專利名稱：從有機體制備發(fā)酵產(chǎn)品的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從有機體制備發(fā)酵產(chǎn)品的方法，其中所述的有機體首先在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于形成發(fā)酵產(chǎn)品，隨后在裂解促進化合物的存在下進行裂解處理。
這樣的方法是眾所周知的。盡管在很多情況中的目的是通過有機體將發(fā)酵產(chǎn)品分泌在培養(yǎng)基中，但是這不總是切實可行的或所希望的。在這些情況中，必須進行有機體的裂解。這是機械進行的，例如通過壓力下降、剪切或在硬顆粒的存在下研磨。為了促進裂解，可能存在裂解促進化合物。Harrison，T.L.等人(Bioseparation 2第95-105頁)描述了氫氧化鈉、SDS、溶菌酶和EDTA的使用。
加入這種化合物必然增加成本，并且?guī)缀醪荒苤貜褪褂谩?br> 本發(fā)明的目的是提供一種改善，由此降低發(fā)酵產(chǎn)品的成本。
為此，根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于所述的裂解促進劑是可被有機體代謝的化合物，該方法包括下列步驟a)在第一相對高濃度的裂解促進化合物下裂解所述的有機體，b)分離裂解促進劑和發(fā)酵產(chǎn)品，并且c)在第二相對低濃度的可代謝的裂解促進劑下培養(yǎng)該有機體。
因此，在所述的裂解促進化合物發(fā)揮其作用之后可以用于形成另外的發(fā)酵產(chǎn)品。本發(fā)明尤其適用于選自細菌，特別是革蘭氏陰性細菌以及酵母和真菌的有機體。
所述的裂解處理優(yōu)選是機械裂解處理。
根據(jù)本發(fā)明方法的處理避免了另外的化學裂解處理中的化學制品的引入。
本發(fā)明的一個實施方案，發(fā)酵產(chǎn)品與一部分分離，所述部分除了可代謝的裂解促進化合物外含有有機體的其它細胞組分，并且該組分用于步驟c用于培養(yǎng)有機體。
通過該方法，其它細胞組分，如細胞蛋白質(zhì)等，可以用于形成另外的發(fā)酵產(chǎn)品，至少對于那些能代謝所述其它細胞組分的有機體。這特別適用于多種細菌。
根據(jù)重要的實施方案，可代謝的裂解促進化合物是銨類化合物。
當使用銨化合物時，可以通過蒸發(fā)(例如降低壓力下)將氨從發(fā)酵產(chǎn)品中分離。許多有機體可以使用氨作為氮源。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，可代謝的裂解促進化合物是氫氧化銨。
當從發(fā)酵產(chǎn)品中分離氫氧化銨時，沒有殘留物。
優(yōu)選通過注入氣體將氨從進行裂解的發(fā)酵產(chǎn)品中去除。
所述的氣體優(yōu)選用于培養(yǎng)有機體的氣體，有利的氣體或可能的氣體包括來自發(fā)酵的二氧化碳。
將通過以下的例證性實施方案來闡明本發(fā)明，其中

圖1顯示了使用本發(fā)明方法的第一個試驗的結(jié)果。
圖2顯示了使用本發(fā)明方法的第二個試驗的結(jié)果。
實施例證明由于添加劑引起的細胞衰弱的試驗發(fā)酵根據(jù)Weusthuis等人(參考文獻1)的方法，在10升的補料分批培養(yǎng)發(fā)酵罐中的8升培養(yǎng)基中在30℃下培養(yǎng)惡臭假單胞菌KT2442(Pseudomonas putida KT2442)。在發(fā)酵期間，使用25％體積/體積的氫氧化銨溶液維持pH在7。培養(yǎng)中的碳源由獲自椰子油的游離脂肪酸(Vereenigde Oliefrabrieken，Rotterdam，Nether lands)組成，濃度為每升培養(yǎng)基0.4％體積/體積，每升培養(yǎng)基產(chǎn)生131g干細菌物質(zhì)。該碳源使得該有機體聚積多羥基鏈烷酸酯包函體。發(fā)酵后，該糊狀物(batter)在4-8℃下最多保存3個月。
細胞破裂使用磁力攪拌器將250ml的惡臭假單胞菌KT2442的發(fā)酵糊狀物攪拌1小時。隨后使用25％體積/體積的氫氧化銨溶液將預處理的所需pH升至pH＝11。還使用未用氫氧化銨溶液處理的發(fā)酵糊狀物作為參照測量。調(diào)整pH后使用磁力攪拌器攪拌混合物30分鐘，然后用具有10ml室體積的勻漿器(Constant Cell Disruption Systems，Low March，Leerdam，the Netherlands)勻漿。將勻漿器在10℃下操作，欲被勻漿的混合物在勻漿過程之間冷卻。勻漿過程的數(shù)目為0-5，在一個過程中的勻漿壓力的作用確定為1.0、1.3、1.6或2.2kbar。
