專利名稱：線粒體糖尿病熒光診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及線粒體糖尿病診斷設(shè)備，特別涉及一種線粒體糖尿病熒光診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
1992年Van den Ouweland等首次報(bào)道了由線粒體tRNAleu(UUR)3243A→G突變引起的一個(gè)母系遺傳糖尿病伴神經(jīng)性耳聾家系，各國學(xué)者先后在不同的種族也發(fā)現(xiàn)該突變導(dǎo)致的線粒體糖尿病(mitochondrial diabetes mellitus，MDM)，它是目前已知的單基因突變致糖尿病中發(fā)病率最高的一種。1997年美國糖尿病協(xié)會(huì)(American diabetes association，ADA)和1998年世界衛(wèi)生組織(world healthorganization，WHO)在糖尿病新的分型中，正式將線粒體糖尿病列為特殊類型糖尿病。由于線粒體DNA的結(jié)構(gòu)和遺傳特性，決定了線粒體糖尿病臨床表現(xiàn)存在閾值效應(yīng)，即當(dāng)突變的mtDNA達(dá)到一定量，線粒體產(chǎn)生的ATP不能維持胰島β細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損，胰島素分泌不足。所以mtDNA突變的拷貝數(shù)對(duì)臨床診斷有重要意義，而目前用于線粒體tRNALeu(UUR)3243 A→G突變檢測(cè)的方法均無法對(duì)組織或細(xì)胞突變的mtDNA拷貝數(shù)做定量分析。
傳統(tǒng)的線粒體糖尿病檢測(cè)方法①取外周血0.2ml，QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN公司)提取全基因組DNA。②PCR反應(yīng)正向引物為5’-AAGGTTCGTTTGTTCAACGA-3’，反向引物為5’-AGCGAAGGGTTGTAGTAGCC-3’；反應(yīng)體系10×Buffer 5ul、25mM Mgcl23ul、2mM dNTP 1ul、20pmol/l Prime10.8ul、20pmol/l Prime20.8ul、5U/l Taq聚合酶3ul、DNA 6ul加去離子三蒸水至50ul；PCR擴(kuò)增條件為94℃變性5分鐘，94℃30秒、61℃30秒、72℃30秒，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物片斷長(zhǎng)度為427堿基對(duì)(bp)。③PCR產(chǎn)物經(jīng)Apa I酶切(按各產(chǎn)家說明書提供反應(yīng)條件和反應(yīng)體系操作)。④酶切產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，10mg/ml溴化乙啶(EB)染色。紫外燈下觀察，無突變者僅見一427bp條帶，突變患者可見兩條帶(一條為427bp條帶，被酶切開的214bp與213bp重疊為另一條帶)。
傳統(tǒng)基因?qū)W的診斷方法存在的不足之處(1)只能定性，不能定量；普通PCR經(jīng)過30多個(gè)循環(huán)基本達(dá)到平臺(tái)期，PCR產(chǎn)物的量不能反映起始DNA的模板數(shù)(2)所需的實(shí)驗(yàn)步驟多，易造成實(shí)驗(yàn)誤差；(3)溴化乙錠對(duì)人體有害并對(duì)環(huán)境有污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種線粒體糖尿病熒光診斷試劑盒，它可對(duì)組織或細(xì)胞突變的mtDNA拷貝數(shù)做定量分析。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的該線粒體糖尿病熒光診斷試劑盒包括①內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品為含GAPDH基因片斷的質(zhì)粒，拷貝數(shù)分別為106/ul、105/ul、104/ul、103/ul、102/ul基因片斷為tctgctcctcctgttcgacagtcagccgcatcttcttttgcgtcgccagccgagccacatcgctcagacaccatgggggaaggtgaaggtcggagtcaacggatttggtcgtattgggcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatgaccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaaattccatggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcaccatcttccaggagcgagatccctccaaaatcaa
gtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccatggagaaggctggggctcatttgcaggggggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaaggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacgaccactttgtcaagctcatttcctggtatgacaacgaatttggctacagcaacagggtggtggacctcatggcccacatggcctccaaggagtaagacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagtcccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagtaccctgtgctc目的基因標(biāo)準(zhǔn)品為含目的基因片斷的質(zhì)粒，拷貝數(shù)分別為106/ul、105/ul、104/ul、103/ul、102/ul基因片斷為aaggttcgtttgttcaacgattaaagtcctacgtgatctgagttcagaccggagtaatccaggtcggtttctatctacttcaaattcctccctgtacgaaaggacaagagaaataaggcctacttcacaaagcgccttcccccgtaaatgatatcatctcaacttagtattatacccacacccacccaagaacagggtttgttaagatggcagggcccggtaatcgcataaaacttaaaactttacagtcagaggttcaattcctcttcttaacaacatacccatggccaacctcctactcctcattgcacccattctaatcgcaatggcattcctaatgcttaccgaacgaaaaattctaggctatatacaactacgcaaaggccccaacgttgtaggcccctacgggctactacaacccttcgct②目的基因正向引物5’-CCCACCCAAGAACAGGGTT-3’，
目的基因反向引物5’-GGAATTGAACC TCTGACTGTAAAGTTT-3’，含突變的目的片斷小溝結(jié)合物(Minor Groove Binder，MGB)探針5’FAM-TACCGGGCCCTGCCA-MGB3’，③內(nèi)參正向引物5’-CCATCAATGACCCCTTCATTG-3’，內(nèi)參反向引物5’-CATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’，內(nèi)參MGB探針FAM-CCTCAACTACATGGTTTAC-MGB。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明可對(duì)組織或細(xì)胞突變的mtDNA拷貝數(shù)做定量分析。


圖1為熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)的工作原理示意圖。
圖2為一反應(yīng)管熒光曲線，橫坐標(biāo)為Ct值，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
圖3為已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的診斷試劑盒包括①內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品為含GAPDH基因片斷的質(zhì)粒，拷貝數(shù)分別為106/ul、105/ul、104/ul、103/ul、102/ul，基因片斷為tctgctcctcctgttcgacagtcagccgcatcttcttttgcgtcgccagccgagccacatcgctcagacaccatgggggaaggtgaaggtcggagtcaacggatttggtcgtattgggcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatgaccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaaattccatggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatc
accatcttccaggagcgagatccctccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccatggagaaggctggggctcatttgcaggggggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaaggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacgaccactttgtcaagctcatttcctggtatgacaacgaatttggctacagcaacagggtggtggacctcatggcccacatggcctccaaggagtaagacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagtcccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagtaccctgtgctc目的基因標(biāo)準(zhǔn)品為含目的基因片斷的質(zhì)粒，拷貝數(shù)分別為106/ul、105/ul、104/ul、103/ul、102/ul，基因片斷為aaggttcgtttgttcaacgattaaagtcctacgtgatctgagttcagaccggagtaatccaggtcggtttctatctacttcaaattcctccctgtacgaaaggacaagagaaataaggcctacttcacaaagcgccttcccccgtaaatgatatcatctcaacttagtattatacccacacccacccaagaacagggtttgttaagatggcagggcccggtaatcgcataaaacttaaaactttacagtcagaggttcaattcctcttcttaacaacatacccatggccaacctcctactcctcattgcacccattctaatcgcaatggcattcctaatgcttaccgaacgaaaaattctaggctatatacaactacgcaaaggccccaacgttgtaggcccctacgggctactacaacccttcgct
②目的基因正向引物5’-CCCACCCAAGAACAGGGTT-3’，目的基因反向引物5’-GGAATTGAACC TCTGACTGTAAAGTTT-3’，含突變的目的片斷小溝結(jié)合物(Minor Groove Binder，MGB)探針5’FAM-TACCGGGCCCTGCCA-MGB3’，③內(nèi)參正向引物5’-CCATCAATGACCCCTTCATTG-3’，內(nèi)參反向引物5’-CATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’，內(nèi)參MGB探針FAM-CCTCAACTACATGGTTTAC-MGB。
