專利名稱：植物毛狀體特異表達的基因啟動子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學和植物基因工程領域，具體地講，涉及一個基因啟動子。
背景技術：
植物基因的表達與其它真核生物一樣是在DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平及翻譯后水平等多個層次上進行調(diào)控的。從效果上來看，轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟和有效的，因此轉(zhuǎn)錄調(diào)控是控制植物基因表達的最重要的方式。基因轉(zhuǎn)錄為mRNA受到基因某個區(qū)域的調(diào)控，這個位于轉(zhuǎn)錄起始位點之前的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的區(qū)域通常被稱為啟動子?？拷D(zhuǎn)錄起始位點近端區(qū)域構成“核心啟動子區(qū)”(core promoter region)；其中通常含有TATA盒和CAAT盒序列，以及轉(zhuǎn)錄起始位點。核心啟動子區(qū)通常與各種轉(zhuǎn)錄因子以及一些輔助蛋白結合，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物。位于核心啟動子區(qū)上游的是基因表達調(diào)控序列，包含許多不同的調(diào)節(jié)元件，決定著基因表達的水平，表達的時間與空間方式，以及基因的誘導表達方式。使用重組DNA方法進行啟動子的修飾可獲得選擇性的基因表達模式。
根據(jù)以前的研究，驅(qū)動基因在植物毛狀體中表達的啟動子有棉花脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(cotton lipid transfer protein)基因LPT3、LPT6啟動子(Liu et al.，BBA 1487106-111，2000；Hsu et al.，Plant Sci 14363-70，1999)，煙草P450基因CYP71D16啟動子(Wang et al.，J Exp Bot 531891-1897，2002)和棉花纖維基因RDL1啟動子(Wang et al.，Plant Cell162323-2334，2004)。這些啟動子都能驅(qū)使GUS報告基因在毛狀體中特異表達，但是這些啟動子的核苷酸序列的相似性不大。不過這些啟動子序列中都含有MYB識別元件，Wang等(2002)推測這些MYB識別元件與毛狀體特異性表達有關，后來Wang等(2004)的研究表明L1框與MYB識別元件共同參與擬南芥毛狀體中RDL1啟動子的激活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新克隆的蛋白酶抑制劑基因SaPIN2b啟動子，用于驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的毛狀體中特異表達。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有上述啟動子序列與所需的目的基因的編碼區(qū)核苷酸序列連接后產(chǎn)生的基因的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種由上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組微生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述重組微生物在轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
本發(fā)明從龍葵中分離克隆出一種蛋白酶抑制劑基因(SaPIN2b)啟動子并對它進行序列分析，然后克隆到雙元載體pBI101.1中并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌A.tumefaciens LBA4404，接著用農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草與龍葵。對獲得的轉(zhuǎn)基因植株T0和T1代進行組織化學染色分析表明，-1430至-9共1422bp長的啟動子區(qū)域可驅(qū)使GUS報告基因在毛狀體中特異表達。
蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor)廣泛存在于自然界各種生物體尤其是植物中，在大多數(shù)植物的種子和塊莖中，其含量可高達總蛋白的1％～10％。大量研究表明，蛋白酶抑制劑在植物防御昆蟲和病原體侵染的天然防御系統(tǒng)中起著重要作用。因此，蛋白酶抑制劑廣泛應用于植物抗蟲基因工程中，如馬鈴薯PIN2。對馬鈴薯PIN2基因啟動子的研究集中于機械致傷與化學分子誘導表達方面。龍葵蛋白酶抑制劑IIb(SaPIN2b)，屬馬鈴薯PIN2一類，其啟動子在受到致傷與化學分子誘導后，可明顯增加所驅(qū)使的外源基因在葉中的表達。而在未受外界刺激時，SaPIN2b基因啟動子可驅(qū)使外源基因在毛狀體中特異表達。
