專利名稱：基因重組畢赤酵母生產(chǎn)蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組畢赤酵母生產(chǎn)中性蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶類，中性蛋白酶是指其最適作用pH為6.0～7.5的一類蛋白酶，其主要作用為皮革脫毛、毛皮軟化、制蛋白胨、酵母膏、肝寧及用于食品工業(yè)等。
中性蛋白酶的研究開發(fā)工作自上世紀七十年代就已開始，國內(nèi)外都于上世紀八十年代初實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，生產(chǎn)的菌種中固體發(fā)酵大都采用曲霉，其中主要為棲土曲霉和米曲霉。而液體發(fā)酵大都采用細菌，其中以枯草桿菌、液化淀粉芽孢桿菌及臘狀芽孢桿菌產(chǎn)量較高。液體發(fā)酵也有采用放線菌進行生產(chǎn)的。目前我國生產(chǎn)中性蛋白酶主要采用棲土曲霉、枯草芽孢桿菌，但中性蛋白酶發(fā)酵單位一直很低，發(fā)酵不穩(wěn)定，易受噬菌體和酵母的污染。因此國內(nèi)外科技工作者一直致力于中性蛋白酶生產(chǎn)菌及生產(chǎn)工藝的改進。自上世紀八十年代，國內(nèi)外科技工作者在相關(guān)領(lǐng)域主要做了以下幾方面工作①篩選耐噬菌體污染菌。
云南大學劉士清等人通過大量的誘變處理及抗噬菌體突變體的篩選工作，得到了抗噬菌體的突變體，該突變體具有較強的抗噬菌體的能力，目前噬菌體污染這一問題已基本上得到解決。
②通過傳統(tǒng)的誘變技術(shù)篩選高產(chǎn)菌株。
工業(yè)上用來生產(chǎn)中性蛋白酶的高產(chǎn)菌株，大多數(shù)都是通過誘變后篩選得到的突變株。劉白玲等經(jīng)過物理和化學復合誘變后，得到中性蛋白酶活性高于B.subtilis AS1.39830％以上的正突變株。李永泉等人采用激光誘變技術(shù)，使中性蛋白酶產(chǎn)生菌發(fā)酵單位達到8200單位/每毫升發(fā)酵液。刑臺酶制劑廠采用溫刺法及劉士清等[10]采用DES誘變結(jié)合熱處理使菌株中性蛋白酶發(fā)酵單位分別達到8000和12000單位/毫升發(fā)酵液。中國人民解放軍獸醫(yī)大學利用衛(wèi)星搭載蛋白酶生產(chǎn)菌，通過空間誘變育種使中性蛋白酶活性提高1～3倍。但是，由于誘變通常會導致兩種蛋白酶(中性和堿性蛋白酶)的同時高產(chǎn)，因此就需要尋找更為有效的提高中性蛋白酶產(chǎn)量的方法。
③采用基因工程手段以提高中性蛋白酶的發(fā)酵單位。
隨著分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用，中性蛋白酶的分子生物學研究逐步興起，至今已經(jīng)克隆出多種不同微生物來源的中性蛋白酶基因，并在細菌及酵母等各種宿主菌中得到了表達。目前，商業(yè)上所用的中性蛋白酶大部分來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)，據(jù)統(tǒng)計，早在1980年，僅芽孢桿菌中蛋白酶就已占了商品酶總產(chǎn)量的38％。因此，采用生物技術(shù)大幅度地提高芽孢桿菌中性蛋白酶的產(chǎn)量，一直以來都是基因工程研究領(lǐng)域的重要課題之一。
自上個世紀八十年代以來，為使中性蛋白酶基因獲得高效表達，來自包括枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)和淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)等在內(nèi)的十多種芽孢桿菌屬中性蛋白酶基因在B.subtilis中得到表達。1983年，F(xiàn)ujii等將從B.stearothermophilus CU21中克隆得到的中性蛋白酶基因轉(zhuǎn)入同種菌的另一菌株MD-3中進行表達，中性蛋白酶的產(chǎn)量比供體菌提高了15倍。1984年，Maria等從B.subtilis中克隆出中性蛋白酶基因(nprE)，通過高拷貝質(zhì)粒將其轉(zhuǎn)入B.subtilis BG84中表達，中性蛋白酶活性達3000U/ml。1991年，楊慶云等用鳥槍法克隆得到B.stearothermophilus313-1的中性蛋白酶基因，該基因在B.subtilis中的表達量比供體菌株提高了約30倍。華東理工大學王麗影等人從枯草桿菌中克隆出蛋白酶基因，然后克隆入B.subtilis中進行表達，并結(jié)合補料分批發(fā)酵工藝，使發(fā)酵單位達13000單位/每毫升發(fā)酵液。