本發(fā)明的試劑盒原理為熒光定量PCR(FQ-PCR)是一種新的核酸定量技術(shù)，如圖1所示，原理是在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針，該探針是一5’端帶有熒光發(fā)射基團(tuán)、3’端帶有熒光淬滅基團(tuán)的寡核酐酸，可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交。當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)抑制了發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射，在延伸期Taq聚合酶隨引物延伸沿DNA模板移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到探針結(jié)合的位置時(shí)發(fā)揮5’→3’外切酶活性將探針切斷，淬滅基團(tuán)和發(fā)光基團(tuán)分離，熒光信號(hào)釋放出來。這樣模板每復(fù)制一次就有一個(gè)探針被釋放出來，被釋放出來的熒光數(shù)和PCR產(chǎn)物數(shù)量是等量的，因此通過檢測(cè)熒光的量(如圖2所示)可以對(duì)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系(如圖3所示)，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此只要獲得未知樣品的Ct值，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
本發(fā)明的試劑盒使用方法1)取外周血0.2ml，QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN公司)提取全基因組DNA。
2)反應(yīng)體系①目的基因標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系金牌熱啟動(dòng)TaqMan聚合酶混合液(TaqMan2X Universal Master Mix，美國ABI公司)25ul，20pmol/l目的基因引物p1、p2各1ul，20pmol/l含突變的目的片斷MGB探針1ul，已知拷貝數(shù)的目的基因標(biāo)準(zhǔn)品2.5ul，加去離子三蒸水至50ul。②樣品反應(yīng)體系金牌熱啟動(dòng)TaqMan聚合酶混合液25ul，20pmol/l目的基因引物p1、p2各1ul，20pmol/l含突變的目的片斷MGB探針1ul，樣品DNA 2.5ul，加去離子三蒸水至50ul。③內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品金牌熱啟動(dòng)TaqMan聚合酶混合液25ul，20pmol/l內(nèi)參照引物p1、p2各1ul，20pmol/l內(nèi)參照MGB探針1ul，內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品2.5ul，加去離子三蒸水至50ul。④樣品內(nèi)參金牌熱啟動(dòng)TaqMan聚合酶混合液25ul，20pmol/l內(nèi)參照引物p1、p2各1ul，20pmol/l內(nèi)參照MGB探針1ul，樣品DNA 2.5ul，加去離子三蒸水至50ul。
4)每個(gè)檢測(cè)者做一管目的基因，一管內(nèi)參。每次上樣均做一含突變的目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，一個(gè)內(nèi)參照的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線由相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為106、105、104、103、102)的Ct值連線所得。
5)熒光定量PCR反應(yīng)條件50℃2分鐘；94℃ 10分鐘；94℃ 20秒、59℃1分鐘40個(gè)循環(huán)。
6)熒光定量PCR機(jī)為PE公司的PE7000全自動(dòng)分析儀，用ABI Prism 7000SDS Software軟件分析結(jié)果。
7)在報(bào)告中可讀出每個(gè)樣品突變的拷貝數(shù)，用內(nèi)參拷貝數(shù)矯正起始DNA的濃度。
本發(fā)明的試劑盒所使用的TaqMan MGB探針同常規(guī)熒光探針相比還具有如下優(yōu)點(diǎn)一是熒光本底低。TaqMan MGB探針3’端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的Tamra熒光標(biāo)記，這使熒光本底降低。二是分辨率更高。淬滅熒光分子與報(bào)道基團(tuán)在空間位置上更接近，使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更精確，分辨率更高。三是雜交特異性增強(qiáng)。由于探針3’端另結(jié)合了小溝結(jié)合物(minorgroove binder，MGB)，使得探針的Tm值提高，大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性，提高了配對(duì)與非配對(duì)模板間的Tm值差異，使非特異性雜交顯著降低。四是探針長(zhǎng)度縮短。TaqMan MGB探針長(zhǎng)度一般在13-18個(gè)堿基范圍之內(nèi)，其長(zhǎng)度的縮短有利于高AT含量DNA序列的探針的設(shè)計(jì)。
特點(diǎn)(1)能夠精確定量。(2)特異性識(shí)別強(qiáng)。熒光信號(hào)的產(chǎn)生不僅強(qiáng)烈依賴于靶模板同探針的雜交，而且同時(shí)強(qiáng)烈依賴于靶模板的擴(kuò)增，二者缺一不可。(3)整個(gè)過程單管封閉操作，自動(dòng)化程度高，無需PCR后處理，并有效解決了PCR污染問題。(4)利用雙熒光技術(shù)，單反應(yīng)管中同步測(cè)定突變mtDNA的拷貝數(shù)及正常mtDNA的拷貝數(shù)。