本發(fā)明所提供的DNA序列，如SEQ ID NO1所示，代表的是龍葵SaPIN2b基因啟動子序列。其序列從-1430至-9共1422bp，具有指導基因在植物毛狀體中表達的能力。+30到+32為翻譯起始密碼子，-38到-32為推測的TATA框，假定的CAAT框位于-116到-113或者-51到-48的區(qū)段上。除此之外，該啟動子還包含6個MYB識別元件和1個L1框，據(jù)Wang等(2004)的研究，推測很可能L1框(TAAATGTA，-103～-96)和位于-17到-12區(qū)段的MYB識別元件(TAACCA)使得該啟動子具有驅(qū)使外源基因在毛狀體表達的特性。
本發(fā)明所闡述的來自于SaPIN2b啟動子區(qū)的序列可作為一個啟動子元件插在DNA雙元載體中而用于所有能夠使用該啟動子的植物(即該植物的RNA聚合酶能與本文公開的啟動子序列結合)的轉(zhuǎn)化來表達目的基因。在DNA構建體中，與該啟動子連接的可以是任何目的基因序列；目的基因的DNA序列可以來自同源植物、外源植物、真菌、藻類、細菌、病毒或動物基因，也可以是人工設計、合成的DNA序列。這些序列可以是一段編碼有功能的蛋白質(zhì)或其一部分的正義序列或一段反義序列?？梢岳枚喾N轉(zhuǎn)化手段將本發(fā)明所涉及的植物表達載體轉(zhuǎn)入植物中，任何適合于植物或植物細胞的轉(zhuǎn)化方法都可以使用。如使用農(nóng)桿菌介導侵染法，電擊法，基因槍轟擊法，花粉管導入法，細胞和原生質(zhì)體顯微注射法等。被轉(zhuǎn)化后的細胞在合適的條件下就可再生成完整的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明中使用GUS基因作為報告基因。GUS基因編碼β-葡萄糖苷酸酶，可以在體外催化裂解人工合成的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸)底物，產(chǎn)生深藍色化合物沉淀于植物組織。
作為植物的第一道防線，毛狀體通常通過空間阻隔、物理誘捕或分泌有毒化學物質(zhì)來抵抗害蟲攻擊，因而在可持續(xù)蟲害防治策略的發(fā)展中，以毛狀體為基礎的防御起著重要作用；腺體毛狀體經(jīng)常分泌多種有重要經(jīng)濟價值的產(chǎn)物，如化裝品、芳香物質(zhì)和樹脂等等，所以，毛狀體特異性表達的、并且在腺細胞中有高活力的啟動子在生物工程中有著重要的經(jīng)濟利用價值。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以毛狀體特異性啟動子來驅(qū)使外源基因表達的生物工程策略有如下幾個優(yōu)點1、對于植物來說，毛狀體并非必需，它會將表達產(chǎn)物分泌出來存積在葉表面，這就避免了有毒物質(zhì)或者是生長抑制劑在植物體內(nèi)的聚積；2、毛狀體特異性啟動子把外源基因的表達局限在毛狀體中，這就有效的避免了外源蛋白在谷物、果實等供人食用的器官中的積累；3、毛狀體中特異表達和表達產(chǎn)物被分泌到葉表面存積，大大減少了產(chǎn)物存貯上的物理空間限制，從而有利于產(chǎn)物的高水平表達；4、因為產(chǎn)物被分泌到葉表存積，這就使得產(chǎn)物的回收純化變得相對簡單易行。


圖1為雙元載體pPBBS的構建流程圖；圖2為SaPIN2b基因啟動子驅(qū)動的GUS報告基因在轉(zhuǎn)基因煙草中(T0)的組織特異性表達分析；其中，圖2中，A為葉表毛狀體；B為葉柄毛狀體；C為莖毛狀體；D為花萼毛狀體；E為花瓣毛狀體；F為花芽上的毛狀體；A-C取自生長在溫室中苗期(30cm高)的轉(zhuǎn)基因煙草；D-F取自生長在溫室中開花期的轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實施例方式
實施例1采用接頭連接PCR(Adaptor-ligation PCR)法進行基因組DNA步移，從龍葵基因組DNA中擴增并克隆出SaPIN2b基因啟動子序列?；蚪M步移所用試劑盒為Clontech公司的GenomeWalkerTMKit。具體步驟如下1.龍葵基因組DNA的提取取5克龍葵葉于液氮中研磨成粉后轉(zhuǎn)移到30ml離心管中，加入15ml提取緩沖液[100mM Tris(pH8.0)，50mM EDTA(pH8.0)，500mM NaCl，10mM β-巰基乙醇]，混勻。接著向管中加入1ml 20％的SDS，充分混勻，于65℃溫育10分鐘。然后加入5ml 5M的乙酸鉀，充分混勻后置于冰上20分鐘。25000×g離心20分鐘，取上清至另一干凈離心管中，加入10ml的異丙醇，混勻后于-20℃靜置30分鐘。20000×g離心15分鐘，去上清，DNA沉淀自然風干后溶于750μl TE[50mM Tris(pH 8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]。將上述DNA溶液轉(zhuǎn)移到一Eppendorf管中，分別用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提一次。上清DNA溶液轉(zhuǎn)移到另一Eppendorf管，再加入500μl異丙醇和75μl的NaAc(pH5.2)，混勻，于12000×g離心5分鐘，沉淀用80％的乙醇洗滌，風干后溶于500μl TE(pH8.0)中。