由于B.subtilis具有無致病性和可將表達的各種蛋白酶分泌到細胞外等特點，因此，目前中性蛋白酶基因的克隆一般都以B.subtilis作為宿主菌，除此之外，也有用大腸桿菌和酵母菌作為受體菌來表達中性蛋白酶基因的。但據(jù)文獻報道，一般重組的中性蛋白酶基因在大腸桿菌中的表達量要比在供體菌中低，即便是有所提高，其表達的蛋白也難以分泌到培養(yǎng)基中，而是積累在細胞質(zhì)或周質(zhì)腔內(nèi)。1993年，Lin-Fa Wang等人將B.subtilis中的完整中性蛋白酶基因(nprE)首次轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisine)中進行異源表達。但是，表達的蛋白質(zhì)未能分泌至胞外，而是以蛋白酶前體的形式累積在胞內(nèi)，當把酵母轉(zhuǎn)化酶的信號肽序列整合到成熟nprE上游時，中性蛋白酶分泌到胞外，然而，表達產(chǎn)物由于高度糖基化而無生物學活性。從以上這些報道中可以看出，中性蛋白酶的總體表達水平不高，但同時也證實了利用基因工程手段來提高中性蛋白酶表達水平的有效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基因重組畢赤酵母生產(chǎn)中性蛋白酶的方法。它是從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus 168)中分離出中性蛋白酶基因，成功實現(xiàn)中性蛋白酶基因在真核表達系統(tǒng)畢赤酵母中的高效表達。
本發(fā)明是從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus 168)中分離出中性蛋白酶基因，在真核表達系統(tǒng)畢赤酵母中高效表達。
本發(fā)明的具體方法和步驟1、工程菌的構(gòu)建采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法，從Bacillus subtilus 168中克隆出編碼中性蛋白酶基因的全序列，然后克隆入畢赤酵母表達載體PGAP得到重組子，重組子分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達宿主GS115，SMD1168。然后分別篩選出高效表達轉(zhuǎn)化子GSp5和SMDp18，轉(zhuǎn)化子為組成型表達，在普通葡萄糖培養(yǎng)基中就能產(chǎn)生中性蛋白酶。
所克隆出任何基因片斷具備編碼下列氨基酸序列MGLGKKLSVRVAASFMSLSISLPGVQAAEGHQLKENQTNFLSKKPIAQSELSAPNDKAVKQFLKKNSNIFKGDPSKSVKLVESTTDALGYKHFRYAPVVNGVPIKDSQVIVHVDKSDNVYAVNGELHNQSAAKTDNSQKVSSEKALALAFKAIGKSPDAVSNGAAKNSNKAELKAIETKDGSYRLAYDVTIRYVEPEPANWEVLVDAETGSILKQQNKVEHAAATGSGTTLKGATVPLNISYEGGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNRQSRLPGTLVSSTTKTFTSSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYSNFKRNSYDNKGSKIVSSVHYGTQYNNAAWTGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSLDVTAHEMTHGVTQETANLIYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYNQPDNYANYRNLPNTDEGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKLGVSKSQQIYYRALTTYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSTDAAKVEAAWNAVGL2、采用上述基因工程菌通過搖瓶生產(chǎn)中性蛋白酶從平板上取少量菌接種于YEPD培養(yǎng)基[1％酵母粉、2％蛋白胨、2％甘油(或葡萄糖)]，30℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)四天后，經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分離去除細胞，得到含中性蛋白酶的上清液。然后進行發(fā)酵液酶活和酶學性質(zhì)的檢測。
3、酶活測定方法和粗酶酶學性質(zhì)(1)酶活測定方法①原理蛋白酶在一定的條件下，水解酪素底物，生成含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在堿性條件下將福林試劑還原，生成鉬藍和鎢藍，故可在680nm的波長下進行比色，計算酶活力。
