如下細(xì)胞在加入IPTG的條件下37℃培養(yǎng)14小時(shí)，離心棄去上清，用0.1mol/l Tris-HCl(pH7.5)重懸菌體，再離心棄上清，菌體用10％體積的0.1mol/l Tris-HCl(pH7.5)重懸；超聲破碎細(xì)胞，離心，上清作為酶粗提液。蛋白測(cè)定按傳統(tǒng)的Bradford方法進(jìn)行。
2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在有IPTG誘導(dǎo)情況下，重組獸疫鏈球菌中PhbB的酶活為每毫克總蛋白0.45U，而原始菌中沒(méi)有檢測(cè)到PhbB酶活，phbB在重組菌中得到表達(dá)并具有一定活性。
實(shí)施例4、重組獸疫鏈球菌的搖瓶發(fā)酵以及HA，乳酸，乙酸的檢測(cè)菌種重組獸疫鏈球菌外源基因phbCAB將實(shí)驗(yàn)菌分為原始菌和重組菌，再將重組菌分為四組(一組只加入IPTG，一組只加入壯觀霉素，一組同時(shí)加入IPTG和壯觀霉素，一組兩者都不加)。
培養(yǎng)基成分1)種子培養(yǎng)基蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏10g/l，MgSO4·7H2O2g/l，MnSO4·4H2O0.1g/l，KH2PO42g/l，微量元素液1ml/l，緩沖液40ml/l；其中微量元素液含CaCl22g/l，MnSO4·4H2O24mg/l，ZnCl246mg/l，CuSO4·5H2O19mg/l；緩沖液含Na2HPO4·12H2O36.76g/l，NaH2PO4·12H2O15.98g/l，NaHCO312.5g/l。
2)發(fā)酵培養(yǎng)基酵母粉20g/l，Na2HPO4·12H2O6.2g/l，MgSO4·7H2O2g/l，K2SO41.3g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O5mg/l，微量元素液2.5ml/l蔗糖40g/l；壯觀霉素100mg/l，IPTG20mM1)搖瓶發(fā)酵方法用接種環(huán)挑取平板上的菌種接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于200rpm的搖床上培養(yǎng)14-16小時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)為37℃；然后按10％的接種量將種子培養(yǎng)液接入盛有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中培養(yǎng)14小時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)為37℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。需要用IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒的spac啟動(dòng)子表達(dá)的時(shí)候，先加入IPTG再進(jìn)行搖培。
2)測(cè)定方法透明質(zhì)酸含量測(cè)定采用bitter-muir氏法(Bitter T.，Muri H.M.A modifieduronic acid carbazol reaction.Anal.Biochem.1962，4330-334)，將5ml0.025M十水合四硼酸鈉的濃硫酸溶液加入具塞試管，冷卻到-20℃；小心加入0.5ml的樣品或標(biāo)準(zhǔn)樣，試管用磨砂玻璃塞密封，搖動(dòng)試管。在劇烈沸騰的沸水浴中加熱10分鐘，然后冷卻到室溫，加入0.2ml咔唑試劑(0.125％咔唑溶于無(wú)水乙醇中)，再次搖動(dòng)試管，在沸水浴中再加熱15分鐘，冷卻到室溫，在530nm下，用1cm比色皿測(cè)量光密度值，OD530值對(duì)硫酸空白的應(yīng)小于0.025。其中標(biāo)準(zhǔn)樣為葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液4-40ug/ml，用儲(chǔ)備的苯甲酸飽和去離子水制備，4℃下能夠穩(wěn)定存放6個(gè)月。發(fā)酵液的測(cè)量樣品制備方法如下a)取1ml發(fā)酵液準(zhǔn)確稀釋到4ml，6000轉(zhuǎn)離心10分鐘；b)取1ml上清加入到4ml無(wú)水乙醇中，振蕩，6000轉(zhuǎn)離心5分鐘；c)棄去上清，加入2ml0.2MNaCl，放置，間或振蕩，直至最終溶解；d)加入4ml無(wú)水乙醇，振蕩，6000轉(zhuǎn)離心5分鐘；e)棄去上清，沉淀用2ml去離子水溶解作為HA測(cè)定的樣品。
蔗糖、乳酸鹽及乙酸鹽濃度的測(cè)定采用HPLC(SpectroSYSTEM P2000，Thermoseparation products，USA)法。折光檢測(cè)器，離子交換柱Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm，流動(dòng)相為0.005M硫酸溶液，流速0.50ml/min。檢測(cè)前，取0.2ml發(fā)酵樣品，準(zhǔn)確稀釋到4ml，10000rpm/min離心5分鐘，去上清，0.45um濾膜過(guò)濾后作為色譜的樣品。
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可以看出，重組菌的透明質(zhì)酸產(chǎn)量普遍高于原始菌，而且在有IPTG誘導(dǎo)phbCAB基因表達(dá)的情況下，乳酸產(chǎn)量下降了大約29％。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示在只有抗生素加入的時(shí)候HA的產(chǎn)量最高。