2.基因組DNA的酶切消化和接頭連接，構建“基因組文庫”將提取的龍葵基因組DNA用產(chǎn)生平末端的限制性內(nèi)切酶(DraI，EcoRV，StuI，PvuII)進行酶切。100μl酶切反應體系中加入8U(U為酶活力單位)的限制性內(nèi)切酶，于37℃恒溫過夜，然后用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次。將上清DNA溶液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，向管中加入2倍體積的冰冷無水乙醇，1/10體積的3M乙酸鈉(pH5.2)和20μg的糖原，混勻。12000×g離心10分鐘，沉淀所得DNA用80％的乙醇洗滌，風干后溶于20μl TE(pH7.5)。各自酶切后的基因組DNA分別與基因組步移接頭進行連接，10μl反應體系中包含4μl純化的酶切基因組DNA，1.9μl基因組步移接頭(25μM)(接頭長鏈5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’；接頭短鏈5’-PO4-ACCAGCCC-NH2-3’)，1.6μl 10×連接緩沖液，0.5μl T4DNA連接酶(6U/μl)。混合液于16℃過夜反應后，于70℃保溫5分鐘以終止反應，得到“基因組文庫”。
3.基因組DNA步移和擴增用上述構建好的“基因組文庫”，進行PCR擴增，共兩輪PCR。根據(jù)已測定的SaPIN2b cDNA(GenBank登錄號為AF209709)序列，設計、合成基因特異引物2bGSP1和2bGSP2。
2bGSP15’-GGAGCCAAGTCCTCATGGATGATC-3’(24bp)2bGSP25’-GCAAGTATTTGGGTTTTTAGGGTCAGAACT-3’(30bp)。首輪PCR。50μl反應體系中包含5μl 10×PCR反應緩沖液(10mM)，2μl dNTP(10mM)，2.2μl MgAc2(25mM)，1μl接頭引物1(AP1，10mM)(AP15’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)，1μl基因特異引物2bGSP1(10mM)(序列如上所示)，1μl Advantage GenomicPolymerase Mix，1μl DNA模板，36.8μl去離子水。PCR反應參數(shù)為(1)94℃25秒，72℃3分鐘，7個循環(huán)；(2)94℃25秒，67℃3分鐘，32個循環(huán)；(3)67℃保溫7分鐘。將首輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，用于第二輪PCR。
第二輪PCR。50μl反應體系中包含5μl 10×PCR反應緩沖液，2μl dNTP(各10mM)，2.2μl MgAc2(25mM)，1μl接頭引物2(AP2，10mM)(AP25’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’)，1μl基因特異引物2bGSP2(10mM)(序列如上所示)，1μl Advantage GenomicPolymerase Mix，1μl稀釋了50倍的首輪PCR產(chǎn)物，36.8μl去離子水。PCR反應參數(shù)為(1)94℃25秒，72℃3分鐘，5個循環(huán)；(2)94℃25秒，67℃3分鐘，20個循環(huán)；(3)67℃保溫7分鐘。
4.序列測定及拼接第二輪PCR產(chǎn)物純化回收后連接到pGEM-T Easy載體(Promega)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5a，在含有IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選白色菌落并提取質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定。根據(jù)測序結果獲得的SaPIN2b基因啟動子序列見SEQ ID NO1。
通過對龍葵SaPIN2b基因進行RLM-5’RACE(RNAligase-mediated rapid amplification of 5’cDNA ends)分析，確定該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點。