②酶反應(yīng)體系1ml適當稀釋的發(fā)酵液，1ml溶于pH7.5，0.02mol/L磷酸緩沖液中的1％酪素溶液，40℃反應(yīng)10min，生成的酪氨酸采用福林法測定。
③酶活定義在上述條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活單位。
(2)粗酶酶學性質(zhì)①酶作用的最適pH見表1和圖1表1.酶作用的最適pH

②pH對酶穩(wěn)定性的影響見表2和圖2
表2.pH對酶穩(wěn)定性的影響

③酶作用的最適溫度見表3和圖3表3.酶作用的最適溫度

④溫度對酶穩(wěn)定性的影響見表4和圖4
表4.溫度對酶穩(wěn)定性的影響

也可使用不同的培養(yǎng)方法、不同的提取方法得到。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的有益效果巴斯德畢赤氏酵母是真核基因新型表達系統(tǒng)。這個系統(tǒng)有著獨特的優(yōu)點，潛力很大，利用其表達外源蛋白具有下列優(yōu)點(1)高表達。由于表達載體利用醇氧化酶基因啟動子很強，細胞生長速度很快，所以該表達系統(tǒng)表達的外源蛋白產(chǎn)量很高。例如破傷風毒素蛋白的產(chǎn)量達12g/L，而目前常用的表達系統(tǒng)一般在毫克級。所以其表達量比其它系統(tǒng)高10倍甚至100倍，這在表達量方面是一大突破。(2)高穩(wěn)定。由于該系統(tǒng)的表達載體不是以自主復制的質(zhì)粒形式存在，而是整合在染色體上，所以構(gòu)建的菌株十分穩(wěn)定。(3)高分泌。將釀酒酵母中的一些信號系列和先導序列用于該表達系統(tǒng)，加之它自身的生物學特性，其分泌表達可達10g/L，這在已知的分泌表達系統(tǒng)中是十分少見的。鑒于該表達系統(tǒng)具大潛力，因此該表達系統(tǒng)對于新型酶種的開發(fā)具有重大意義。
巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)本身不能合成枯草桿菌蛋白酶，本發(fā)明通過基因工程的手段，在巴斯德畢赤氏酵母中導入枯草桿菌中性蛋白酶基因，使巴斯德畢赤氏酵母大量產(chǎn)生枯草桿菌中性蛋白酶，由于巴斯德畢赤氏酵母非常容易實現(xiàn)高密度發(fā)酵，具有高分泌的特點，因此很容易實現(xiàn)工業(yè)化大量廉價生產(chǎn)枯草桿菌中性蛋白酶。


圖1是本發(fā)明的酶作用的最適pH。
圖2是本發(fā)明的pH對酶穩(wěn)定性的影響。
圖3是本發(fā)明的酶作用的最適溫度。
圖4.是本發(fā)明的溫度對酶穩(wěn)定性的影響。
具體實施例方式
實施例按以下方法制取中性蛋白酶1、工程菌的構(gòu)建采用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法，從Bacillus subtilus 168中克隆出編碼中性蛋白酶基因的全序列，然后克隆入畢赤酵母表達載體PGAP得到重組子，重組子分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達宿主GS115，SMD1168，然后分別篩選出組成型高效表達轉(zhuǎn)化子(GSp5和SMDp18)(在普通葡萄糖培養(yǎng)基中就能產(chǎn)生中性蛋白酶)。從Bacillus subtilus 168中所克隆出的基因片斷具備編碼下列氨基酸序列MGLGKKLSVRVAASFMSLSISLPGVQAAEGHQLKENQTNFLSKKPIAQSELSAPNDKAVKQFLKKNSNIFKGDPSKSVKLVESTTDALGYKHFRYAPVVNGVPIKDSQVIVHVDKSDNVYAVNGELHNQSAAKTDNSQKVSSEKALALAFKAIGKSPDAVSNGAAKNSNKAELKAIETKDGSYRLAYDVTIRYVEPEPANWEVLVDAETGSILKQQNKVEHAAATGSGTTLKGATVPLNISYEGGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNRQSRLPGTLVSSTTKTFTSSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYSNFKRNSYDNKGSKIVSSVHYGTQYNNAAWTGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSLDVTAHEMTHGVTQETANLIYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYNQPDNYANYRNLPNTDEGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKLGVSKSQQIYYRALTTYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSTDAAKVEAAWNAVGL2、采用上述基因工程菌通過搖瓶生產(chǎn)中性蛋白酶從平板上取少量菌接種于YEPD培養(yǎng)基(現(xiàn)有技術(shù))中，培養(yǎng)基的組成是1％酵母粉、2％蛋白胨、2％甘油(或葡萄糖)；在該培養(yǎng)基中30℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)四天后，經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分離去除細胞，得到含中性蛋白酶的上清液。然后進行發(fā)酵液酶活和酶學性質(zhì)的檢測。
權(quán)利要求
1.一種基因重組畢赤酵母生產(chǎn)中性蛋白酶的方法，其特征在于采用巴斯德畢赤氏酵母生產(chǎn)中性蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組畢赤酵母生產(chǎn)中性蛋白酶的方法，其特征在于采用多聚酶鏈反應(yīng)的方法，從Bacillus subtilus 168中克隆出編碼中性蛋白酶基因的全序列，然后克隆入畢赤酵母表達載體PGAP得到重組子，重組子分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達宿主GS115，SMD1168，然后分別篩選出組成型的高效表達轉(zhuǎn)化子，得基因工程菌GSp5和SMDp18，該菌在普通葡萄糖培養(yǎng)基中就能產(chǎn)生中性蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組畢赤酵母生產(chǎn)中性蛋白酶的方法，其特征在于采用基因工程菌在普通葡萄糖培養(yǎng)基中，30℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)四天后，經(jīng)5000轉(zhuǎn)/分離去除細胞，得到含中性蛋白酶的上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組畢赤酵母生產(chǎn)中性蛋白酶的方法，其特征在于所克隆出任何基因片斷具備編碼下列氨基酸序列MGLGKKLSVRVAASFMSLSISLPGVQAAEGHQLKENQTNFLSKKPIAQSELSAPNDKAVKQFLKKNSNIFKGDPSKSVKLVESTTDALGYKHFRYAPVVNGVPIKDSQVIVHVDKSDNVYAVNGELHNQSAAKTDNSQKVSSEKALALAFKAIGKSPDAVSNGAAKNSNKAELKAIETKDGSYRLAYDVTIRYVEPEPANWEVLVDAETGSILKQQNKVEHAAATGSGTTLKGATVPLNISYEGGKYVLRDLSKPTGTQIITYDLQNRQSRLPGTLVSSTTKTFTSSSQRAAVDAHYNLGKVYDYFYSNFKRNSYDNKGSKIVSSVHYGTQYNNAAWTGDQMIYGDGDGSFFSPLSGSLDVTAHEMTHGVTQETANLIYENQPGALNESFSDVFGYFNDTEDWDIGEDITVSQPALRSLSNPTKYNQPDNYANYRNLPNTDEGDYGGVHTNSGIPNKAAYNTITKLGVSKSQQIYYRALTTYLTPSSTFKDAKAALIQSARDLYGSTDAAKVEAAWNAVGL
全文摘要
本發(fā)明是一種基因重組畢赤酵母生產(chǎn)中性蛋白酶的方法。其特征在于采用巴斯德畢赤氏酵母生產(chǎn)中性蛋白酶。利用巴斯德畢赤氏酵母表達外源蛋白具有高表達、高穩(wěn)定、高分泌的優(yōu)點。由于巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)本身不能合成枯草桿菌蛋白酶，本發(fā)明通過基因工程的手段，在巴斯德畢赤氏酵母中導入枯草桿菌中性蛋白酶基因，使巴斯德畢赤氏酵母大量產(chǎn)生枯草桿菌中性蛋白酶，由于巴斯德畢赤氏酵母非常容易實現(xiàn)高密度發(fā)酵，具有高分泌的特點，因此很容易實現(xiàn)工業(yè)化大量廉價生產(chǎn)枯草桿菌中性蛋白酶。
文檔編號C12N9/60GK1778908SQ20041007958
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日
發(fā)明者黃遵錫, 許波, 唐湘華 申請人:云南師范大學