檢測細胞破裂效果的試驗勻漿的樣品在30,000×g下離心3小時以使包函體(密度大約1,000kg/m3)保留在上清中并沉淀其余的細胞殘余物(密度大約1,085kg/m3)。離心后，通過玻璃Pasteur移液管分離沉淀和上清。將兩相都凍干48小時，然后稱重干物質(zhì)，并根據(jù)De Rijk等人(參考文獻2)的方法通過氣相色譜確定包函體的含量。根據(jù)該分析，確定了上清中包函體的總量(游離的包函體)以及沉淀中包函體的總量(非游離的包函體)。這兩個值的比是細胞破裂效果的衡量值。
結(jié)果1.壓力對細胞破裂的影響通過不同壓力和用與不用氫氧化銨預處理的勻漿階段的勻漿的細胞破裂的效果通過測量從細胞釋放的包函體的部分進行檢測。在圖1中，檢測勻漿壓力和游離的包函體部分之間的關系的結(jié)果反應了用和不用氫氧化銨預處理的發(fā)酵糊狀物(batter)。更具體而言，圖1顯示了與未用氫氧化銨進行處理的細胞相比，用pH11的氫氧化銨處理保證了在相同的勻漿條件下，更多的包函體從細胞中釋放。
2.勻漿步驟的數(shù)量(N)對細胞破裂的影響通過測量從細胞釋放的包函體的部分再次測定通過在常壓和有和沒有氫氧化銨預處理的不同勻漿步驟的勻漿的細胞破裂的效果。結(jié)果示于圖2中。
數(shù)據(jù)再次表明與沒有預處理的勻漿相比，用pH11的氫氧化銨處理促進了包函體的釋放。
甚至在0(N)代，用pH11的氫氧化銨處理釋放一部分包函體到上清液中。該現(xiàn)象僅在已經(jīng)在4-8℃下保存一段時間的細胞中發(fā)生。在該情形中，細胞在進行試驗前已經(jīng)保存了9周。這沒有削弱引人注意的氫氧化銨處理使細胞衰弱的事實，因為未處理的細胞也已經(jīng)保存了9周。
結(jié)論勻漿試驗表明利用氫氧化銨處理細胞在勻漿作用的幫助下促進了包函體的釋放，因此使細胞更有效的破裂。
參考文獻1.Weusthuis，R.A.等，(2001)Biopolymers 3aPolyestersIBiological Systems and Biotechnological Production，Wiley-VCH，pp291-316.
2.De Rijk，T.C.等，(2001)Biopolymers 3bPolyesters IIProperties and Chemical Synthesis，Wiley-VCH，pp1.
權利要求
1.用于從有機體制備發(fā)酵產(chǎn)品的方法，其中所述的有機體首先在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于形成發(fā)酵產(chǎn)品，然后在裂解促進化合物的存在下進行裂解處理，特征在于所述的裂解促進劑是能被該有機體代謝的化合物，該方法包括下列步驟a)在第一相對高濃度的裂解促進化合物下裂解所述的有機體，b)分離裂解促進劑和發(fā)酵產(chǎn)品，并且c)在第二相對低濃度的可代謝的裂解促進劑下培養(yǎng)該有機體。
2.權利要求1的方法，特征在于所述的裂解處理是機械裂解處理。
3.權利要求1或2的方法，特征在于所述的發(fā)酵產(chǎn)品與一部分分離，所述的部分除了可代謝的裂解促進化合物外含有有機體其它細胞組分，并且所述的部分用于步驟c用于培養(yǎng)有機體。
4.前述權利要求任一項中的方法，特征在于所述的可代謝的裂解促進化合物是銨類化合物。
5.前述權利要求任一項中的方法，特征在于所述的可代謝的裂解促進化合物是氫氧化銨。
6.前述權利要求任一項中的方法，特征在于通過注入氣體使氨從進行裂解的發(fā)酵產(chǎn)品中去除。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從有機體制備發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述的有機體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中該有機體在形成發(fā)酵產(chǎn)品后在裂解促進化合物的存在下進行裂解處理。根據(jù)本發(fā)明，該裂解促進劑是能被有機體代謝的化合物，該方法包括下列步驟在第一相對高濃度的裂解促進化合物下處理該有機體，分離該裂解促進劑和發(fā)酵產(chǎn)品，并在第二相對低濃度的該可代謝裂解促進劑下培養(yǎng)該有機體。
文檔編號C12P1/00GK1690213SQ20041008174
公開日2005年11月2日 申請日期2004年12月28日 優(yōu)先權日2003年12月30日
發(fā)明者P·范赫, L·A·M·范德威倫, R·G·J·M·范德蘭斯 申請人:代爾夫特工業(yè)大學