按照Invitrogen公司的RLM-5’RACE分析試劑盒推薦步驟擴增SaPIN2b cDNA的5’端用TRIzol試劑(Invitrogen)從龍葵花芽中提取總RNA；提取的總RNA用小牛腸磷酸酶CIP處理除去5’磷酸；然后用煙草酸性焦磷酸酶(TAP)處理，去除全長mRNA的5′端帽子結構；接著將GeneRacerTMRNA寡聚接頭(5’-CGACUGGAGCACGA-GGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3’)連接到處理后的mRNA 5’端；以連好接頭的mRNA為模板，用2bGSP1引物在SuperscriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶催化下合成第一條cDNA鏈；以合成的cDNA鏈為模板，進行PCR擴增，50μl反應體系中包含5μl 10×PCR反應緩沖液，1μl dNTP(各10mM)，1μl 5’GeneRacerTM引物(5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’)，1μl 2bGSP2引物，1μl反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，0.5μl Ex Tag酶(TaKaRa)，40.5μl滅菌水。反應參數(shù)為(1)94℃，2分鐘，1個循環(huán)；(2)94℃30秒，62℃30秒，72℃80秒，35個循環(huán)；(3)72℃保溫10分鐘。擴增產(chǎn)物直接連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5a，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定后測序，確定SaPIN2b基因的轉(zhuǎn)錄起始位點為SEQID NO1的“+1”位點的核苷酸“A”。
用龍葵SaPIN2b基因啟動子-1430至-9共1422bp長片段與β-葡萄糖苷酸酶(GUS)報告基因嵌合，轉(zhuǎn)化煙草與龍葵，對所得到的轉(zhuǎn)基因植株T0代與T1代進行組織化學染色分析，確定此啟動子的表達模式，具體步驟如下。
1.雙元表達載體的構建將PCR擴增出來的1422bp長的SaPIN2b啟動子片段插入到pBI101.1的EcoRI和HindIII位點上，命名為pPBBS；用pPBBS轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5a，篩選出陽性克??；然后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌A.tumefaciens LBA4404。構建過程見圖1。
2.農(nóng)桿菌介導的煙草和龍葵轉(zhuǎn)化首先從平板接種農(nóng)桿菌單菌落于5ml YEB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50μg/ml，利福平50μg/ml，鏈霉素200μg/ml)，28℃下180rpm振蕩培養(yǎng)兩天；然后用液體再生培養(yǎng)基稀釋農(nóng)桿菌液至OD600約為0.2～0.3(約稀釋20倍)；將無菌的煙草和龍葵葉切至0.5cm2，放入稀釋的農(nóng)桿菌液中，輕搖5分鐘后取出用無菌濾紙吸干葉片表面的液體后，平展于再生固體培養(yǎng)基平板上，共培養(yǎng)2-3天；將共培養(yǎng)后的葉片外植體用MS液體培養(yǎng)基漂洗5次，然后置于濾紙上吸干，并轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基固體平板(卡那霉素100μg/ml，羧芐青霉素250μg/ml)上，28℃培養(yǎng)，每兩周換一次培養(yǎng)基；4至6周后，切下1～2cm的小芽轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)瓶中生根壯苗，生根培養(yǎng)基中含100μg/ml的卡那霉素及100μg/ml的羧芐青霉素。
3.組織化學染色分析取新鮮樣品置于X-gluc染色液
中，抽真空半個小時后37℃保溫過夜。用70％，80％，95％乙醇梯度脫色，直到除去葉綠素。脫色后的樣品在光學顯微鏡下觀察拍照或置于50％甘油中保存。
通過對煙草、龍葵轉(zhuǎn)基因植株T0代與T1代不同發(fā)育階段的不同部位進行染色分析，表明GUS報告基因特異性地在毛狀體中表達，在整個發(fā)育階段都是如此。這表明，1422bp長的SaPIN2b基因啟動子能驅(qū)使外源基因特異地在毛狀體中表達。染色結果見圖2。
UN3304~1.TXTSEQUENCE LISTING<110>中山大學<120>植物毛狀體特異表達的基因啟動子<130>
<160>2<170>