序列表<160>1<210>1<211>3884<212>DNA<213>Ralstonia.eutropha<400>1ataaagctta aggaggatgg cgaccggcaa aggcgcggca gcttccacgc aggaaggcaa60gtcccaacca ttcaaggtca cgccggggcc attcgatcca gccacatggc tggaatggtc120ccgccagtgg cagggcactg aaggcaacgg ccacgcggcc gcgtccggca ttccgggcct180ggatgcgctg gcaggcgtca agatcgcgcc ggcgcagctg ggtgatatcc agcagcgcta240catgaaggac ttctcagcgc tgtggcaggc catggccgag ggcaaggccg aggccaccgg300tccgctgcac gaccggcgct tcgccggcga cgcatggcgc accaacctcc catatcgctt360cgctgccgcg ttctacctgc tcaatgcgcg cgccttgacc gagctggccg atgccgtcga420ggccgatgcc aagacccgcc agcgcatccg cttcgcgatc tcgcaatggg tcgatgcgat480gtcgcccgcc aacttccttg ccaccaatcc cgaggcgcag cgcctgctga tcgagtcggg540cggcgaatcg ctgcgtgccg gcgtgcgcaa catgatggaa gacctgacac gcggcaagat600ctcgcagacc gacgagagcg cgtttgaggt cggccgcaat gtcgcggtga ccgaaggcgc660cgtggtcttc gagaacgagt acttccagct gttgcagtac aagccgctga ccgacaaggt720gcacgcgcgc ccgctgctga tggtgccgcc gtgcatcaac aagtactaca tcctggacct780gcagccggag agctcgctgg tgcgccatgt ggtggagcag ggacatacgg tgtttctggt840gtcgtggcgc aatccggacg ccagcatggc cggcagcacc tgggacgact acatcgagca900cgcggccatc cgcgccatcg aagtcgcgcg cgacatcagc ggccaggaca agatcaacgt960gctcggcttc tgcgtgggcg gcaccattgt ctcgaccgcg ctggcggtgc tggccgcgcg1020cggcgagcac ccggccgcca gcgtcacgct gctgaccacg ctgctggact ttgccgacac1080gggcatcctc gacgtctttg tcgacgaggg ccatgtgcag ttgcgcgagg ccacgctggg1140cggcggcgcc ggcgcgccgt gcgcgctgct gcgcggcctt gagctggcca ataccttctc1200gttcttgcgc ccgaacgacc tggtgtggaa ctacgtggtc gacaactacc tgaagggcaa1260
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1.含有phbCAB基因的重組鏈球菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組鏈球菌，其特征在于所述鏈球菌為溶血性鏈球菌、獸疫鏈球菌、馬鏈球菌、糞馬鏈球菌、缺乳鏈球菌和雞霍亂桿菌中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組鏈球菌，其特征在于所述鏈球菌為A型溶血性鏈球菌、C型獸疫鏈球菌、C型馬鏈球菌、C型糞馬鏈球菌、C型缺乳鏈球菌和C型雞霍亂桿菌中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組鏈球菌，其特征在于所述鏈球菌為獸疫鏈球菌ATCC 39920。
5.一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，是構(gòu)建含有phbCAB基因的質(zhì)粒表達(dá)載體，將構(gòu)建的載體導(dǎo)入鏈球菌中，獲得重組鏈球菌，發(fā)酵重組鏈球菌得到透明質(zhì)酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體為將phbCAB基因插入到載體pEU308的多克隆位點(diǎn)獲得的pEUHB。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述，其特征在于所述將重組質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入鏈球菌中的方法為電轉(zhuǎn)化法。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述，其特征在于所述發(fā)酵重組鏈球菌時(shí)加入抗生素或/和IPTG。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述，其特征在于所述抗生素為壯觀霉素。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述，其特征在于所述加入的抗生素的濃度為80-120mg/l；IPTG的濃度為15-25mM。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法。本發(fā)明所提供的提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法是構(gòu)建一個(gè)含有phbCAB基因序列的質(zhì)粒表達(dá)載體，再導(dǎo)入鏈球菌中進(jìn)行表達(dá)。所構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體為pEUHB，是將phbCAB基因序列插入到質(zhì)粒載體pEU308的多克隆位點(diǎn)獲得的。所述鏈球菌優(yōu)選為獸疫鏈球菌。將本發(fā)明應(yīng)用到透明質(zhì)酸的發(fā)酵工業(yè)中，一方面可以解決乳酸產(chǎn)量過(guò)高，消耗大量碳源，降低發(fā)酵液pH值，抑制菌株生長(zhǎng)的問(wèn)題；另一方面還能夠促進(jìn)透明質(zhì)酸合成，提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1587386SQ20041007076
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月26日
發(fā)明者陳國(guó)強(qiáng), 張晉宇 申請(qǐng)人:清華大學(xué)