檢測(cè)結(jié)果選取已確診的線粒體糖尿病患者5例，正常人2例。
線粒體tRNAleu(UUR)3243突變糖尿病患者的檢測(cè)結(jié)果

注1-5為線粒體糖尿病人，6、7為正常對(duì)照，8為陰性(三蒸水)對(duì)照。
由于已收集到線粒體糖尿病病人有限，僅做五例，可以直接得到突變的拷貝數(shù)，這5名患者經(jīng)過反復(fù)PCR-RFLP法檢測(cè)均為突變陽性患者，但反復(fù)直接測(cè)序僅1、5患者為陽性，可見直接測(cè)序法對(duì)該突變的檢測(cè)靈敏度不高；正常人不能檢查出該突變，僅可檢測(cè)出內(nèi)參照的濃度；陰性對(duì)照中不能檢測(cè)到突變及內(nèi)參照拷貝數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種線粒體糖尿病熒光診斷試劑盒，其包括①內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品為含GAPDH基因片斷的質(zhì)粒，拷貝數(shù)分別為106/ul、105/ul、104/ul、103/ul、102/ul，基因片斷為tctgctcctcctgttcgacagtcagccgcatcttcttttgcgtcgccagccgagccacatcgctcagacaccatgggggaaggtgaaggtcggagtcaacggatttggtcgtattgggcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatgaccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaaattccatggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcaccatcttccaggagcgagatccctccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccatggagaaggctggggctcatttgcaggggggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaaggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccctccgggaaactgtggcgtgatggccgcggggctctccagaacatcatccctgcctctactggcgctgccaaggctgtgggcaaggtcatccctgagctgaacgggaagctcactggcatggccttccgtgtccccactgccaacgtgtcagtggtggacctgacctgccgtctagaaaaacctgccaaatatgatgacatcaagaaggtggtgaagcaggcgtcggagggccccctcaagggcatcctgggctacactgagcaccaggtggtctcctctgacttcaacagcgacacccactcctccacctttgacgctggggctggcattgccctcaacgaccactttgtcaagctcatttcctggtatgacaacgaattggctacagcaacagggtggtggacctcatggcccacatggcctccaaggagtaagacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagtcccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagtaccctgtgctc目的基因標(biāo)準(zhǔn)品為含目的基因片斷的質(zhì)粒，拷貝數(shù)分別為106/ul、105/ul、104/ul、103/ul、102/ul，基因片斷為aaggttcgtttgttcaacgattaaagtcctacgtgatctgagttcagaccggagtaatccaggtcggtttctatctacttcaaattcctccctgtacgaaaggacaagagaaataaggcctacttcacaaagcgccttcccccgtaaatgatatcatctcaacttagtattatacccacacccacccaagaacagggtttgttaagatggcagggcccggtaatcgcataaaacttaaaactttacagtcagaggttcaattcctcttcttaacaacatacccatggccaacctcctactcctcattgcacccattctaatcgcaatggcattcctaatgcttaccgaacgaaaaattctaggctatatacaactacgcaaaggccccaacgttgtaggcccctacgggctactacaacccttcgct②目的基因正向引物5’-CCCACCCAAGAACAGGGTT-3’，目的基因反向引物5’-GGAATTGAACC TCTGACTGTAAAGTTT-3’，含突變的目的片斷MGB探針5’FAM-TACCGGGCCCTGCCA-MGB3’，③內(nèi)參正向引物5’-CCATCAATGACCCCTTCATTG-3’，內(nèi)參反向引物5’-CATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’，內(nèi)參MGB探針FAM-CCTCAACTACATGGTTTAC-MGB。
全文摘要
本發(fā)明屬于糖尿病診斷設(shè)備領(lǐng)域。公開了一種線粒體糖尿病熒光診斷試劑盒，其包括①內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品為含GAPDH基因片斷的質(zhì)粒，拷貝數(shù)分別為10
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1661093SQ20041007739
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者翁建平, 修玲玲, 廖瑛, 朱慧麗, 衛(wèi)國紅 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院