<210>1<211>1598<212>DNA<213>龍葵Solanum americanum<400>1ACCATAATAA TAATCTTACA CTTTTAAATT CTTTTGATCT ATAAATTTTT TCACTTCTAT-1509AAAAAAGAGT TACAATTATA GAATCTTATT CATCGACGAT CTCAACAACA TTGTCTCAAA-1449GTCTTCTTCA TCAATTTCGC CGTAACTTTG AATCAATTTT CAAATTTTCT TTGTCTTAAA-1389ATCTATTTTT TTAGAAGTTT TTTGTGATTT GAAGAACACA ACAATAATTG CTAAGTTATC-1329TCAAGTTTCT TATCTTCAAA ATATTTAACT TAGATTGTAA AGATATAATT CAACAGAAAA-1269AAATAACAAA AACAATAAAA ATAATTTACC GCACTAGAAC AAAATACATA TGTTATTTGA-1209AATAAAGCCT AAATTTCTAC AATAGCATAT TTGAGATACA GTATTTGTTT ACATTTGAAT-1149AGATATAGAA TTTATTATAG CATCAATTGT TGTGTTTTAA TAATTCTTTA TATATATATA-1089TATATATATA TAAAAAATTC TATTGATTGA CGTGATATAC ACGTGCAAAG CACGTACACT-1029AAACTAGTAA CTTATAAAAT ACCTGTAAAT TCTTTTTTAT TTTAGTTATT AGTTATTATT-969TTTCTTAAAT ATATACTTAG TTAGATGAAG TTTCATTGTA TAGTACTCCT ATTTATTCTA-909ACGGTTTAAA TGTTTTTAGA AAAGTCTCTC TCCCATATTA TTGTACGCTG CATCACTGCC-849TCAATTTTCT TCATATAGGT ATGGCGGTCC AATTTAGGCT GCCAAAAGTT TCTAATTGGG-789CCATCTGTTT AATTTACTAT TTGCAAAAAG TAATTTCTAT CCACTAAAAT TAGAGCATAT-729AAATCAAAAA TAAAATAAAA ATAAAAGCAA TGGGCAAATG GCAATTTTGT TCCTTGTATT-669ATTGGTTTAT TTTTATTTTC ATCTTTGTAT AATAGCTTTC AATTTATATA AATGTGTAAT-609TTTGATCCTC AAATTAATGG AAATTGAAAT TTTAAAGAAA TTATTAATTA AAAATAAATA-549AGAAAAGAGA AAAAGAAAAA TACATCCAAG GGTACTAAAT GCGCTTAAAG GGTCATATTT-489TTTAAAAAAA AATTCTATAT TTTATATTTA ACGATTGTGT TTAAATTTTT AAACGTTCGT-429TAGCGTGAAG AATCAAAATC GATCTTTTGT ATCAATGGTG GGTTAATTAT ACTTAATCGT-369ATCATATATA CCGGACCAAA AGTCCAAAAC TATAATAAAT TCTACTAACA TAAGGATTAA-309AATTGCAATT TCCCCTAAAG CTATATATTC AATAATTGAC TTCCAACTTA ATTATCACGT-249GGAGAAGAAA ATTGTTGGTA GATGACAATA ATTTCAAAAA ACAAGCAAGT CGTGGTCAGT-189ACAGCTTGCT ACGAAAAAGA AGAGGGAAGC GTAAGTACCT TGCCAAACTA GTTACACTAA-129AGTCCTTTTT ATCAATTAGA GGACATAAAT GTAATATTAA TGTGAAAAAA TAATTTTAGC-69TAGCTATCTT TTTTTATCAA TCGCGTTTGC TATAAATAAG ATGGACCTCC TTAACCAAAA-9AGAAAACAAG ATAACTAATC ACGATCGAGA AAGAATAA<210>2<211>1422<212>DNA<213>龍葵Solanum americanum<400>2gccgtaactt tgaatcaatt ttcaaatttt ctttgtctta aaatctattt ttttagaagt-1370tttttgtgat ttgaagaaca caacaataat tgctaagtta tctcaagttt cttatcttca-1310aaatatttaa cttagattgt aaagatataa ttcaacagaa aaaaataaca aaaacaataa-1250aaataattta ccgcactaga acaaaataca tatgttattt gaaataaagc ctaaatttct-1190acaatagcat atttgagata cagtatttgt ttacatttga atagatatag aatttattat-1130agcatcaatt gttgtgtttt aataattctt tatatatata tatatatata tataaaaaat-1070tctattgatt gacgtgatat acacgtgcaa agcacgtaca ctaaactagt aacttataaa-1010atacctgtaa attctttttt attttagtta ttagttatta tttttcttaa atatatactt-950agttagatga agtttcattg tatagtactc ctatttattc taacggttta aatgttttta-890gaaaagtctc tctcccatat tattgtacgc tgcatcactg cctcaatttt cttcatatag-830gtatggcggt ccaatttagg ctgccaaaag tttctaattg ggccatctgt ttaatttact-770atttgcaaaa agtaatttct atccactaaa attagagcat ataaatcaaa aataaaataa-710aaataaaagc aatgggcaaa tggcaatttt gttccttgta ttattggttt atttttattt-650tcatctttgt ataatagctt tcaatttata taaatgtgta attttgatcc tcaaattaat-590ggaaattgaa attttaaaga aattattaat taaaaataaa taagaaaaga gaaaaagaaa-530aatacatcca agggtactaa atgcgcttaa agggtcatat tttttaaaaa aaaattctat-470attttatatt taacgattgt gtttaaattt ttaaacgttc gttagcgtga agaatcaaaa-410tcgatctttt gtatcaatgg tgggttaatt atacttaatc gtatcatata taccggacca-350aaagtccaaa actataataa attctactaa cataaggatt aaaattgcaa tttcccctaa-290agctatatat tcaataattg acttccaact taattatcac gtggagaaga aaattgttgg-230tagatgacaa taatttcaaa aaacaagcaa gtcgtggtca gtacagcttg ctacgaaaaa-170gaagagggaa gcgtaagtac cttgccaaac tagttacact aaagtccttt ttatcaatta-110
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權利要求
1.一種新克隆的蛋白酶抑制劑基因啟動子，其特征在于具有核苷酸-1568至+30的1598bp的序列，如SEQ ID NO1所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的蛋白酶抑制劑基因啟動子，其特征在于-1430至-9的1422bp核苷酸序列足以驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的毛狀體中特異表達，其序列如SEQ ID NO2所示。
3.一種含有權利要求1或2所述的核苷酸序列與所需的目的基因的編碼區(qū)核苷酸序列連接后產(chǎn)生的基因的重組質(zhì)粒。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于能在植物毛狀體中特異表達。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組質(zhì)粒，它是pPBBS。
6.一種重組微生物，其特征在于該微生物是由權利要求4或5所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物得到的。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組微生物，其特征在于其原始微生物菌種是埃希氏大腸桿菌DH5α。
8.根據(jù)權利要求6所述的重組微生物，其特征在于其原始菌種是土壤根癌農(nóng)桿菌LBA4404。
9.權利要求7或8所述的重組微生物在轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
10.權利要求3所述的重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物毛狀體特異表達的基因啟動子。本發(fā)明提供了采用基因組DNA步移法克隆的毛狀體特異性龍葵蛋白酶抑制劑(SaPIN2b)基因啟動子的序列；用5’cDNA末端快速擴增法確定了SaPIN2b轉(zhuǎn)錄起始位點；用包含所述SaPIN2b啟動子的DNA序列與β－葡萄糖苷酸酶(GUS)報告基因融合構建植物表達載體；用所產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化煙草與龍葵，對所獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，表明GUS報告基因在毛狀體中特異地表達。
文檔編號C12N15/29GK1657621SQ20041007771
公開日2005年8月24日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權日2004年12月29日
發(fā)明者徐增富, 劉進, 鄧宇歌, 黃小樂 申請人:中山大學